第四章腸道菌群的詳解

第四章腸道菌群的詳解演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)優(yōu)選第四章腸道菌群的當(dāng)前第2頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)共同特性1、相似的形態(tài)染色2、簡(jiǎn)單的培養(yǎng)條件3、活潑的生化反應(yīng)重要試驗(yàn)初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖多數(shù)發(fā)酵乳糖當(dāng)前第3頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)5、抵抗力不強(qiáng)6、易變異溶源性轉(zhuǎn)換生化反應(yīng)性變異通過(guò)引起耐藥性變異毒力性變異轉(zhuǎn)導(dǎo)接合4、抗原構(gòu)造復(fù)雜

當(dāng)前第4頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)腸道桿菌生物特征1．形態(tài)與結(jié)構(gòu)：中小等大小兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽胞，多數(shù)有鞭毛，大多有菌毛，少數(shù)有莢膜或包膜。2．培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，為中等大小的光滑型菌落。有些菌在血瓊平板上出現(xiàn)β型溶血，在液體培養(yǎng)中呈均勻混濁生長(zhǎng)。3．生化反應(yīng)：發(fā)酵葡萄糖，氧化酶陰性。生化反應(yīng)活潑，一般說(shuō)來(lái)，生化反應(yīng)的強(qiáng)弱與其致病作用成反比。當(dāng)前第5頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)腸道桿菌流行病學(xué)抵抗力：不強(qiáng)，加熱60℃經(jīng)30分鐘即死亡。不耐干燥,膽鹽、煌綠等對(duì)大腸桿菌等非致病菌有選擇性作用，可制備腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基以分離腸道致病菌。對(duì)一般化學(xué)消毒劑如漂白粉,酚,甲醛均敏感,對(duì)低溫有耐受力.臨床意義:腸桿菌科細(xì)菌可致化膿性疾病,肺炎,腦膜炎,敗血癥以及傷口,泌尿道和腸道的感染,本科細(xì)菌占臨床分離細(xì)菌總數(shù)的50%和臨床分離的革蘭氏陰性菌總數(shù)的80%,將近50%的敗血癥,70%以上的泌尿道感染是由腸桿科細(xì)菌引起.傳播方式：污染的飲水及食物、經(jīng)消化道傳播。當(dāng)前第6頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)腸桿菌科中與衛(wèi)生醫(yī)學(xué)有關(guān)的細(xì)菌

當(dāng)前第7頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第8頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸菌群為革蘭氏陰性菌當(dāng)前第9頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)一、大腸菌群檢驗(yàn)第一法大腸菌群MPN法第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)快速法大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試紙片法當(dāng)前第10頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN最大或然數(shù)（mostprobablenumber，MPN）計(jì)數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢(shì)，但卻具有特殊生理功能的類(lèi)群其特點(diǎn)是利用待測(cè)微生物的特殊生理功能的選擇性來(lái)擺脫其他微生物類(lèi)群的干擾，并通過(guò)該生理功能的表現(xiàn)來(lái)判斷該類(lèi)群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測(cè)定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細(xì)菌等。）的數(shù)量和檢測(cè)污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類(lèi)群（如大腸菌群）的數(shù)量，缺點(diǎn)是只適于進(jìn)行特殊生理類(lèi)群的測(cè)定，結(jié)果也較粗放。當(dāng)前第11頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN法的原理當(dāng)前第12頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN法的局限性——相同MPN值，但含義不同MPN值為90時(shí)，有四種不同情況的陽(yáng)性管數(shù)。陽(yáng)性管數(shù)為“0-0-0”“0-1-2”對(duì)應(yīng)的最大概率（Pmax）極小，此時(shí)的MPN值90MPN/100ml(g）無(wú)意義，所以在《FDA細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中，已刪除了這兩種情況。當(dāng)前第13頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN法的局限性——相同MPN值，但含義不同

陽(yáng)性管數(shù)為“0-3-0”對(duì)應(yīng)的最大概率（Pmax）為0.00417%，而國(guó)標(biāo)中并沒(méi)有列出相應(yīng)的95%置信區(qū)間，是考慮到該置信區(qū)間過(guò)廣，已沒(méi)有很大的指導(dǎo)意義。陽(yáng)性管數(shù)為“2-0-0”的最大概率（Pmax)為31.91613%，表明實(shí)際的菌落數(shù)在10~360cfu/100ml(g）之間。所以，測(cè)定MPN值時(shí)，要考慮陽(yáng)性管數(shù)。相同的MPN值，代表的實(shí)際菌落數(shù)范圍卻有很大的差別。假如你的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)為100MPN/100g，實(shí)測(cè)值為90MPN/100g（陽(yáng)性管數(shù)“0-3-0”），那么很難判定你的產(chǎn)品是否合格。當(dāng)前第14頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN值的準(zhǔn)確度隨Pmax的減小而減小

不同MPN值對(duì)應(yīng)的Pmax值不同，且隨著Pmax值的減小，MPN值的準(zhǔn)確度也明顯下降，所以在《FDA細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中已刪除了極低Pmax值（<0.004%）的情況，因?yàn)檫@些Pmax值對(duì)應(yīng)的MPN值沒(méi)有實(shí)際的指導(dǎo)意義。當(dāng)前第15頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)MPN法檢測(cè)的隱性成本

產(chǎn)品的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)為30MPN/100g，而某個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果為90MPN/100g，那么你可能會(huì)認(rèn)為你的產(chǎn)品不合格。但是，讓我們看一下90MPN/100g的置信區(qū)間，為10~360cfu/100g，也就是說(shuō)有部分結(jié)果為90MPN/100g的產(chǎn)品，且實(shí)際菌落數(shù)在10~30cfu/100g之間，會(huì)被當(dāng)作不合格產(chǎn)品處理。30MPN/100g的置信區(qū)間為<5~90cfu/100g（陽(yáng)性管數(shù)0-0-1）或<5~130cfu/100g（陽(yáng)性管數(shù)0-1-0）。也就是說(shuō)部分實(shí)際菌落數(shù)為30~130cfu/100g的產(chǎn)品，會(huì)被當(dāng)作合格產(chǎn)品，從而微生物風(fēng)險(xiǎn)增加。當(dāng)前第16頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸菌群大腸菌群系指一群在36℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。

當(dāng)前第17頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)第一法

大腸菌群計(jì)數(shù)MPN法當(dāng)前第18頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)抑菌劑的選擇大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。

當(dāng)前第19頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)檢樣稀釋以無(wú)菌操作將檢樣25ml(或25g)放于含有225ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1：10的均勻稀釋液。調(diào)pH為6.5～7.5。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀輕液1m1．注入含有9ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻．作1：10的稀釋液。另取1m1滅菌吸管，按上項(xiàng)操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1m1滅菌吸管：根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。

當(dāng)前第20頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)初發(fā)酵試驗(yàn)在乳糖發(fā)酵過(guò)程中，觀察產(chǎn)氣和產(chǎn)酸兩個(gè)現(xiàn)象。將待檢樣品接種于LST發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料LST發(fā)酵管；1m1及1m1以下者，用單料LST發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時(shí)，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，進(jìn)行分離和鑒定。當(dāng)前第21頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)LST結(jié)果判斷大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管。當(dāng)前第23頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)復(fù)發(fā)酵當(dāng)前第24頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸菌群最大可能數(shù)檢索表當(dāng)前第25頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)其它全部為0，報(bào)告為＜最低檢出線如樣品中大腸菌群較少，可加大接種量，采取雙料發(fā)酵管當(dāng)前第26頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸菌群計(jì)數(shù)第二法——直接計(jì)數(shù)法CFU通過(guò)數(shù)據(jù)直接求數(shù)學(xué)期望當(dāng)前第27頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)傾注培養(yǎng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。將涼至46℃結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA平板）注入平皿約15～20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將1mL稀釋液（不含樣品）作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，倒入3～4mLVRBA培養(yǎng)基鋪面，培養(yǎng)基凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。當(dāng)前第28頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15～150之間的平板，分別計(jì)數(shù)典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑約為0.5mm。當(dāng)前第29頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)

從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36

℃±1

℃培養(yǎng)24

h～48

h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。

證實(shí)試驗(yàn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1

mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。當(dāng)前第31頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第32頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)其他方法

大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試紙片法當(dāng)前第33頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第34頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第35頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第36頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)二、糞大腸菌群(faecalcoliform)定義：一群能在44.5℃,24-48h內(nèi)發(fā)酵乳糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌檢測(cè)意義：糞大腸菌群的來(lái)源是人和溫血?jiǎng)游锛S便，作為糞便污染的指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。比大腸菌群更加直接。當(dāng)前第38頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)糞大腸菌群(faecalcoliform)的測(cè)定

GB4789.39-2013當(dāng)前第39頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)三、大腸桿菌（E.coli）細(xì)菌域(Bacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬(Escherichia)、大腸桿菌種(E.coli)。它是一種普通的原核生物，是人類(lèi)和大多數(shù)溫血?jiǎng)游锬c道中的正常茵群。但也有某些血清型的大腸桿菌可引起不同癥狀的腹瀉，根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為5類(lèi)：致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。

當(dāng)前第40頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）定義：廣泛存在于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽）生化試驗(yàn)為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。IMViC生化試驗(yàn)：細(xì)菌的生化反應(yīng)吲哚（I）、甲基紅（M）、VP（V）、枸櫞酸鹽利用（C）四種試驗(yàn)常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗(yàn)。用于鑒別形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和培養(yǎng)特性相同或相似的細(xì)菌。當(dāng)前第41頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期三\11點(diǎn)大腸