抗體工程制藥

抗體工程制藥第一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六一.概述

抗體(工程)制藥—生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的重要組成部分第二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗原(antigen,Ag)---是指那些能夠刺激和/或誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抗體和/或致敏（效應(yīng)）淋巴細胞，同時又能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)外特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。如：病原微生物、免疫血清、藥物、疫苗對機體來說，抗原相當(dāng)于一個國家已知的或潛在的、外部的或內(nèi)部的“敵人”。第三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六免疫原性：指能刺激機體產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細胞的性能。

反應(yīng)原性：能與相應(yīng)的抗體和/或淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)生反應(yīng)的性能。

4第四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六完全抗原：既具有免疫原性，又具有反應(yīng)原性的抗原。如微生物、異種血清半抗原：又稱不完全抗原。是指其本身只有反應(yīng)原性，但沒有免疫原性的簡單小分子的抗原物質(zhì)。如某些藥物（青霉素，等）、多糖、類脂。5第五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六目前，在中草藥中發(fā)現(xiàn)廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，具有生化活性基因的化學(xué)成分都有可能成為半抗原，這些半抗原可與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合成完全抗原，造成一些過敏反應(yīng)。6第六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗原的特異性既表現(xiàn)在免疫原性上，也表現(xiàn)在反應(yīng)原性上。沙門氏桿菌大腸桿菌抗大腸桿菌的抗體抗沙門氏桿菌的抗體結(jié)合結(jié)合7第七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)抗體：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有

免疫功能的球蛋白。第八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體的產(chǎn)生過程：

機體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細胞被激活，增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。第九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范圍從150,000到950,000道爾頓。分五類：IgG在血清中含量最高，達75~80%,是抗感染的主要抗體;IgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為五聚體,是對一個抗原作出反應(yīng)時產(chǎn)生的

第一個抗體；IgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參與局部的免疫反應(yīng);IgD在血清中含量很低;IgE在血清含量最少。免疫球蛋白IgGIgMIgAIgDIgE第十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六動物血清中產(chǎn)生抗體的時間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，IgＧ將取代IgM第十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體研究的發(fā)展階段：①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表,用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體。②以1975年Milstein&Kohler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體(McAb)為代表。③以1994年Winter,創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(repertoireofantibodiesdisplayedonphages)技術(shù),以基因工程方法制備抗體為代表。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。第十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六多克隆抗體:

一種抗原具有多個抗原決定簇,每個抗原決定簇都能刺激一個B細胞產(chǎn)生一種抗體。這樣所獲得的免疫血清是多種抗體的混和物。單克隆抗體(MonoclonalantibodyMcAb):

由一個抗原決定簇刺激的、單一的B細胞和骨髓瘤細胞融合增殖后所產(chǎn)生的、高度均一的抗體。1234第十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六多克隆抗體和單克隆抗體PuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234BcellPuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234Bcell第十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

McAb（Monoclonalantibody，單克隆抗體）：

將在體外不能長期傳代的抗體產(chǎn)生細胞（如Balb/C小鼠的免疫脾細胞）與在體外能迅速增殖并帶有抗藥標記的骨髓瘤細胞（如小鼠的NS-1或SP2/0）在聚乙二醇（PEG）作用下融合，然后利用抗藥性標記和經(jīng)稀釋法選出單個產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞，再用血清學(xué)方法證實其與抗原結(jié)合的特異性和親和力。這樣的雜交瘤細胞能長期傳代同時分泌針對單一抗原上單一抗原表位的抗體，稱為McAb（第二代抗體）。二.單克隆抗體的制備第十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六二.單克隆抗體的制備單克隆抗體制備過程圖解第十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六單克隆抗體制備過程圖解第十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六一.抗原與動物免疫

1.抗原選擇—

完整細胞(腫瘤細胞)；可溶性蛋白質(zhì)或多肽;2.免疫動物—

小鼠(Balb/C,鼠齡6-8周)或大鼠(Lou);

第十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六3.常用的骨髓瘤細胞系—SP2/0，P3.653細胞，都是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT)的缺乏株。4.免疫方法:體外免疫法；體內(nèi)免疫法第二十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六體內(nèi)免疫法

----顆粒性抗原(如細菌、細胞)的免疫原性強,可不加佐劑,可溶性抗原則按每只小鼠10-100ug抗原與弗氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi).弗氏完全佐劑（Freund’scompleteadjuvant,FCA）:由礦物油（如降脂烷或液體石蠟等）、乳化劑和滅活的分枝桿菌組成的乳化佐劑。弗氏不完全佐劑不含分枝桿菌第二十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

免疫佐劑（adjuvant)

（1）定義：先于抗原或同時與抗原混合注射機體可增強抗原的免疫原性的物質(zhì)。（2）應(yīng)用①弱免疫原性物質(zhì)；

②免疫原劑量不足。（3）佐劑種類

1)油性乳劑—弗氏佐劑（Freundadjuvant）

2)無機化合物

3)微生物及其產(chǎn)物

4)脂質(zhì)體

5)細胞因子第二十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六二.細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)

1.細胞融合的基本方法(PEG促融)

脾細胞骨髓瘤細胞(“永久”細胞)(1×108)(2~3×107)

聚乙二醇(PEG)37-40℃2mins

融合細胞（雜交瘤細胞）

用作細胞融合劑的聚乙二醇(PEG)一般選用MW4000，常用濃度為50％，pH8.0～pH8.2。可加入二甲基亞砜(DMSO)。

2002年12月神舟4號飛船搭載B淋巴細胞和骨髓瘤細胞升空進行細胞融合實驗第二十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六原理：

細胞進行融合時，培養(yǎng)液中只有部分細胞融合成雜種細胞，還有大量未融合的雙親細胞。這就需要選擇分離純化雜種細胞。為此要創(chuàng)造一種只讓雜種細胞生長繁殖而親本細胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細胞和親本細胞對生長條件的要求和代謝的差異來進行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。第二十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六2、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基。次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻斷DNA合成)、胸腺嘧啶(T)。脾細胞具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),因此脾-瘤融合的雜交瘤細胞可利用HGPRT酶,用次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA,使雜交瘤細胞得以生長。第二十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六HAT選擇培養(yǎng)機制

主要途徑

糖氨基酸氨甲喋呤（A）次黃嘌呤(H)GMP核苷酸DNA

HGPRT核苷酸前體

TK(胸苷激酶)胸腺嘧啶核苷(T)dTMP第二十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六HAT培養(yǎng)基：

H

為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A

可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料第二十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六含有飼養(yǎng)細胞的24/96孔板內(nèi)懸浮培養(yǎng)，2~3天換液一次(HAT的培養(yǎng)液7天內(nèi)),第7~14天改用HT培養(yǎng)液（對照阻的骨髓瘤細胞已死亡）14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞和胸腺細胞等。8~9天可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測,篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆.第二十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六培養(yǎng)板第二十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六B細胞雜交瘤的技術(shù)流程第三十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六三.篩選陽性克隆與克隆化1.篩選方法：

免疫酶技術(shù)放射免疫技術(shù)

免疫熒光技術(shù)

第三十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六（1）免疫酶技術(shù)原理：將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸停瑥亩砻髂撤N抗原或抗體的存在。

第三十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第三十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六（2）免疫熒光技術(shù)原理：將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體（或抗原）結(jié)合，然后將熒光素標記的抗體或抗原作為標準試劑，用于檢測和鑒定抗原或抗體。

免疫熒光技術(shù)用于細胞抗原的抗體檢測,特別是檢測患者活檢組織標本。第三十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第三十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六（3）放射免疫技術(shù)原理：將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。放射免疫測定原理示意圖第三十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六2.克隆化

為提高篩選出來的陽性克隆的穩(wěn)定性，將單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。有限稀釋法：通過一系列稀釋，使每個細胞培養(yǎng)孔平均只含一個細胞，而分離細胞軟瓊脂法：將雜交瘤細胞懸液分散在半固體營養(yǎng)瓊脂糖上，使呈單個細胞定位生長繁殖，以達到克隆化的目的。第三十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六四.雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定

1.雜交瘤細胞借助染色體分析鑒定多數(shù)為端著絲粒染色體,染色體數(shù)目接近兩種親本細胞染色體之和。

2.抗體鑒定

Ig類和亞類鑒定：免疫擴散或ELISA法親和力鑒定第三十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體類別鑒定（Ig類和亞類鑒定）

抗體分子因有大小、帶電量、溶解度及其與抗原的作用不同，可分為不同的類和亞類。

IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）

IgA（IgA1、IgA2）

IgM（無）

IgD（無）

IgE（無）第三十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

1）免疫擴散指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在液相中特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀線現(xiàn)象。

單向免疫擴散

雙向免疫擴散

第四十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六（2）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)原理：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，再將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進行定性或定量分析的方法。第四十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六ELISA第四十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六ELISA第四十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六五.單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)單克隆抗體的生產(chǎn)包括細胞培養(yǎng)、提純和制劑等工藝過程。1.雜交瘤細胞的大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器：氣升式發(fā)酵罐，中空纖維培養(yǎng)罐，微囊發(fā)酵罐培養(yǎng)基：牛淋巴液，血清第四十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六2.單克隆抗體的大量制備的方法體外培養(yǎng)法(收獲10-400ug/ml抗體)

酶標板上培養(yǎng)微載體懸浮培養(yǎng)（固體顆粒用DEAE-SephadexA50等材料）。動物體內(nèi)誘生法—

用0.5ml降脂烷/液體石蠟注入腹腔,然后注射1×106雜交瘤細胞，再……收獲5~2Omg/ml抗體。支原體污染！??！第四十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六3.單克隆抗體(McAb)的純化純化單克隆抗體流程(大鼠)單抗純化方法:超濾法鹽析法離子交換法凝膠過濾法

HPLC法等第四十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六三.單克隆抗體藥物的現(xiàn)狀250多種抗體類藥物在臨床試驗中－1/3已進入三期臨床－1/4已通過臨床III期試驗美國市場上有13種治療用的抗體藥物抗體藥物的銷售額－97-99年由4.68億美元增長到13億美元－03年抗體類藥物總銷售額達到50億美元第四十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體藥物市場銷售額2011第四十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體

正在進行臨床試驗的抗體公司（38家）：AbgenixAlexionPharmAltarexAppliedMolecularEvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(CambridgeAbTech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson)

ElanElsaiEliLillyGenzymeTransgenicsGenentechGenmabHoffman-LaRocheICOSPharmIDECPharm/MitsubishiImCloneSysImmunotechKaneboKnollPharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrthoBiotechPasteur-MerieuxProgenicsProteinDesignLabScheringSmithKlineBeechamTanoxBiosystemsTechnicloneXomaZenyaku第四十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六當(dāng)前美國治療性抗體市場ReoPro(J&J,Centocor,Lilly) 1994/$461MAbciximab,鼠抗GPIIb/II抗體,防止血小板凝集凝血性心血管疾病-AMI,不穩(wěn)定型心絞痛Rituxan(IDEC/Genentech/Roche) 1997/$303MRituximab,嵌合抗CD20抗體非霍奇金氏淋巴瘤Herceptin(Genentech) 1998/$204MTrastuzumab人源化抗HER-2/Neu抗體HER-2過量表達乳腺癌Synagis(Medimmune) 1998/$285MPalivizumab

人源化抗-RSVF糖蛋白抗體

小兒RSV感染第五十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六當(dāng)前美國治療性抗體市場Remicade(Centocor) 1998$130MInfliximab嵌合抗TNF-α抗體局限性腸炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Zenapax(PDL,Roche) 1997$130MDacliximab,人源化,抗Tac(IL-2Receptorα)抗體移植排斥OrthocloneOKT3(OrthoBiotech)1998$60MMuromonab鼠抗CD-3(Tcells)抗體移植排斥Simulect(Novartis) 1998$54MBasiliximab嵌合抗CD25(IL-2Receptor)抗體移植排斥……第五十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體類型商品名應(yīng)用鼠源單克隆抗體Orthoclone器官移植排斥嵌合抗體Peopro冠狀動脈成形術(shù)，心絞痛嵌合抗體RituxanB細胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗體Simulect器官移植排斥嵌合抗體Remicade回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人源化抗體Zenapax器官移植排斥人源化抗體Synagis嬰兒呼吸道合胞病毒人源化抗體Herceptin乳腺癌人源化抗體Campath慢性淋巴細胞白血病人源化抗體偶聯(lián)物Mylotarg急性復(fù)發(fā)骨髓白血病鼠源抗體放射性偶聯(lián)物ZevalinB細胞型非霍奇金淋巴瘤第五十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六中國抗體研究現(xiàn)狀單抗診斷劑：針對乙型肝炎表面抗原流行性出血熱抗人T淋巴細胞及亞群風(fēng)疹病毒黑熱病抗人絨毛膜促性腺激素霍亂抗人白細胞相關(guān)抗原抗人免疫球蛋白的系列脊髓灰質(zhì)炎病毒呼吸道合胞病毒登革熱99mTc肺癌單抗片段診斷劑進入I期臨床。單抗治療劑：碘[131I]-肝癌單抗片段注射液，2010年已完成ⅠV期臨床成為低毒、安全、有效的肝癌靶向治療藥物。華神利卡汀2.88w/支乙腦單抗治療劑進入Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗，腎綜合癥出血熱單抗進入Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期臨床。第五十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六中國人源基因工程抗體研究獲重大成果

中國預(yù)防醫(yī)科院病毒所青年科學(xué)家梁米芳研究員率領(lǐng)的課題組，在“治療用人源基因工程抗體基礎(chǔ)與應(yīng)用研究”中取得多項重要成果。在世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒人源基因工程抗體，并獲得擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的全抗體表達載體系統(tǒng)。與血源制品比較，此抗體具有抗體含量高、無免疫源性、無污染源、可連續(xù)規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，是一類新興的特異性抗病毒感染的生物工程藥物。此成果為我國防治病毒性疾病探索出一條新的途經(jīng)，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。

-2004第五十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六原液保存

細菌疫苗工藝流程示意圖菌種篩選種子批的建立及檢定菌種接種原液合并半成品配置殺菌原液收獲擴大培養(yǎng)分裝包裝檢定中國疫苗研究：第五十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六病毒原液保存

病毒疫苗工藝流程毒種篩選種子批的建立及檢定毒種接種#培養(yǎng)細胞原液合并半成品配置病毒滅活病毒的收獲過濾擴大細胞培養(yǎng)分裝包裝檢定原代細胞的制備或傳代細胞復(fù)蘇減毒活疫苗第五十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體的治療應(yīng)用抗腫瘤抗感染抗器官移植排斥反應(yīng)治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病第五十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙人體免疫系統(tǒng)對鼠源蛋白的排斥反應(yīng)抗體人源化是解決問題的唯一途徑第五十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六四.單克隆抗體人源化的改進鼠抗體人源化（人-鼠嵌合、改型抗體）小分子抗體（Fab、單鏈、單域、超變區(qū)多肽）基因工程抗體（雙特異、免疫黏連素、催化抗體）人源抗體（噬菌體抗體庫、轉(zhuǎn)基因小鼠）人-人抗體

第五十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六基因工程抗體研究內(nèi)容：①抗體人源化：鼠單克隆抗體的人源化(嵌合抗體、改型抗體)小分子抗體單價(Fab、ScFv、單域抗體、超變區(qū)多肽)多價（Diabody,Triabody,Minibody）特殊類型抗體(雙特異性抗體、細胞內(nèi)抗體、抗原化抗體、免疫脂質(zhì)體)抗體融合蛋白（免疫粘連素、免疫毒素、催化抗體）②構(gòu)建抗體庫從中篩選新的單抗，即噬菌體抗體。第六十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。第一代第六十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六人鼠嵌合抗體構(gòu)建過程：將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。第六十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。嵌合抗體獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強的人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)反應(yīng)。第六十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合的CDR(complementarydeterminantregion互補決定區(qū))部位(即CDR移植)

2鼠單抗可變區(qū)的人源化－改型抗體第二代第六十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體。第六十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六改型抗體的發(fā)展早期的改型抗體：簡單的CDR移植，通過點突變進行“微調(diào)”即更換某個位點上的氨基酸第二代改型抗體：①應(yīng)用了人抗體基因庫；②引進計算機技術(shù)模擬抗體分子的立體結(jié)構(gòu)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體第六十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體類型商品名應(yīng)用鼠源單克隆抗體Orthoclone器官移植排斥嵌合抗體Peopro冠狀動脈成形術(shù)，心絞痛嵌合抗體RituxanB細胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗體Simulect器官移植排斥嵌合抗體Remicade回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人源化抗體Zenapax器官移植排斥人源化抗體Synagis嬰兒呼吸道合胞病毒人源化抗體Herceptin乳腺癌人源化抗體Campath慢性淋巴細胞白血病人源化抗體偶聯(lián)物Mylotarg急性復(fù)發(fā)骨髓白血病鼠源抗體放射性偶聯(lián)物ZevalinB細胞型非霍奇金淋巴瘤第六十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六FvScFv單域抗體最小識別單位Fab3小分子抗體第六十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入周質(zhì)腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab第六十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽（10-15個氨基酸）第七十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;

在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中;

如果從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_載體上。第七十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式:

一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;

二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。第七十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

(3)單域抗體VH第七十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR第七十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六4雙特異抗體和多價抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年提出。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。

第七十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。即能結(jié)合靶腫瘤細胞又能結(jié)合高細胞毒性的效應(yīng)細胞,將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。第七十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,稱之為抗體融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式，抗體融合蛋白主要分兩種形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）抗原結(jié)合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein,ABFP）抗體融合蛋白第七十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

Fc融合蛋白由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素（immunoadhesin）就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成?？乖Y(jié)合融合蛋白

由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。抗體融合蛋白第七十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六一、免疫粘附素定義將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N-端連接于人細胞表面的受體分子或細胞粘附分子上，在真核細胞中表達出正確折疊的融合抗體蛋白分子，這種分子可同時發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能及其它相應(yīng)的效應(yīng)功能，這種分子被稱為免疫粘附素(immunoadhension)或新效能抗體。第七十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六二、免疫毒素

免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。第八十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第八十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第八十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六三、催化抗體天然抗體體現(xiàn)的是結(jié)合活性，而酶發(fā)揮的是催化活性。如何把這兩者的特點集為一體，從而使抗體也能成為具有催化活性的物質(zhì)，同時也能使酶與有關(guān)的抗原結(jié)合。即催化抗體(catalyticantibody)催化抗體的構(gòu)建主要是把具有催化作用的基團與抗體分子進行重組。第八十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

噬菌體抗體

噬菌體抗體庫(phageantibodylibrary)技術(shù)定義：

通過PCR將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來，并在噬菌體表面表達、分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。

第八十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第八十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六

噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點:外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段第八十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的周質(zhì)腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第八十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六該項技術(shù)的優(yōu)點:

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;

可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);

抗體基因篩選的范圍廣;

技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);

適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產(chǎn)。不經(jīng)過細胞融合及動物免疫等步驟第八十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六第八十九頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六噬菌體抗體庫的分類（一）按抗體基因的性質(zhì)分1.DNA文庫2.cDNA文庫（二）按抗體基因的來源分1．天然抗體庫(nativeantibodylibrary)2．免疫抗體庫3．半合成抗體庫4．全合成抗體庫第九十頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六用SCID小鼠制備人單抗SCID小鼠移植入人淋巴細胞（人鼠嵌合模型）抗原免疫雜交瘤技術(shù)基因工程人單抗第九十一頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六人抗體鼠—將小鼠Ig基因滅活，然后轉(zhuǎn)入人Ig基因，生產(chǎn)出人單抗遺傳工程鼠第九十二頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六基因工程抗體真核細胞高效表達流程圖第九十三頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六單抗研發(fā)的演變歷程鼠單抗100%鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人崁合單抗(66-75%人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect人源化單抗(90-95%人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis100%人源…第九十四頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六抗體在體外人源化存在的問題操作過程復(fù)雜需付出昂貴的代價抗體的親和力降低抗體不是人體免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合第九十五頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六最理想的單克隆抗體100%人源人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生第九十六頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六全人抗體的理論基礎(chǔ)癌癥細胞、病毒、細菌對人機體而言均為異己物人體不斷受異己物攻擊，但免疫系統(tǒng)通常有清除能力免疫系統(tǒng)通過體液免疫和細胞免疫對異己物做出反應(yīng)體液免疫就是針對異己物天然地產(chǎn)生抗體第九十七頁，共一百一十四頁，編輯于2023年，星期六全人抗體面臨的關(guān)鍵問題持續(xù)分泌抗體的人B細胞抗體分泌細胞的保持第九十八頁，共一百一十四頁，編輯于2023