第六章體外標記免疫分析詳解

第六章體外標記免疫分析詳解演示文稿當前第1頁\共有64頁\編于星期三\10點優(yōu)選第六章體外標記免疫分析當前第2頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記在核醫(yī)學(xué)中的地位體內(nèi)診斷：臟器顯像

功能測定診斷

體外診斷：放射分析臨床核醫(yī)學(xué)治療：131I治療甲亢核醫(yī)學(xué)實驗核醫(yī)學(xué)：利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物質(zhì)變化規(guī)律當前第3頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析

體外標記免疫分析是一門綜合性學(xué)科，也是一門邊緣學(xué)科。是集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實驗醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科。在當前的各種免疫診斷技術(shù)中，標記免疫分析是最活躍、發(fā)展最快的一個領(lǐng)域。當前第4頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析概念：

是利用放射分析方法或其派生的相關(guān)非放射分析技術(shù)測定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量的一類分析方法。當前第5頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析特點：

利用抗原－抗體結(jié)合反應(yīng)的特異性，加上各種標記物（標記抗原或抗體）的可測量性來達到方便敏感地檢測各種體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)，包括內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等。當前第6頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析鼻祖:

(Yalow,July19,1921–)

美國科學(xué)家Yalow和Berson。于1956年創(chuàng)建的放射免疫分析(RIA)，測定人血漿胰島素獲得成功。樹立了超微量物質(zhì)體外標記免疫分析的里程碑。1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。當前第7頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析獲獎:在1977年Yalow和Berson因創(chuàng)建了放射免疫分析，使微量物質(zhì)的測定成為可能，而榮獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。當前第8頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析貢獻:

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，在RIA標記抗原競爭性抑制結(jié)合、IRMA標記抗體非競爭性結(jié)合的理論基礎(chǔ)上，相繼派生出許多其它的標記免疫分析方法，如酶標記免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等多種形式、多種反應(yīng)模式的綜合性標記免疫分析體系，并廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、教學(xué)及科研諸多領(lǐng)域，有力地推動了醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。當前第9頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析

發(fā)展:

電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光標記免疫分析

時間分辨熒光免疫分析酶標記免疫分析

放射受體分析

免疫放射分析

放射免疫分析當前第10頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析競爭放射結(jié)合分析：標記抗原，抗體限量非競爭放射結(jié)合分析：標記抗體，抗體過量分類當前第11頁\共有64頁\編于星期三\10點第一節(jié)體外標記免疫分析的基本原理當前第12頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析基本原理:非競爭性(標記抗體)IRMA體外標記免疫分析競爭性(標記抗原)RIA當前第13頁\共有64頁\編于星期三\10點放射免疫分析（RIA）原理放射免疫技術(shù)是標記抗原與未標抗原競爭有限量的抗體，然后通過測定標記抗原抗體復(fù)合物中放射性強度的改變，測定出未標記抗原量。當前第14頁\共有64頁\編于星期三\10點放射免疫分析（RIA）原理

Ag待測抗原+*Ag+Ab*AgAb+*Ag(標記抗原)(特異性抗體)(標記抗原抗體復(fù)合物)(游離的標記抗原)

AgAb+Ag

抗原抗體復(fù)合物放射免疫分析（RIA）原理標記抗原(*Ag)和非標記原(Ag)與限量抗體(Ab)競爭結(jié)合。*Ag和Ag具有相同的與Ab結(jié)合的能力當前第15頁\共有64頁\編于星期三\10點RIA(競爭結(jié)合反應(yīng))原理示意圖AgAg*AbCFAg*BFB/F１.*Ag:定量、足量２.Ab:限量、特異３.*Ag和Ag具有相同的免疫活性４.Ag+*Ag>Ab的有效結(jié)合位點５.*Ag和Ag通過競爭的方式與Ab結(jié)合，隨著Ag增加，*Ag與Ab結(jié)合形成的*AgAb復(fù)合物的量減少當前第16頁\共有64頁\編于星期三\10點放射免疫分析（RIA）實驗操作步驟：加樣（Ag，*Ag，Ab)→混勻，溫育（反應(yīng)達到平衡）→分離→測量→數(shù)據(jù)處理，質(zhì)量控制當前第17頁\共有64頁\編于星期三\10點測量測量復(fù)合物計數(shù)示意圖：

光子(射線能)與閃爍體的作用↓閃爍體(光脈沖、光能)↓光電倍增管(電能)↓前置放大器(電脈沖)↓電子探測儀

（計數(shù)單位是探測器輸出的電脈沖數(shù)，CPM或CPS）當前第18頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第19頁\共有64頁\編于星期三\10點RIA(競爭性結(jié)合)標準品劑量反應(yīng)曲線依所測得的復(fù)合物的放射性計數(shù)(CPM)，對比標準品劑量反應(yīng)曲線，求知待測品的含量當前第20頁\共有64頁\編于星期三\10點免疫放射分析(IRMA)原理單位點：

Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*Ab抗原（待測）標記抗體抗原標記抗體復(fù)合物雙位點：Ad-Ag+*AbAd-Ag-*Ab

固體抗體-抗原（待測）標記抗體固體抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物當前第21頁\共有64頁\編于星期三\10點IRMA(非竟爭結(jié)合)反應(yīng)原理當前第22頁\共有64頁\編于星期三\10點IRMA(非竟爭結(jié)合)劑量反應(yīng)曲線當前第23頁\共有64頁\編于星期三\10點RIA＆IRMA的區(qū)別方法RIAIRMA1.標記*Ag*Ab2.免疫反應(yīng)式Ag+*Ag+Ab

*Ag-Ab+AgAg+*AbAg-*Ab+*Ab3.Ab限量過量4.競爭競爭非競爭5.測量復(fù)合物*Ag-AbAg-*Ab6.測量物計數(shù)值與標本含量呈反比呈正比7.標準曲線形態(tài)╲╱8.靈敏度較低高9.測量范圍較窄較寬當前第24頁\共有64頁\編于星期三\10點第二節(jié)體外標記免疫分析的基本試劑和基本技術(shù)當前第25頁\共有64頁\編于星期三\10點基本試劑和基本技術(shù)１.標準品、質(zhì)控品２.特異性抗體３.示蹤劑(標記品)４.分離技術(shù)當前第26頁\共有64頁\編于星期三\10點１.標準品(1)化學(xué)結(jié)構(gòu):應(yīng)與待測物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)(2)化學(xué)純度：高度純化(3)化學(xué)度量：準確(4)穩(wěn)定性：不易變質(zhì)、不易降解當前第27頁\共有64頁\編于星期三\10點２.特異性抗體(1)親和力大(2)高滴度(3)特異性強(4)可長期保存當前第28頁\共有64頁\編于星期三\10點３.示蹤劑（標記品）

（1）高比活度（2）生物活性與免疫活性與標記前一致（3）化學(xué)純度>95%（4）穩(wěn)定性好：標記品不易脫落當前第29頁\共有64頁\編于星期三\10點４.分離技術(shù)---要求(1)結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開(2)非特異性結(jié)合率（NSB%）低，小于5%(3)分離的成分便于測量(4)分離效果不受外界環(huán)境影響(5)分離試劑操作簡便、價廉易得當前第30頁\共有64頁\編于星期三\10點微孔濾膜法鹽析法活性炭吸附法磁化顆粒法雙抗體法固相分離法分離方法當前第31頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第32頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第33頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第34頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第35頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第36頁\共有64頁\編于星期三\10點當前第37頁\共有64頁\編于星期三\10點

第三節(jié)體外標記免疫分析的類型當前第38頁\共有64頁\編于星期三\10點體外標記免疫分析的類型體外標記免疫分析放射性核素標記免疫分析(RIA、IRMA)酶標記免疫分析發(fā)光標記免疫分析(化學(xué)發(fā)光標記免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析)時間分辯熒光免疫分析當前第39頁\共有64頁\編于星期三\10點放射性核素標記免疫分析概念：一種將放射性核素測量的高靈敏性、高精確性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的體外測定超微量（10-9～10-15g）物質(zhì)的新技術(shù)。當前第40頁\共有64頁\編于星期三\10點放射性核素標記免疫分析分類:競爭性(標記抗原,抗體限量)RIA非競爭性(標記抗體,抗體過量)IRMA放射性核素標記當前第41頁\共有64頁\編于星期三\10點放射性核素標記免疫分析

優(yōu)缺點：

自1959年Yalow和Berson創(chuàng)建的放射免疫分析（RIA）具有靈敏度高、特異性強、簡便實用、成本低廉等優(yōu)點。為生物醫(yī)學(xué)的微量物質(zhì)分析開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。發(fā)展到目前為止由此衍生出了各種各樣的標記免疫分析技術(shù)。雖然RIA仍有較廣泛的使用市場和價值，但其方法學(xué)上固有的弱點使發(fā)展受到一定限制。如必須使用放射性同位素作為標記物，存在人為的因素影響較大、輻射防護及防止污染的問題，試劑盒使用時間短，可測量范圍相對較窄，難以實現(xiàn)操作及測量的自動化等。當前第42頁\共有64頁\編于星期三\10點酶標記免疫分析（EIA）概念：是應(yīng)用酶標記抗體（抗原）與抗原（抗體）產(chǎn)生特異性反應(yīng)，根據(jù)酶對底物的顯色反應(yīng)而定量分析待測抗原或抗體含量。分類:均相EIA：酶增強免疫分析（EMIT）非均相EIA:酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELASA）當前第43頁\共有64頁\編于星期三\10點時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)概念：是應(yīng)用鑭系元素標記抗原或抗體，利用紫外線或激光使其發(fā)射熒光，結(jié)合波長和時間兩種分辨技術(shù)的微量分析方法。常用鑭系元素：銪、鋱、釤、鏑特點：分析范圍寬靈敏度高專一度高穩(wěn)定性強1234當前第44頁\共有64頁\編于星期三\10點發(fā)光標記免疫分析化學(xué)發(fā)光標記免疫分析（CLIA）電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)分類當前第45頁\共有64頁\編于星期三\10點化學(xué)發(fā)光標記免疫分析（CLIA）

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強度來確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。當前第46頁\共有64頁\編于星期三\10點發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶吖啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）當前第47頁\共有64頁\編于星期三\10點化學(xué)發(fā)光標記免疫分析（CLIA）概念：利用化學(xué)反應(yīng)中釋放大量自由能產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，當其退激到基態(tài)時，發(fā)射出光子，對這些光子量進行測量從而進行定量分析抗原含量。常用發(fā)光劑：魯米諾類、吖啶酯類特點：靈敏度高特異性強重復(fù)性好測定范圍寬1234當前第48頁\共有64頁\編于星期三\10點化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)是將高特異性的酶標記免疫分析技術(shù)和具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)相結(jié)合的一種標記免疫分析方法。發(fā)光劑：金剛烷特點：標記結(jié)合穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時間長有利于測定123當前第49頁\共有64頁\編于星期三\10點辣根過氧化物酶標記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

當前第50頁\共有64頁\編于星期三\10點電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)簡介：是新一代標記免疫分析技術(shù)，與其它標記發(fā)光免疫分析的原理不同，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采用更為理想的標記物，使用磁性分離及電激發(fā)等新技術(shù)，進一步推動了發(fā)光免疫分析的發(fā)展，是目前最先進的化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng)。當前第51頁\共有64頁\編于星期三\10點電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)原理：以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），與待測標本中抗原（抗體）產(chǎn)生免疫反應(yīng)形成復(fù)合物以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)兩個過程。

特點準確性好多元檢測均相測量穩(wěn)定性好靈敏度高當前第52頁\共有64頁\編于星期三\10點

在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標記抗原(抗體)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標本與相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人TPA緩沖液。當磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。當前第53頁\共有64頁\編于星期三\10點

[Ru(bpy)3]2+為標記物三聯(lián)吡啶釕為水溶性、高穩(wěn)定性的小分子，可以確保電化學(xué)發(fā)光的高穩(wěn)定性，并且無噪音干擾。三聯(lián)吡啶釕結(jié)構(gòu)簡單,分子量小，所以，易于標記到任何物質(zhì)（如抗原、抗體、核酸，等）上，并且對原物質(zhì)的生物活性及免疫活性影響小。TPA是ECL中的電子供體，氧化后生成的中間產(chǎn)物是形成激發(fā)態(tài)[Ru(bpy)3]2+化學(xué)能來源。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)的標記物當前第54頁\共有64頁\編于星期三\10點電化學(xué)發(fā)光免疫(ECLIA)反應(yīng)模式圖當前第55頁\共有64頁\編于星期三\10點電化學(xué)發(fā)光免疫分析測定示意圖當前第56頁\共有64頁\編于星期三\10點第四節(jié)體外標記免疫分析的質(zhì)量控制當前第57頁\共有64頁\