菌種的復(fù)蘇傳代及保存標(biāo)準(zhǔn)程序

菌種的復(fù)蘇傳代及保管尺度程序之宇文皓月創(chuàng)作目的：建立菌種的復(fù)蘇、傳代及保管尺度程序。職責(zé)：質(zhì)管部生物測(cè)定人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。內(nèi)容：菌種的復(fù)蘇與傳代操縱均應(yīng)在生物檢定室陽性比照間或?qū)Ｓ贸瑑艄ぷ髋_(tái)內(nèi)進(jìn)展。操縱中使用過的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗(yàn)完畢后經(jīng)121℃30分鐘高溫滅菌處理。菌種的復(fù)蘇凍干菌種的復(fù)蘇(0預(yù)備：①用具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。〔養(yǎng)分肉湯〕、養(yǎng)分瓊脂〔或改進(jìn)馬丁瓊脂〕斜面數(shù)支。③消毒液：75%酒精、碘酒、0.184操縱：子、培育基移入工作臺(tái)。75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內(nèi)待干。熱，用滅菌滴管吸取液體培育基少許，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口翻開后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內(nèi)。許，加至菌種管底部，將內(nèi)。用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培育基上。下〔30~3523~28℃〕24h。取出培育物〔第1代〕，認(rèn)真觀看菌苔形態(tài)、有無雜菌，需要時(shí)涂片、革蘭氏染色鏡檢，假設(shè)呈典型菌落即可應(yīng)用。如覺察菌型不典型，可進(jìn)展平板分別單菌落。為包管工作用菌株的傳代次數(shù)不超出5干菌種的次數(shù)，可在對(duì)凍干菌種復(fù)蘇的同時(shí)制備局部菌懸液〔1〕2凍存保藏?！?0%無菌甘油〕及滅菌凍存管。1：11.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操縱，將凍干菌復(fù)溶后，吸取菌懸液參加到細(xì)菌凍存液中，混勻。1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。標(biāo)明菌名、編號(hào)及凍存日期等。置-20℃或-80℃條件下冷凍保管。21凍存菌懸液復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種至瓊脂斜面或平板培育基上生長(zhǎng)的純菌1.2.3凍存菌懸液的復(fù)蘇：預(yù)備：1ml②培育基：依據(jù)菌種的特性選擇適宜的液體培育基〔如養(yǎng)分肉湯培育基10ml、硫乙醇酸鹽流體培育基12ml或改進(jìn)馬丁培育10ml〕、瓊脂斜面或平板培育基。③消毒液：75%酒精、0.184操縱：解凍。臺(tái)。75%酒精棉球擦拭菌種凍存管外壁，稍干。點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁翻開菌種凍存管蓋，用一支滅〔生孢梭〕?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培育基上?；鹧嫔献茻⑸鲜鼋臃N后的培育基在規(guī)定溫度下培育〔細(xì)菌在30~3518-2423~2824-48小時(shí)，黑曲霉*5~7〕。認(rèn)真觀看培育物：如呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種，注明菌名、編號(hào)、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內(nèi)保管；如覺察菌苔外形不典型，可進(jìn)展平板分別單菌落。2.菌種的接種、傳代2.1.預(yù)備①用具：接種環(huán)、酒精燈。宜再使用。③消毒液：75%酒精、0.184④菌種：依據(jù)年版《中國(guó)藥典》的要求，傳代次數(shù)〔n〕430衡后再移入接種室內(nèi)或超凈工作臺(tái)。指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊靠近火焰旁。用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管的棉塞，以便接種時(shí)易拔取，再3上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔出棉塞，夾在無名指、小指及掌部，并勿使其與任何物品接觸?；希浜螅瑥男泵嫔咸羧【ι僭S，取出時(shí)，接種環(huán)不克不及通過火焰，應(yīng)在火焰旁快速拔出至接種管內(nèi)液體培育基中，或在瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的概況曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的概況上，留意只劃動(dòng)一次，勿重復(fù)移動(dòng)，且勿使菌苔沾在管壁口。取出接種環(huán)，馬上將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁將菌?！瞡+1〕和接種日期，細(xì)菌管置30~35℃培育18~24小時(shí)；真菌管一般23~2824~48〔5~7〕。并與上代菌種比較，有無雜菌。需要時(shí)涂片，革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種。如覺察菌苔外形不典型，可連續(xù)進(jìn)展平板劃線培育，分別單菌落，選擇典型菌苔接種于養(yǎng)分瓊脂斜面上，代替原有的工作用菌種。檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內(nèi)2~8℃保管，一般1個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。菌種〔第n〕接種至適宜培育基中，在規(guī)定的溫度條件n+1留意：黑曲霉*致病性很強(qiáng)，操縱時(shí)應(yīng)特別留意：①黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)定，其在0.94℃左右的條件下可以保管較長(zhǎng)的時(shí)間，故可將此孢子懸液作為儲(chǔ)藏液在1~2燈操縱。用無菌吸管吹吸管內(nèi)液體，取1～2滴滴在改進(jìn)馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布均勻，置23～28℃5～7的形成。⑤接種傳代后，使用過的器具均需在121℃，30分鐘高壓滅菌后再作處理。菌種的保管：菌懸液凍存法：凍干菌種〔0代〕復(fù)蘇后，可按上述方法制備第1代菌懸液、2短期內(nèi)保管。〔某些特別菌種可用液體培育基〕上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培育，待充分生長(zhǎng)后，把培育好的穎菌種用牛皮紙包好，為減緩培育基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔1個(gè)月移種一次，連續(xù)進(jìn)展保藏。適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、真菌保藏。菌種培育基菌種培育基保管溫度傳種時(shí)間一般多用養(yǎng)分瓊脂或依據(jù)菌種規(guī)定選用培一般多用養(yǎng)分瓊脂或依據(jù)菌種規(guī)定選用培細(xì)菌 4~6℃養(yǎng)基 其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂絲狀真菌 4~6℃ 〔每2個(gè)月移植一等。次〕留意事項(xiàng)：代的培育物。醇酸鹽培育基。是否松動(dòng)或生霉，如有特別應(yīng)準(zhǔn)時(shí)處理。基特征和純度無誤后再連續(xù)保藏。⑤銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，應(yīng)在室溫下保管。菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏3.3.1將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培育基中，培育好備用。10~15ml，加棉121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或枯燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。將上述液體石蠟參加培育好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培育基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏局部霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。留意事項(xiàng)：保藏。種。再移種一次到斜面上即可使用。④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培育基的高度要嚴(yán)格掌握，如太易枯燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。⑥制備無菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不克不及太多，否則分裝到菌種培育基中易造成污染。毀，不得用于慣例檢驗(yàn)。菌種傳代、保管及使用、銷毀均應(yīng)填寫相應(yīng)記錄：《0代菌種保管使用記錄》、《凍存菌種保管使用記錄》、《菌種傳代記錄》、《菌種使用記錄》及《菌種銷毀記錄》。菌種按“檢定菌治理制度”治理。附錄：菌種編號(hào)：傳代復(fù)蘇的菌種應(yīng)有統(tǒng)一編號(hào),編號(hào)方法為:菌種代號(hào)-G或W-代次-管號(hào)。G，W□□-□□□□-□-□〔□〕注：①②③④⑤①菌種代號(hào)：常常使用菌種的代號(hào)見下表：菌種名稱代號(hào)菌種名稱代號(hào)菌種名稱代號(hào)金黃色葡萄球菌JP生孢梭菌SB大腸埃希菌DC銅綠假單孢桿菌TL白色念珠菌BN短小芽孢桿菌DX枯草芽孢桿菌KC黑曲霉HQ藤黃微球菌TH0608202381、2、3、4、5④母代凍存菌種的編號(hào)，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…示意。1、2、3…示意。常常使用工作用菌種的生物學(xué)特征①金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色：圓球形排列成典型的葡萄狀，菌落直徑為0.8～1.5mm，革蘭氏染色陽性。培育特性：⑴在肉湯瓊脂培育基、養(yǎng)分肉湯中，生長(zhǎng)良好。在28～38℃生長(zhǎng)較好，pH4.5～9.8，以pH7.4⑵養(yǎng)分瓊脂平板，培育24～48小時(shí)，形成圓形凸出、邊沿整齊、概況光澤且金黃色的菌落，直徑1～2mm〔應(yīng)選擇光滑型菌落〕。⑶養(yǎng)分肉湯培育基，生長(zhǎng)快速，經(jīng)37℃24小時(shí)培育呈均勻混濁，管底稍有沉淀，微微振搖即可上升，消散均勻。但培育基含有可發(fā)酵糖類或菌型變成粗糙型者，可消滅自然凝集現(xiàn)象，⑷抵抗力：在枯燥狀況下，可生存數(shù)月，在無糖培育基內(nèi)生存1151，75%酒精中須數(shù)格外鐘才被殺死。②藤黃微球菌0.5～3.5um，單個(gè)成雙或四聯(lián)狀排列，或呈不規(guī)章的團(tuán)塊。革蘭氏染色呈陽性。培育特性：專性需氧菌，養(yǎng)分要求不高，最適溫度為25～30℃。在瓊脂平板上培育可形成圓形凸起，光滑、不透亮黃色菌落。在液體培育基中均為混濁生長(zhǎng)。③枯草桿菌，2.0～3.0um0.6～0.9um1.0～1.5um。革蘭氏染色呈陽性，能運(yùn)動(dòng)。培育特性：〕，本菌變異時(shí)可消滅光滑型菌落。狀厚膜，粘附于試管壁上。15～55℃，兼性厭氧或需氧。100℃3，120℃40④短小芽孢桿菌生，橢圓形，有動(dòng)力。30～37℃，生點(diǎn)分歧于枯草桿菌：在瓊脂培育基上，大多數(shù)菌株的菌落為光滑型并變成微黃色，用于檢定的菌種，應(yīng)挑光滑型菌落；有些菌株養(yǎng)分需要生物素〔H〕及氨基酸。⑤大腸埃希菌0.4～0.7um2～4um形成芽孢，革蘭氏染色陰性。色，有金屬光澤。⑥白色念珠菌2.5～4um。色，微凸，邊沿整齊。⑦生孢梭菌狀或梭狀芽孢桿菌，菌體一般較粗0.4～1.2um。革蘭氏染色呈陽性，菌體老化后常可變成陰性。3