維真生物-mRNA的分離和純化

mRNA的分離和純化實驗原理從細胞或組織中得到RNA是一種混合物，其中包括tRNA,rRNA和mRNA,其中RNA為75%?85%,tRNA占10%?16%，而mRNA僅占1%?5%,并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表達豐度也不一樣。每克細胞可分離出5-10mgRNA。真核生物mRNA具有5’端帽子結(jié)構(gòu)(m7G)和3’端的poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳動物細胞的3’端存在20-300個腺苷酸組成的poly(A)尾，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA分子的分離和純化，提供了極為方便的條件，寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的實驗理論就在于此。一般mRNA分離純化的原理就是根據(jù)mRNA3’端含有poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)特性設(shè)計的。當總RNA流經(jīng)寡聚(dT)(即oligo(dT))纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過oligo(dT)纖維素柱吸附和解吸附，即可得到較純的mRNA。實驗材料1、 0.1mol/LNaOH(用0.1%DEPC處理過的無RNase水配置)2、 寡聚Oligo(dT)-纖維素3、 加樣/洗滌緩沖液1：0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6)，每組250mL或0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。(用0.1%DEPC處理過的無RNase水配置)4、洗滌緩沖液2：0.1mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),每組250mL或10mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDSO(用0.1%DEPC處理過的無RNase水配置)5、 5mol/LNaCl（加0.1%DEPC處理過夜）6、 3mol/LNaAcpH5.2（加0.1%DEPC處理過夜）7、 無RNase雙蒸水（DEPC水）8、 70%乙醇（用0.1%DEPC處理過的無RNase水配置）需要用到的實驗儀器：恒溫水浴箱，高速冷凍離心機，紫外分光光度計，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。實驗過程（一） oligo（dT）纖維素的預(yù)處理1、 用0.1mol/LNaOH懸浮0.5T.0goligo（dT）纖維素。2、 將懸浮液裝入填有經(jīng)DEPC水處理，高壓滅菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床約0.5-1.0mL,用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo（dT）纖維素。3、 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo（dT）纖維素，直到流出液的pH值小于8.0O4、 將處理好的oligo（dT）纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當?shù)闹蚕礈炀彌_液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4°C待用。（二） 總RNA濃度的調(diào)整1、把總RNA液轉(zhuǎn)到適合的無RNase離心管中，測定總RNA的濃度。如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。濃度調(diào)整以后，把RNA溶液置于65°C水浴加熱5min，然后迅速插在冰上冷卻。2、加入一定體積5mol/LNaCl使RNA溶液中鹽的濃度調(diào)至0.5mol/L。mRNA的分離1、mRNA與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數(shù)次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37C水浴保溫并溫和搖蕩15min。oligo(dT)-纖維素與RNA所需量如下表。表1總RNA量所需材料的體積總RNA(mg)oligo(dT)-纖維素(ml)洗滌緩沖液1,2(ml)洗脫體積(ml)<0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.02、轉(zhuǎn)移：取1個5ml注射器，用經(jīng)過高溫滅菌的玻璃棉塞緊注射器前端，注射器固定在無RNase的支架上，把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液體，即把含有未結(jié)合上的RNA液體收集到無RNase的離心管中(保留至確定獲得足夠的mRNA)。3、 洗滌：根據(jù)表1所需洗滌緩沖液1的體積，直接用注射器慢慢吸取，溫和振蕩，充分懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD值為0時準備洗脫。4、 洗脫：根據(jù)表1所需洗脫液體積，用注射器慢慢吸取洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內(nèi)，充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，以1/3至1/2柱床體積分裝到無RNase的離心管中。5、 測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液。在4°C條件下，2500g，離心2-3min，將上清轉(zhuǎn)移至新無RNase的離心管中。6、沉淀：向上清液中加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.2),再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-20C條件下沉淀30min或放置過夜。7、 離心收集：4C條件下，12000g,離心15min，小心棄去上清，用70%乙醇漂洗沉淀，4C條件下，12000g,離心5min，小心棄去上清液。沉淀空氣干燥10min。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用于后續(xù)實驗，或用70%乙醇溶解，貯存于-70C。8、 定量：測定OD260和OD280，計算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率注意事項1、整個操作過程必須嚴格遵守?zé)oRNase操作環(huán)境，且注意操作中的低溫要求。2、 用于純化的總RNA樣品須盡量保持RNA完整，不能被降解，獲得完整mRNA質(zhì)量的前提條件。3、 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，若總RNA會影響mRNA純度。4、 RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合前必須置于65°C加熱5min，其作用：(1)破壞mRNA的二級結(jié)構(gòu)，特別是poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；(2)解離mRNA與rRNA的結(jié)合。加熱后應(yīng)立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復(fù)其二級結(jié)構(gòu)。5、 應(yīng)注意mRNA不能被DNA污染，否則嚴重影響實驗結(jié)果。6、 mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應(yīng)該在0.5~8.0kb之間呈現(xiàn)彌散狀，無明顯區(qū)帶，但大部分的mRNA應(yīng)在1-2.0kb范圍內(nèi)呈彌散狀。經(jīng)過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對后續(xù)實驗造成很大的影響，如果樣品純化后量足夠，可將經(jīng)過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。7、 為防止mRNA降解，應(yīng)避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。也可將mRNA用70%乙醇溶解，在-70C保存，保存時間在一年以上。8、 Oligo(dT)-纖維素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉(NaN3)，放在4C冰箱保存。經(jīng)過預(yù)處理后可以重復(fù)使用。維真生物已開通現(xiàn)貨查詢平臺掃錨二微碼點擊頃貨查為I可查詢及訂購cGMP維真生物已開通現(xiàn)貨查詢平臺掃錨二微碼點擊頃貨查為I可查詢及訂購cGMP象別病毒主產(chǎn)mvwAiKcncbioxn晚隹二■■騷的冉蛛叮訂單誼詢產(chǎn)品命空點擊這里備注：維真生物