纖維素酶基因

0712401031范艷群摘要：本文對纖維素酶產(chǎn)生菌纖維素基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵字：纖維素酶;纖維素酶基因;克隆方法纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是一種具有催化纖維素分解成葡萄糖的生物活性蛋白質(zhì)。纖維素酶最早是1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)的,它可將豐富的纖維素廢資源轉(zhuǎn)化為再生資源，解決能源、飼料和食品供應(yīng)不足的問題,并可應(yīng)用于酒精、白酒、醬油、飼料和紡織行業(yè)上［I。纖維素酶的酶解效率不高，因此影響了其工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代以來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過分子克隆等新方法掌握了纖維素酶的遺傳特性及催化機(jī)理。進(jìn)而為研究纖維素酶的生物合成，構(gòu)建高效纖維素分解菌開辟了新的途徑⑶。近10年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基因重組與其他一系列分子生物學(xué)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，使這一領(lǐng)域的研究更為深入⑷.1纖維素酶維素酶是一種復(fù)合酶，屬生物催化劑，是水解纖維素以獲取葡萄糖的酶系，它是由大約14000個(gè)葡萄糖殘基通過0-1，4-糖苷鍵連接而成的線性聚合物，其基本重復(fù)單位為纖維二糖。纖維素酶包括纖維素內(nèi)切酶、外切酶和0-葡萄糖苷酶。3種酶之間存在協(xié)同作用。因此，只有當(dāng)3個(gè)主要成分的活性比例恰當(dāng)時(shí)，才能有效地降解纖維素⑸。2纖維素酶基因由于利用纖維素酶的降解作用進(jìn)行纖維素的生物轉(zhuǎn)化有著廣闊的前景，自70年代末就開始了纖維素酶基因的克?、省，F(xiàn)已從20多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆到了80余個(gè)纖維素酶基因并被測序。并且?guī)缀跛幸芽寺〉睦w維素酶基因都已在大腸桿菌中表達(dá)［E。目前，產(chǎn)纖維素酶微生物的研究主要幾種在細(xì)菌和真菌兩方面。2.1細(xì)菌纖維素酶基因目前，我們國家對細(xì)菌纖維素酶方面的研究是取得了不小進(jìn)展的。郭成栓⑼等從一株產(chǎn)堿性纖維素酶的短小芽孢桿菌菌株的中克隆到了編碼葡聚糖內(nèi)切酶的基因，并對其基因序列及酶的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析預(yù)測。同時(shí)將該酶的基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并測其在不同溫度和pH值下的活力和穩(wěn)定性，溫度達(dá)到55P時(shí)，酶反應(yīng)速度最快，在pH=5?9時(shí)具有較好的穩(wěn)定性,與原始菌株的纖維素酶活性比較,兩者很接近。熊鵬鈞、文建軍［10］從深海樣品中分離到一株具有高內(nèi)切葡聚糖酶活力的細(xì)菌DY3，并通過16SrDNA序列分析表明是一株深海交替假單胞菌，對其進(jìn)行了分離及對其低溫堿性內(nèi)切葡聚糖酶性質(zhì)的初步研究和酶基因的克隆及序列分析。將該基因命名為celX，對酶性質(zhì)的初步研究發(fā)現(xiàn)，celX的最適溫度為40P，酶的最適pH值在6?7之間。且最重要的一個(gè)發(fā)現(xiàn)是該酶具有抗堿性。趙瑩等［11］用Smal和SphI雙酶切pMD182T-CBHII和以胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase，thyA)為選擇壓力的非抗生素抗性的穿梭表達(dá)載體pW425t,將純化的CBHI基因和表達(dá)載體pW425t大片段進(jìn)行連接，構(gòu)建出可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pW425t-CBHI，將pW425t2CBHI轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并測得CBHI的反應(yīng)最適溫度為50P，最適pH值為5.0。當(dāng)溫度50。。，pH值5.0時(shí)重組乳酸桿菌的CBHI的酶活力達(dá)到0.11562U/mL。然而纖維素外切酶是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結(jié)晶纖維素的酶組分。尹捷，劉一葦?shù)热耍?2］成功克隆了一段來自騰沖嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobactertengcongensis)編碼PbgL(436個(gè)氨基酸殘基)的開放閱讀框(ORFTTE0337)，并在大腸桿菌BL21中有活性地表達(dá)。純化后的重組PbgL(rPbgL)經(jīng)SDS分析，為1條分子量約50kDa的蛋白條帶，與推測的分子量大小一致。真菌中編碼纖維素酶的基因位于染色體上，通常隨機(jī)地分布于整個(gè)基因組中，每個(gè)基因有其自己的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)單位"。由于絲狀真菌木霉屬能產(chǎn)生大量的胞外纖維素酶，酶系較完全，并且對結(jié)晶纖維素有較好的酶解活性，近十幾年來對真菌木霉屬纖維素酶基因做了大量的研究，并且都在E.coli中得到了表達(dá)，并測定了這些基因的核苷酸序列。其中瑞氏木霉是研究最多的木霉，已有八個(gè)纖維素酶基因得到克隆并測序，包括編碼纖維二糖水解酶的cbhl、cbh2和編碼內(nèi)切葡聚糖酶的egll，egl2,egl3,egl4和egl5[i4]，以及編碼b-葡萄糖苷酶的bgl4和它的類似物bgl2(兩者有73.1%的同源性)。祝令香等"2001年克隆并測定了康寧木霉K801纖維素酶CBHII基因序列，發(fā)現(xiàn)與T.reesei已知序列的同源性達(dá)到99.89%。王建榮等[16-19]克隆并測序了綠色木霉CBHI基因和CBHII基因，他采用瑞氏木霉的基因序列同源性片段作探針，從構(gòu)建的綠色木霉基因文庫中，成功地克隆了綠色木霉CBHI和CBHII基因。3克隆方法早期利用纖維素酶需誘導(dǎo)物存在才能合成這一特性采用差異雜交法，分別用纖維素誘導(dǎo)條件下和非誘導(dǎo)條件下所提取的mRNA制備cDNA探針，與木霉基因文庫進(jìn)行雜交，選擇那些與前者產(chǎn)生強(qiáng)烈雜交而與后者不雜交的菌落，從中篩選到纖維素酶基因。其他克隆基因的方法有：遺傳互補(bǔ)法，利用具有相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型遺傳背景的酵母菌作宿主篩選所需的酶基因;利用抗體的免疫篩選法；異源雜交法，利用其他真核生物相關(guān)的基因片段為探針對木霉cDNA文庫進(jìn)行原位雜交篩選；反求遺傳學(xué)法，由純化的酶蛋白得出部分氨基酸序列，由此設(shè)計(jì)并合成寡聚核苷酸混合物作為探針從cDNA文庫中篩選所需的酶基因[知王海青等[21],以費(fèi)氏弧菌EM17基因組DNA為模板，通過PCR方法克隆了該菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因。將其插入到表達(dá)載體pGEX-6p-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分目前，人們對纖維素酶的研究多以葡聚糖內(nèi)切酶為主，而葡萄糖外切酶是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結(jié)晶纖維素的酶組分，在今后的工作中應(yīng)特別重視對外切酶的研究。再者，幾乎所有已克隆的纖維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達(dá)。但是這一體系表達(dá)率低，產(chǎn)生的酶多數(shù)不能分泌到胞外。為了得到胞外分泌產(chǎn)物，一些纖維素酶基因已在枯草芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，乳酸發(fā)酵短桿菌和變青鏈霉素等中得到了有效表達(dá)。但由于纖維素酶基因在異源宿主中的表達(dá)要遇到蛋白酶水解和糖基化等問題，分泌機(jī)制尚不清楚，無法達(dá)到纖維素酶生產(chǎn)要求。纖維素酶基因在酵母中的表達(dá)是纖維素酶用于工業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要途徑。但是，目前利用酵母表達(dá)外源纖維素酶基因的水平有限，故如何建立有效的纖維素酶基因真菌表達(dá)體系，提高酵母表達(dá)纖維素酶的產(chǎn)量將是一個(gè)重要的研究課題[22]。參考文獻(xiàn)：BHATMK,BHATS.Cellulosedegradingenzymesandtheirpotentialindustrialapplications[J] .BiotechnologyAdvances,1997,15:583-620.[2]TOMMEP,WARRENRAJ,GILKESNR.Cellulosehydrolysisbybacteriaandfungi[J].AdvMicrobiolPhysiol,1995,37:1-81.張磊，吳興泉，木霉纖維素酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2004,12(4):38-43.李雯，洪艷，侯紅萍.纖維素酶高產(chǎn)菌株的研究進(jìn)展，釀酒科技,2009(8):105-106.賀稚非，等.纖維素酶及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].糧食與油脂，2004,(1):15-18.胡利勇，鐘衛(wèi)鴻.纖維素酶基因克隆及其功能性氨基酸研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2003(4):43-44王曉芳.產(chǎn)纖維素酶的真菌篩選與纖維素酶的誘導(dǎo)及其理化性質(zhì)研究[D].南京師范大學(xué)碩士學(xué)位論文.江蘇南京：南京師范大學(xué)，2002,4.10—11.劉純強(qiáng)，王祖農(nóng).纖維素酶基因克隆及應(yīng)用前景[J].生物工程進(jìn)展，1991,11(3):8—15.郭成栓.0-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及表達(dá)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008,36(12):36—39.熊鵬鈞，文建軍.交替假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)DY3菌株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的性質(zhì)研究及基因克隆[J].生物工程學(xué)報(bào),2004,20(2):89—91.趙瑩，孫哲.酸性纖維素酶CBHII基因與非抗性穿梭表達(dá)載體的重組及在乳酸桿菌的表達(dá)及其活性檢測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(5):670-675.尹捷，劉一葦.騰沖嗜熱厭氧桿菌6-磷酸-。-葡萄糖苷酶的表達(dá)與結(jié)晶及其功能鑒定[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2008,24(10):916-924.張鴻雁，陳錫時(shí).微生物纖維素酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2003(6):41-42.汪天虹，吳靜，鄒玉霞.瑞氏木霉分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2000,19(1):147-152.祝令香，于巍.康寧木霉K801纖維素酶CBHII基因的克隆及序列分析[J].菌物系統(tǒng),2001,20(2):174-177.王建榮，張曼夫，黃濤.綠色木霉纖維素酶CBHII基因的結(jié)構(gòu)研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，1995,22(1):74-80.王建榮，張曼夫.綠色木霉纖維素酶CBHII基因的分子克隆[J].真菌學(xué)報(bào)，1994,13(3):235-240.吳彤，張曼夫.綠色木霉纖維素酶CBHI基因的cDNA分子克隆[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1994(6):28-36.王建榮，張曼夫.綠色木霉(Trichodermaviride基因組文庫構(gòu)建及其CBHI基因陽性克隆篩選[J