高級(jí)生化第章,糖蛋白的概述及蛋白聚糖

4.1.概述

糖類指多羥基醛和多羥基酮及其縮合產(chǎn)物，carbohydrate曾譯為碳水化合物；saccharide更多地與前綴組詞，如monosacchride(單糖)、oligosaccharide(寡糖)和polysaccharide(多糖)等；sugar除表示食糖外還用于表述糖類的組成，常有單糖的含義；glycan則譯為聚糖，是寡糖和多糖的統(tǒng)稱。，糖類僅僅被視為主要的能源物質(zhì)、碳源和結(jié)構(gòu)材料，對(duì)糖類的研究局限于單糖及其代謝，以及淀粉、糖原等少數(shù)多糖。雖然早就發(fā)現(xiàn)糖-肽共價(jià)復(fù)合物，鑒于一些含糖的酶類去掉糖組分之后活性并無(wú)明顯改變，因而把糖組分當(dāng)作雜質(zhì)，千方百計(jì)加以去除。當(dāng)前第1頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(1)復(fù)合糖的分類：復(fù)合糖(complexcarbohydrate)可分為聚糖(glycam)和糖綴合物或糖復(fù)合物(glycoconjugate)。其中聚糖包括同聚糖(homoglycan)和雜聚糖(heteoglycan)；糖綴合物則包括糖肽復(fù)合物(glycopeptedecomplex)、糖脂復(fù)合物(glycolipidcomplex)和糖-核酸復(fù)合物(carbohydrate-nucleicacidcomplex)。糖肽復(fù)合物可分為肽聚糖(peptideglycan)或胞壁質(zhì)(murein)，是細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)材料；糖蛋白(glycoprotein)和蛋白聚糖(proteoglycan)。糖脂可分為糖鞘脂(glycosphingolipid)、糖基?；视?glycosylacylglyceride)和脂多糖(lipopolysaccharide)。當(dāng)前第2頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(2)糖蛋白和蛋白聚糖中常見(jiàn)的單糖組分：

糖復(fù)合物中常見(jiàn)的單糖組分包括4種己糖：D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、L-巖藻糖(L-Fuc)；兩種乙酰化己糖胺：N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；兩種糖醛酸：D-葡萄糖醛酸(GlcA)和L-艾杜糖醛酸(IdoA)；一種戊糖：D-木糖(D-Xyl)以及甘露糖胺與磷酸烯醇式丙酮酸縮合產(chǎn)物，它的4、7、9-位羥基和5-氨基發(fā)生取代產(chǎn)生一系列產(chǎn)物，統(tǒng)稱唾液酸(Sia)，其中最重要的是N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸(NeuNAc)等。當(dāng)前第3頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第4頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第5頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(3)聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性：

糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分盡管由上述為數(shù)有限的幾種單糖組成，但每種單糖有吡喃式與呋喃式結(jié)構(gòu)之分，異頭碳有α-與β-型之分，每個(gè)單糖有多個(gè)羥基，可能以不同的方式形成糖苷鍵和分枝結(jié)構(gòu)。兩種不同的氨基酸可形成兩種二肽；3種不同的氨基酸可形成6種三肽；6種不同的氨基酸可產(chǎn)生176種六肽。而兩種相同的己糖可能形成11種二糖；三種相同的己糖可產(chǎn)生176種三糖；6種不同的己糖則能形成109種六糖，如帶有分枝六糖的數(shù)目可達(dá)1012個(gè)。如果考慮到糖殘基不同部位進(jìn)一步修飾：磷酸化、硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基內(nèi)部脫水成內(nèi)醚等，聚糖的數(shù)目無(wú)疑會(huì)更大。聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加了研究工作的難度，同時(shí)暗示它可以蘊(yùn)含更多的信息，成為生物信息的理想載體。當(dāng)前第6頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(4)糖綴合物的許多重要的性質(zhì)和功能與其糖鏈特有的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了便于表現(xiàn)糖鏈的結(jié)構(gòu)，我們將采用一套流行的簡(jiǎn)化符號(hào)系統(tǒng)(圖4.1)，標(biāo)明糖鏈單糖之間的連接方式及其修飾狀況。當(dāng)前第7頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.1推薦的描述糖鏈結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)化符號(hào)與慣例以一個(gè)復(fù)雜型分枝的雙天線N-聚糖為例。除L-Fuc和L-IdoA外，其余糖基均為D-型；糖鏈中的單糖都是吡喃型(六元環(huán))的；除Sia的糖苷鏈從C2開始，其余糖基的糖苷鏈均從C1開始。當(dāng)前第8頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.糖蛋白(glycoprotein)

廣義的糖蛋白泛指糖肽共價(jià)復(fù)合物。為了研究的方便，目前已將肽聚糖和蛋白聚糖劃分出來(lái)，狹義的糖蛋白專指肽鏈與一個(gè)或多個(gè)聚糖鏈共價(jià)結(jié)合形成的復(fù)合物，其聚糖鏈通常少于15個(gè)單糖殘基（少數(shù)聚糖鏈可能含有200～30個(gè)單糖殘基），且大多數(shù)具有分枝。4.2.1糖蛋白的結(jié)構(gòu)4.2.1.1糖蛋白結(jié)構(gòu)研究

糖蛋白的結(jié)構(gòu)研究包括蛋白質(zhì)部分的結(jié)構(gòu)測(cè)定和糖鏈部分的結(jié)構(gòu)測(cè)定。當(dāng)前第9頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)糖蛋白糖鏈數(shù)目糖鏈平均間距血清糖蛋白

51α1-酸性糖蛋白460胎球蛋白6113人觸珠蛋白13209人α2-巨球蛋白31296牛甲狀腺球蛋白19375人轉(zhuǎn)鐵蛋白2776人IgG2

胰糖蛋白：

124牛胰RNaseB1270DNase1

粘蛋白：

羊領(lǐng)下腺粘蛋白8006豬領(lǐng)下腺粘蛋白~5008膠原：

兔角膜膠原19173牛皮膚膠原8435大鼠皮膚膠原4770兔鞏膜膠原31000表4-1糖蛋白中糖鏈數(shù)目與間距的變動(dòng)當(dāng)前第10頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

(1)聚糖鏈與蛋白質(zhì)的分離：

從糖蛋白釋放完整的N-聚糖可采用專一的肽：N-糖苷酶F水解，也可用肼解裂解。O-聚糖可用內(nèi)切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶水解，或在0.05～0.1mol·L－1NaOH_

mol·L－1NaBH4通過(guò)β-消去反應(yīng)來(lái)完成。反應(yīng)中產(chǎn)生的聚糖還原端被NaBH4還原成對(duì)堿穩(wěn)定的糖醇，以防糖鏈被堿降解。如用3H標(biāo)記的硼氫化鈉，可對(duì)釋放的聚糖還原端進(jìn)行標(biāo)記，便于在分離純化中跟蹤。也可用蛋白酶降解。產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離與純化，得到不同的糖肽和／或聚糖鏈，即可用于結(jié)構(gòu)分析。1當(dāng)前第11頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(2)聚糖的單糖組分分析：

用糖苷酶或酸／堿將上述糖肽水解，把其中的單糖組分轉(zhuǎn)變成熱穩(wěn)定揮發(fā)性衍生物(如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等)，再用氣-液相色譜法(gas-liquidchromatography,GLC)進(jìn)行鑒定和定量，檢測(cè)精度可達(dá)nmol級(jí)。GLC與質(zhì)譜法(massspectrometry,MS)聯(lián)用，檢測(cè)精度可達(dá)10pmol級(jí)。如將單糖還原端進(jìn)行熒光標(biāo)記，再用HPLC(high-pressureliquidchromatoqraphy)與熒光測(cè)儀對(duì)其進(jìn)行鑒定和定量，檢測(cè)精度可達(dá)pmol～fmol水平。1980年代HPAEC-PAC(highpHanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetection)用于單糖組分分析，無(wú)需制備單糖衍生物，檢測(cè)精度可達(dá)5～50pmol水平。氨基糖可用氨基酸分析儀測(cè)定；唾液酸除用靈敏度較低的比色法測(cè)定外，已能利用高靈敏度GLC-MS對(duì)離子化的唾液酸進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)前第12頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(3)糖鏈結(jié)構(gòu)分析：

已發(fā)展了一系列技術(shù)，可對(duì)糖鏈中每個(gè)單糖殘基的異頭結(jié)構(gòu)(α或β)、環(huán)式結(jié)構(gòu)類型(p或f)以及與其它糖殘基連接鍵的位置進(jìn)行測(cè)定。這些方法包括外切糖苷酶消化，利用特異性極高的外切糖苷酶水解糖鏈，再用HPLC、HPTLC(high-performancethin-layerchromatography)和HPCE(high-performancecapillaryelectrophoresis)成套儀器進(jìn)行檢測(cè)，精度達(dá)fmol～pmol級(jí)，可得到糖基連接鏈位置的信息。由于可用的高專一性外切糖苷酶種類有限，這種方法的應(yīng)用有很大的局限性。甲基化分析法利用甲基化等修飾反應(yīng)制備糖衍生物，經(jīng)GLC與質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)，精度可達(dá)0.1～10pmol，可鑒定和定量殘基上特定位點(diǎn)取代以及糖的環(huán)式構(gòu)型。質(zhì)譜法在糖結(jié)構(gòu)分析中可測(cè)定糖環(huán)上鍵的類型與位置，如采用FAB(fast-atombombardment)、LSIMS(liquidsecondaryionmassspectrometry)和MS／MS(tandemmassspectrometry)，檢測(cè)精度可達(dá)fmol～pmol水平。NMR(nuclearmaqneticresonance)用于糖結(jié)構(gòu)分析可測(cè)定糖基的異頭構(gòu)型和鍵的位置，精度達(dá)10pmol～nmol水平，最顯著的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需制備糖衍生物。

當(dāng)前第13頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(4)糖鏈序列分析：

早期曾用外切糖苷酶從糖鏈非還原端依次切下特定的單糖，同樣由于可用的酶種類有限，而且進(jìn)行糖鏈序列分析的糖苷酶純度應(yīng)當(dāng)極高，因而限制了這種方法的應(yīng)用，常用的糖苷酶見(jiàn)表4.2。1980年代之前，糖鏈測(cè)序主要用MS和MS-GLC法，需對(duì)樣品進(jìn)行甲基化、乙酰化等預(yù)處理。1980年后采用FAB-MS和ESI(electrosprayionization)-MS，檢測(cè)精度達(dá)nmol～pmol水平。當(dāng)前第14頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)酶來(lái)

源專

一

性ClostridiumperfringensFucα12Galα-L-巖藻糖苷酶βDiplococcu.spneumoniasGalβ14GlcNAcβ-半乳糖苷酶CanavaliaensiformisManα12/6Manα-甘露糖苷酶DiplococcuspneumoniasGlcNAcβ1glycanβ-D-N乙酰氨基葡萄糖苷酶DiplococcuspneumoniasSiaα23/6Gal神經(jīng)氨酸酶

Siaα26GkNAc內(nèi)切糖苷酶

內(nèi)切β-D-半乳糖苷酶Bacteroidesfragillis-GlcNAcβ1-3Galβα13/4GalNAc-Flavobacteriummeningoseptiumx-ManMan-GlcNAc-GlcNAcβ1Asn-x-ManD-糖苷酶DiplococcuspneumoniasGalβ1-3GalNAcα1Ser/Thr外切糖苷酶N-糖苷酶F表4.2用于聚糖測(cè)序的幾種糖苷酶當(dāng)前第15頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

糖-肽連接鍵的類型

糖蛋白中的聚糖鏈均由其還原端以接枝方式與肽鏈特定部位的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)相連接，主要分為以下兩大類：(1)N-連接鍵：D-GlcNAcβ-Asn，又稱Ⅰ型糖肽鍵，由糖鏈還原端的β-D-GlcNAc殘基C1-OH基與多肽鏈Asn殘基側(cè)鏈酰胺-NH2間縮合，形成C-N糖苷鍵，廣泛分布于許多糖蛋白中。以肽鏈N端-NH2為連接點(diǎn)形成的N-糖-肽鍵迄今僅見(jiàn)于血紅蛋白Alc。(2)O-連接鍵：由糖鏈還原端與含羥基的氨基酸側(cè)鏈-OH間形成C-O糖苷鍵。又可分為：①D-GalNAcα-Ser/Thr，又稱為Ⅱ(i)型糖-肽鍵，分布廣泛。②D-Xylβ-Ser/Thr，又稱Ⅱ(ii)型糖-肽鍵，主要存在于一些蛋白聚糖中。③D-Galβ-Hyl，又稱Ⅲ型糖-肽鍵，主要存在于膠原和絲心蛋白中。④D-Araβ-Hyp，僅見(jiàn)于高等植物中的一些糖蛋白。

當(dāng)前第16頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

β型乳糖Gal（β1→4）Glc蔗糖Fru（β2→1α）Glc繭蜜糖Glc（α1→1α）Glc當(dāng)前第17頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第18頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)區(qū)

別N-聚糖O-GalNAc聚糖糖-肽鍵GlcNAcβ1-N（Asn-x-Ser/Thr）GalNAcα1-O（Ser/Thr）聚糖組成都含Man，GlcNAc,絕大多數(shù)不含GalNAc都含GalNAc,不含Man糖鏈分枝全部分枝不一定分枝糖-肽鍵化學(xué)裂解肼解稀堿水解聚糖內(nèi)側(cè)核心結(jié)構(gòu)都有分枝的五糖Man3GlcNAc2有多種，除GalNAc外，可含Gal或/和GlcNAc表4.3N-聚糖與O-GalNAc聚糖的主要區(qū)別當(dāng)前第19頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

血清糖蛋白多以N-糖肽鍵連接，因而N-聚糖又稱為血清型(plasmatype)。血清型聚糖均由一個(gè)共同的五糖核心和不同數(shù)量的外鏈組成。核心五糖結(jié)構(gòu)如下：Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsnManα1Manα1364.2.1.3N-聚糖的結(jié)構(gòu)根據(jù)核心五糖中兩個(gè)α-Man上連接的糖基，N-聚糖可分為三類：高甘露糖型（high-oroligo-mannosetype)、復(fù)雜型（complextype）和雜合型（hybridtype）。

當(dāng)前第20頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.2三種類型的N-聚糖結(jié)構(gòu)示意圖虛線框內(nèi)為核心五糖。A.高甘露糖型；B.復(fù)雜型；C.雜合型◆■α2α2α2α3α3β4β■■■Asnβ2α3α6■β4β4β■Asnα3/6■α3α6α3β4β4β■α6Asn■α3/6β4β2β4β2α3/6β4α2BACα6α6◆◆β4當(dāng)前第21頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)高甘露糖型當(dāng)前第22頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)復(fù)雜型當(dāng)前第23頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.3復(fù)雜型N-聚糖天線數(shù)及其位置α2α6α3Asnβ2β4■■■■■■■α6α3Asn■■β4β2β6■■■α6α3Asn■■β2β2β6■■α6α3Asn■■β2β4■■β2β6Asn■β2■■α6α3■■β4β4■■β2C2C2二天線C2,4C2三天線C2C2,6三天線C2,4C2,6四天線C2,4C2,4,6五天線當(dāng)前第24頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.4N-聚糖外鏈結(jié)構(gòu)示意圖①見(jiàn)于1型糖鏈；②兼有α2，3和

α2，6Sia的外鏈；③1型H抗原；④無(wú)Fucα1-2者為L(zhǎng)ae抗原；有Fucα1-2者為L(zhǎng)eb抗原；⑤5Lea抗原；⑥見(jiàn)于2型糖鏈；⑦常見(jiàn)的唾液酸化三糖外鏈；⑧2型H抗原；⑨無(wú)Fucα1-2者為L(zhǎng)xe抗原；有Fucα1-2者為L(zhǎng)ey抗原；(10)sLex抗原；(11)僅存在于靈長(zhǎng)類以下的哺乳動(dòng)物；(12)存在于少數(shù)糖蛋白外鏈中LNunitSO4β3■①α6α3β3■②β3■⑥α2β3■③α4α2β3■④α3α2β4■⑨α4α3β3■⑤α3α3β4■⑩α3/6β4■⑦α2β4■⑧α3β4■β4β4■

當(dāng)前第25頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.1.4O-聚糖的結(jié)構(gòu)

GalNAcα-O-Ser/Thr糖肽鍵最早發(fā)現(xiàn)于粘蛋白，因而O-GalNAc聚粘又稱為粘蛋白型(mucintype)。最簡(jiǎn)單情況Ser/Thr只連接一個(gè)GalNAc,見(jiàn)于不多幾種粘蛋白和分泌性糖蛋白中。少數(shù)糖蛋白中Ser/Thr上連接一個(gè)二糖，包括①Siaα2-6GalNAc-；②Galβ1-3GalNAc-；③GlcNAcβ1-3GalNAc-；④Galα1-3GalNAc-。含有兩個(gè)以上糖殘基的O-聚糖可將其結(jié)構(gòu)分為核心、骨架和非還原端三部分。(1)核心：與N-聚糖都只有核心五糖不同，O-GalNAc聚糖至少有7種核心結(jié)構(gòu)，如圖4.5所示；其中核心結(jié)構(gòu)①～④較為常見(jiàn)；核心結(jié)構(gòu)①和③分別是上述二糖②和③；核心②和④有分枝。當(dāng)前第26頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(2)骨架：

指核心結(jié)構(gòu)外側(cè)的延長(zhǎng)部分，與N-聚糖的外鏈相似，基本上由β連接的Gal-GlcNAc二糖單位組成，包括Galβ1-3GlcNAc(1型結(jié)構(gòu))、Galβ1-4GlcNAc(2型結(jié)構(gòu))和(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n以及N-聚糖中不存在的Galβ1-3GalNAcα(3型結(jié)構(gòu))和Galβ1-3GalNAcβ-(4型結(jié)構(gòu))。O-GalNAc聚糖骨架的GalC6位常連有GlcNAcβ1-6分枝，如Galβ1-4GlcNAcβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)Galβ1-結(jié)構(gòu)，i抗原直鏈結(jié)構(gòu)上如形成這種分枝就轉(zhuǎn)變成I抗原。

當(dāng)前第27頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(3)非還原端：

O-GalNAc聚糖的非還原端常是在Gal上連一個(gè)Saiα2-3或在GalNAc上連一個(gè)Siaα2-6。還有相當(dāng)一部分O-GalNAc聚糖末端糖基被硫酸化，雖然糖鏈中部的糖基也可能被硫酸化。O-GalNAc聚糖非還原端部分往往構(gòu)成血型抗原，例如圖4.4中③和⑧分別為1型H和2型H抗原；④則根據(jù)有無(wú)Fucα1-2分別為L(zhǎng)ae和Lbe抗原；⑨則按有無(wú)Fucα1-2分別構(gòu)成Lxe和Lye抗原。在H-1和H-2抗原結(jié)構(gòu)Gal上分別以α1-3鏈連接Gal或GalNAc，就成為B-1、B-2和A-1、A-2抗原。當(dāng)前第28頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.2糖蛋白的生物合成

糖蛋白肽鏈部分的合成由特定基因轉(zhuǎn)錄的mRNA直接編碼，聚糖部分是后加的。N-聚糖的合成在肽鏈合成尚未完成時(shí)即已開始，是伴翻譯(co-translational)過(guò)程，O-聚糖的合成則是翻譯后(post-translational)修飾過(guò)程。糖基化位點(diǎn)的選擇、糖肽鍵的類型以及聚糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)，都是在基因組編碼的一系列特異性酶順序作用下，在細(xì)胞內(nèi)特定的微環(huán)境中形成的，因而可以認(rèn)為聚糖鏈的合成受到基因組嚴(yán)格而精準(zhǔn)的間接控制。當(dāng)前第29頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)活化糖基供體的合成

所有的生物合成都需要把單體事先活化，以利于反應(yīng)朝著合成的方向進(jìn)行。聚糖鏈合成所需要的單糖也必需轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的活化形式，才能在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下參入聚糖。蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)所需活化糖基供體有三種類型：Glc、Gal、GlcNAc、GalNAc、Xy1和GlcA均為UDP-糖基；UDP-GlcA經(jīng)表異構(gòu)酶催化可轉(zhuǎn)化成UDP-IdoA；Man和Fuc為GDP-糖基；Sia則以CMP-Sia為活化供體；此外，UDP-Glc和GDP-Man還能將糖基轉(zhuǎn)移到ER膜中的Dol-P上，以Dol-P-Glc和Dol-P-Man的形式被糖基化反應(yīng)利用。圖4.6簡(jiǎn)要概括了這些活化糖基供體的合成路線與相互轉(zhuǎn)化。當(dāng)前第30頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.6活化糖基供體的生物合成及其相應(yīng)轉(zhuǎn)化帶陰影的矩形框?yàn)榛罨腔┕?；橢圓為單糖；星號(hào)處為控制點(diǎn)當(dāng)前第31頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)N-寡糖的合成

早在1960年代至1970年代，利用重建的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)和凝集素耐受細(xì)胞系闡明了N-聚糖生物合成的基本途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)首先在ER中組裝一個(gè)脂質(zhì)載體連接的寡糖前體，再把這個(gè)寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生肽鏈合適的糖基化位點(diǎn)上，最后在ER和Golgi器中經(jīng)過(guò)一系列剪接加工，形成成熟的糖蛋白。從1980年代開始克隆N-聚糖生物合成涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的基因并延續(xù)至今。這些基因特殊的表達(dá)模式以及它們編碼的酶突出的底物專一性為闡明N-聚糖特殊結(jié)構(gòu)的形成與變化具有重要意義。還注意到胚胎發(fā)生、細(xì)胞活化和腫瘤形成等條件下N-聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，為研究N-聚糖的生物學(xué)功能提供了新的契機(jī)。當(dāng)前第32頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)C=CH3CHCH2(CHCCH3CH3=CHCH2)nCH2CHCH3O－CH2OCH3=PO－圖4.7多萜醇磷酸的結(jié)構(gòu)O(1)多萜醇寡糖前體的組裝：

N-聚糖的前體由14個(gè)特定的單糖連接而成，在所有真核細(xì)胞中這個(gè)寡糖前體的結(jié)構(gòu)是保守的。寡糖前體在磷酸多萜醇上組裝(圖4.7)。動(dòng)物的多萜醇含17～21個(gè)異戊二烯單元，真菌類和植物的多萜醇含有14～24個(gè)異戊二烯單元。多萜醇的極性端通過(guò)焦磷酸與糖相連接，長(zhǎng)長(zhǎng)的烴鏈插入ER膜，把正在合成的寡糖前體錨定在ER膜上。當(dāng)前第33頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

如圖4.8所示，多萜醇焦磷酸寡糖前體組裝的第1步反應(yīng)由GlcNAc-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶把GlcNAc-P從UDP-GlcNAc上轉(zhuǎn)移到給Dol-P,同時(shí)釋放1分子UMP；然后再由GlcNAc轉(zhuǎn)移酶從UDP-GlcNAc上把第二個(gè)GlcNAc轉(zhuǎn)移到Dol-PP-GlcNAc上，同時(shí)釋放1分子UDP。接下來(lái)，在第2步反應(yīng)中由5種不同的Man轉(zhuǎn)移酶以GDP-Man為糖基供體，依次添加5個(gè)Man。通過(guò)尚不完全了解的機(jī)制，Dol-PP-GlcNAc2-Man5穿越ER膜翻轉(zhuǎn)到ER腔(步驟3)。4個(gè)GDP-Man在ER膜胞液一側(cè)把Man轉(zhuǎn)移到Dol-P上，生成的Dol-P-Man翻轉(zhuǎn)到ER腔（步驟4和5）。在ER腔，4種Man轉(zhuǎn)移酶以Dol-P-Man為活化糖基供體，向Dol-PP-GlcNAc2Man5再添加4個(gè)Man殘基(步驟6)。3個(gè)UDP-Glc在ER胞液一側(cè)把Glc轉(zhuǎn)移到Dol-P上，生成的Dol-P-Glc也翻轉(zhuǎn)到ER腔(步驟7和8)。最后，由Glc轉(zhuǎn)移酶以Dol-P-Glc為糖基供體添加3個(gè)Glc殘基(步驟9)，完成Dol-PP-GlcNAc2Man9Glc3

寡糖前體寡糖前體的組裝。當(dāng)前第34頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

多萜醇焦磷酸寡糖前體的合成過(guò)程涉及拓?fù)渥兓Ｕ鐖D4.8所示，反應(yīng)1、2、4和7都發(fā)生在ER胞液一側(cè)，反應(yīng)6、9和10都發(fā)生在ER腔內(nèi)。反應(yīng)2形成的中間產(chǎn)物和反應(yīng)6、9所需要的糖基供體都必需在ER膜中翻轉(zhuǎn)到ER腔。盡管目前尚不清楚這種翻轉(zhuǎn)移位的機(jī)制，但用糖基化抑制劑、內(nèi)翻外的粗糙型ER囊泡進(jìn)行的研究都直接或間接證明了上述中間產(chǎn)物翻轉(zhuǎn)移位的事實(shí)。當(dāng)前第35頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.8多萜醇焦磷酸寡糖前體的合成途徑當(dāng)前第36頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(2)寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生肽鏈上：

上述完成組裝的寡糖前體已具備了轉(zhuǎn)移到新生肽鏈上的條件，當(dāng)肽鏈中出現(xiàn)合乎要求的Asn殘基(Asn-x-Ser/Thr)時(shí)，包括14個(gè)糖殘基的寡糖前體整體轉(zhuǎn)移，同時(shí)釋放1分子Dol-PP，再翻轉(zhuǎn)到ER胞液面(步驟10和11)，其后經(jīng)磷酸酶作用Dol-PP失去一個(gè)磷酸基，又變成Dol-P，可以參與下一輪寡糖前體合成(步驟12)。寡糖前體的轉(zhuǎn)移是由ER膜中的寡糖轉(zhuǎn)移酶(oligo-sacharyltransfrase,OST)催化的。酵母OST復(fù)合物至少包含9種不同的亞基：Ostlp、Ost3p、Wbp1p、Stt3p、Ost6p、Swplp、Ost2p、Ost5p和Ost4p，所有這些亞基都是跨膜蛋白，有1～8個(gè)跨膜域，其中Ost1p對(duì)其活性必不可少(圖4.9)。寡糖前體末端的3個(gè)Glc顯然是其轉(zhuǎn)移信號(hào)，OST可識(shí)別其非還原端的3個(gè)Glc和還原端的GlcNAc，如果切掉最外側(cè)的兩個(gè)Glc，其轉(zhuǎn)移活性只剩下1/9；如將3個(gè)Glc全部切掉，就不能再被轉(zhuǎn)移。OST同樣具備識(shí)別多肽鏈中合適糖基化位點(diǎn)的能力。當(dāng)前第38頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.9ER膜上的OST復(fù)合物催化十四寡糖從Dol-pp-寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生多肽鏈中合適的Asn殘基上OSTComplex60S40S當(dāng)前第39頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(3)N-糖鏈的加工和成熟：

結(jié)合在肽鏈上的十四寡糖首先被ER中的葡萄糖苷酶Ⅰ切去非還原端Glcα1-2殘基，再由α-葡萄糖苷酶Ⅱ切下另外2個(gè)Glc殘基。切除Glc不僅是開啟后續(xù)加工的信號(hào)，而且與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)。如果糖蛋白折疊不適當(dāng)，即可被ER腔一種UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并重新糖基化，帶有Glc-Man9-GlcNAc2寡糖的不當(dāng)折疊蛋白質(zhì)即可被ER腔中的一種有糖結(jié)合活性的分子伴侶鈣連蛋白(calnexin)識(shí)別并結(jié)合，然后結(jié)合于多肽鏈部分，把十二寡糖的Glcα1-3Man-暴露給α-葡萄糖苷酶Ⅱ。α-葡萄糖酶Ⅱ和UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶交替作用，直至多肽鏈正確折疊。正確折疊的肽鏈糖基化位點(diǎn)附近的疏水片段不再暴露，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶不再結(jié)合，最后一個(gè)Glc被切去，鈣連蛋白解離，寡糖的加工繼續(xù)進(jìn)行(圖4.10)。當(dāng)前第40頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.10ER鈣連蛋白(calnexin)在糖蛋白的折疊中的功能GlcaseⅠ和Ⅱ?yàn)棣?葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ，Glc-T為UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶當(dāng)前第41頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)上述帶有十一寡糖Man9-GlcNAc2-糖蛋白隨即被ER中的α-甘露糖苷酶Ⅰ切去核心糖α1-6臂上的α1-3分枝末端α1-2連接的Man殘基，生成的Man8GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)即可進(jìn)入Golgi體繼續(xù)加工。有些糖蛋白的Man8GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)可被一種特殊的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶識(shí)別，在兩個(gè)α1，2連接的末端Man內(nèi)側(cè)Man上各轉(zhuǎn)移一個(gè)GlcNAc-P-基團(tuán)，然后再由一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切去GlcNAc,把磷酸基留在ManC6位。這種有Man-6-P的寡糖是糖蛋白被分揀和運(yùn)輸?shù)饺苊阁w關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信號(hào)。上述反應(yīng)在ER/Golgi中確切的定位尚不明確。另一些糖蛋白則可在Golgi器α-甘露糖苷酶Ⅰ作用下，切去以α1-2連接的其余3個(gè)Man殘基。當(dāng)前第43頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

除上述逐步加工途徑外，ER中還有一種內(nèi)切α-甘露糖苷酶，可切除Glc-Man9–GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)末端的Glc1-3Man,生成的Man8GlcNAc2-Asn進(jìn)入Golqi體，由其中的α-苷露糖苷酶Ⅰ切去3個(gè)α1-2連接的Man(圖4.11)。當(dāng)前第44頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.11ER和Golgi體內(nèi)N-寡糖的加工GlcNAc-P-T:N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶；GlcNAcase:N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。當(dāng)前第45頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

在Golgi體內(nèi)，上述Man5GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)如繼續(xù)添加Man，可形成高甘露糖型N-聚糖。如果由N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ在核心結(jié)構(gòu)α1，3臂的Man上添加一個(gè)β1-2連接的GlcNAc，或由α-甘露糖苷酶Ⅱ繼續(xù)切除α1-6臂上的兩個(gè)Man，再添加適當(dāng)糖基，可形成雜合型N-聚糖。如果Man5GlcNAc2-Asn結(jié)構(gòu)在α-甘露糖苷酶Ⅲ作用下切去α1-6臂上兩個(gè)Man，再由N-乙酰氨基葡萄基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ添加1個(gè)GlcNAc，產(chǎn)物再由N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ作用在α1-6連接的Man上以β1-2連接1個(gè)GlcNAc，產(chǎn)物還可由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在Asn連接的GlcNAc上以α1-6連接一個(gè)Fuc,生成的寡糖都可以成為復(fù)雜型N-聚糖的“核心”部分(圖4.12)。當(dāng)前第46頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.12Golgi體中產(chǎn)生高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型N-聚糖的基本途徑GlcNAc-TⅠ，-TⅡ：N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ，Ⅱ當(dāng)前第47頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

上述復(fù)雜型N-聚糖“核心”在不同糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，順序添加糖基，形成各具特點(diǎn)的聚糖鏈。圖4.13出示了幾種雙天線復(fù)雜型N-聚糖的合成路線，包括末端為α1-3連接的Fuc、α2-3/6連接的Sia以及β1-4連接的GlcNAc4-SO4殘基的外鏈。當(dāng)前第48頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.13幾種雙天線復(fù)雜型N-聚糖的合成β1-4GaT為β1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；β1-4GlcNAcT為β1-4N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶；α1-3Fuc為α1-3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；ST6Ga1-1為CMP-Sia：Galα2-6唾液酸轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ當(dāng)前第49頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

上述外鏈延伸和修飾主要在trans-Golgi垛疊和trans-Gogli網(wǎng)絡(luò)(TGN)中進(jìn)行(參看圖3.31)。除β1-4GalT外，還有一種β1-3GlcNAcT-i，二者交替作用，合成(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n。外鏈帶有Gal的N-聚糖進(jìn)入TGN后，在非還原端添加Sia而終止外鏈的合成。N-聚糖“核心”在β1-4N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶和GlcNAc-4硫酸轉(zhuǎn)移酶相繼作用下完成4位硫酸化的外鏈合成。β1-4GlcNAcT對(duì)受體糖鏈(雜合型或雙天線復(fù)雜型)有專一性，能識(shí)別LH和TSH肽鏈糖基化位點(diǎn)氨基一側(cè)含有Arg(或Lys)的序列。接于外鏈GlcNAc上的Fuc由α1-3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化。高等動(dòng)物至少有5種α1-3FucT,分別為Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ，有組織分布專一性。其中Ⅲ型α1-3FucT以2型糖鏈為受體時(shí)形成Fucα1-3連接；以Ⅰ型糖鏈為受體時(shí)則形成Fucα1-4連接，是“一種糖基轉(zhuǎn)移酶只形成一種糖苷鍵”這一法則唯一的例外。當(dāng)前第50頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

多天線N-聚糖的合成涉及6種不同的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GlcNAcT),其中GlcNAcT-Ⅰ和T-Ⅳ作用于核心五糖α1-3臂Man，分別形成β1-2和β1-4連接鍵；GlcNAcT-Ⅱ、T-Ⅴ和T-Ⅵ作用于α1-6臂Man，分別形成β1-2、β1-4和β1-6連接鍵(圖4.14)。合成單天線只需要GlcNAcT-Ⅰ；雙天線需要GlcNAcT-Ⅰ和T-Ⅱ；C2，4，C2三天線需要GlcNAcT-Ⅰ、T-Ⅳ和T-Ⅱ；C2，2，6三天線需要GlcNAcT-Ⅰ、T-Ⅱ和T-Ⅴ；合成四天線則需要GlcNAcT-Ⅰ、Ⅳ、Ⅱ、Ⅴ；GlcNAcT-Ⅲ負(fù)責(zé)合成平分型GlcNAc。這6種GlcNAcT均以UDP-GlcNAc為糖基供體，而受體各不相同，有嚴(yán)格的糖基序列專一性，因而它們的作用先后也有嚴(yán)格的順序：GlcNAcT-Ⅰ最先作用，其次是GlcNAcT-Ⅱ，然后是α-甘露糖苷酶Ⅱ，接下來(lái)是GlcNAcT-Ⅳ和T-Ⅴ，最后是GlcNAcT-Ⅲ。C當(dāng)前第51頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.146種GlcNAcT(1～Ⅵ)的作用位置及形成的糖苷鍵當(dāng)前第52頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第53頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.2.3O-GalNAc聚糖的合成

O-GalNAc聚糖的合成是在已折疊的蛋白質(zhì)表面適當(dāng)?shù)腟er/Thr上逐個(gè)添加糖基。O-GalNAc糖基化的發(fā)生比N-糖基化要晚，尚不能確定加上第一個(gè)GalNAc的確切亞細(xì)胞定位。很可能不同的糖蛋白O-GalNAc糖基化起始部位也不同，可以在ER、過(guò)渡小泡或cis-Golgi扁囊。起始之后，O-GalNAc聚糖其它糖基的添加、糖鏈延伸和非還原端形成都發(fā)生在Golgi體內(nèi)。O-GalNAc聚糖合成起始步驟由多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcT)催化。哺乳動(dòng)物至少可編碼8種ppGalNAcT，其中的4種(ppGalNAcT-1～4)已進(jìn)行了體外重組研究。多種GalNAcT同工酶很可能有差異地定位于不同的亞細(xì)胞區(qū)隔，與一些糖蛋白糖基化作用的組織和細(xì)胞類型專一性有關(guān)?？蓪-GalNAc聚糖酶合成劃分為三個(gè)階段：核心結(jié)構(gòu)的合成；糖鏈延伸和分枝；非還原端的形成。當(dāng)前第54頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(1)核心結(jié)構(gòu)的合成：O-GalNAc聚糖至少有7種核心結(jié)構(gòu)，都是在GalNAc被ppGalNAcT添加到肽鏈上之后，再由有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶順序添加糖基形成的(圖14.15)。核心1β1-3半乳基轉(zhuǎn)移酶(corelGalT)負(fù)責(zé)把1個(gè)Gal以β1-3鍵連接到GalNAcα-Ser/Thr上，形成核心1。已在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)至少3種corelGalT，可能也存在一個(gè)像ppGalNAcT一樣的家族，有差別地在特定的組織和細(xì)胞類型中表達(dá)，并表現(xiàn)出底物選擇性。核心2β1-6N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(core2GlcNAcT)把1個(gè)GlcNAc以β1-6鍵連接到核心1GalNAc殘基上，形成核心2。核心3β1-3GlcNAcT轉(zhuǎn)移酶(core3GlcNAcT)把1個(gè)GlcNAc以β1-3鍵連接到GalNAcα-Ser/Thr上，形成核心3。由于core3GlcNAcT與core1GalAT都要利用相同的糖基受體，與core2GlcNAcT利用相同的糖基供體和相似的受體，因而在某些情況下，它們之間會(huì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)。核心4β1-6N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)把另一個(gè)GlcNAc以β1-6鍵連接到核心3的GlcNAc殘基上，產(chǎn)生核心4。另外三種出現(xiàn)頻率較低的核心結(jié)構(gòu)分別由core5GalNAcT、core6GlcNAcT和core7GalNAcT以GalNAcα-Ser/Thr為糖基受體而生成的。當(dāng)前第55頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.15GalNAc聚糖核心結(jié)構(gòu)的合成當(dāng)前第56頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)(2)糖鏈的延伸和分枝：

糖鏈延伸就是在上述核心結(jié)構(gòu)上逐個(gè)添加糖基，通常是β1-3連接的GlcNAc或β1-4連接的Gal。例如由β1-3GlcNAcT在核心1或核心2的Gal上添加一個(gè)GlcNAcβ1-3，或由β1-4GalT在核心2，3，4中β1-3GlcNAc或β1-6GlcNAc殘基外側(cè)添加β1-4連接的Gal。其次，還有β1-6GlcNAcT、β1-3GalT參與鏈延伸，形成前面1～4型骨架結(jié)構(gòu)（圖4.16）。β1-3GlcNAcT和β1-4GalT交替作用，可形成LN重復(fù)序列（圖4.17）。當(dāng)前第57頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.161型和2型骨架的合成當(dāng)前第58頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.17多聚N-乙酰乳糖胺的合成當(dāng)前第59頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

外鏈骨架上的Galβ1-4可接受β1-6GlcNAcT轉(zhuǎn)移的GlcNAcTβ1-6殘基而形成分枝（圖4.18）。這個(gè)酶不同于參與N-聚糖合成的GlcNAcT-V和參與核心2和核心4合成的GlcNAcT，只能以O(shè)-GlcNAc聚糖外鏈中的Galβ1-4為糖基受體。參與O-GalNAc聚糖核心和骨架合成的糖基轉(zhuǎn)移酶具有嚴(yán)格的底物序列專一性，因而作用有一定的先后順序。例如核心1的Gal上接受1個(gè)β1-3連接的GlcNAc后，就不能作為core2GlcNAcT的底物。同樣，核心2中的Gal可接受1個(gè)β1-3連接的GlcNAc，然后才能在Gal上連接β1-6GlcNAc。這種3位取代抑制6位取代的現(xiàn)象被稱為“3先于6（three-before-six）”規(guī)律。當(dāng)前第60頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.18由線性多聚乳糖（i抗原）生成β1-6分枝多枝多聚乳糖胺（I抗原）示意圖當(dāng)前第61頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（3）非還原端的形成：

O-GalNAc聚糖的非還原端大致可通過(guò)三種方式形成：唾液酸化、硫酸化和巖藻糖基化。其中硫酸化只能對(duì)原來(lái)的非還原端糖基進(jìn)行修飾。α2-3唾液基轉(zhuǎn)移酶家族至少已發(fā)現(xiàn)5個(gè)成員（ST3Gal-I、ST3Gal-Ⅱ、ST3Gal-Ⅲ、ST3Gal-Ⅳ和ST3Gal-Ⅴ）負(fù)責(zé)以α2-3鍵在末端Gal上引入一個(gè)Sia殘基。這些酶的表達(dá)有組織專一性，只作用于O-聚糖和某些糖脂末端的Gal（圖4.19）。當(dāng)前第62頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.19糖鏈末端Gal的α2-3唾液酸化

括號(hào)內(nèi)的酶在體外系統(tǒng)活性相對(duì)較低當(dāng)前第63頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

帶有α2-3Sia的聚糖通常不再接受其它酶進(jìn)一步的修飾。糖鏈末端或次末端甚至內(nèi)部的GalNAc殘基可α2-6唾液酸化。催化該反應(yīng)的α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族至少存在5個(gè)成員（ST6Gal-I、ST6GalNAc-I、ST6GalNAc-Ⅱ、ST6GalNAc-Ⅲ和ST6GalNAc-Ⅳ）（圖4.20）。末端α2-6唾液酸化的聚糖通常也不接受進(jìn)一步的修飾。此外，還有一個(gè)α2-8唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族，在糖蛋白和某些糖脂上合成α2-8連接的線性多聚唾液酸。當(dāng)前第64頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.20GalNAc的α2-6唾液酸化括號(hào)內(nèi)的酶在體外系統(tǒng)相對(duì)活性較低當(dāng)前第65頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

聚糖硫酸化通常出現(xiàn)在Gal、GalNAc、GlcNAc、GlcA和IdoA上，這些硫酸化的糖基可以是非還原端的也可能是內(nèi)部的。反應(yīng)由硫酸轉(zhuǎn)移酶家族催化，以PAPS為活性硫酸供體。例如唾液酸化的LewisX抗原末端四糖為β1-3GlcNAc（α1-3Fuc）β1-4Galα2-3Sia中的Gal第6位被硫酸化或GlcNAc第4位被硫酸化，或者二者均被硫酸化。硫酸化還可發(fā)生在末端Gal和GlcNAc第4位、GlcA第3位等位點(diǎn)上。部分聚糖鏈（尤其是血型抗原）合成中，非還原端Gal的巖藻糖基化是必需步驟，反應(yīng)由α1-2FucT催化。此外，還有α1-3FucT催化外鏈中GlcNAc的α1-3巖藻糖基化以及N-聚糖與Asn相連的GlcNAc的α1-6巖藻糖基化（參看N-聚糖加工成熟有關(guān)敘述）。當(dāng)前第66頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.2.4糖蛋白生物合成的調(diào)控（1）糖基化位點(diǎn)的選擇：

據(jù)統(tǒng)計(jì)，多肽鏈中的N-糖基化位點(diǎn)Asn-x-Ser/Thr三聯(lián)序列子大約只有三分之一被N-糖基化，說(shuō)明決定是否糖基化還有很多因素。如①這個(gè)三聯(lián)序列如處于親水片段才能被N-糖基化。②三聯(lián)序列子約70%處于β-轉(zhuǎn)角，N-糖基化的幾率最高；約20%處于β-折疊，而10%處于α-螺旋中的三聯(lián)序列子N-糖基化幾率最低。③三聯(lián)序列子中的X也明顯影響N-糖基化效率。如狂犬病病素糖蛋白37～39位的Asn-Leu-Ser糖基化率為43%，把Leu38分別突變成Glu、Asp、Trp和Pro，糖基化率依次遞減為24%、19%、5%和0；如X為Cys，可因形成二硫鍵降低N-糖基化幾率。④鄰近三聯(lián)序列子的氨基酸也可影響其糖基化率，如為Pro則降低糖基化率，羥基氨基酸則促進(jìn)N-糖基化。

當(dāng)前第67頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

盡管對(duì)許多O-糖基化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列進(jìn)行了對(duì)比和分析，至今尚未找出一致序列。許多O-糖基化位點(diǎn)Ser/Thr附近多為Ala、Ser、Thr等，－1和＋3位多為Pro，沒(méi)有帶電荷的殘基，大多數(shù)處于β-轉(zhuǎn)角。

常識(shí)告訴我們，蛋白質(zhì)是否被糖基化？在何處糖基化？合成什么樣的聚糖鏈？都與蛋白質(zhì)自己的結(jié)構(gòu)有密切的聯(lián)系，只是現(xiàn)在所知尚少。當(dāng)前第68頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（2）糖基供體的可利用性：活化糖基供除CMP-Sia在核內(nèi)合成，其余的都在胞液中合成，ER-Golgi膜上的糖核苷酸運(yùn)輸系統(tǒng)必然影響糖基供體的可利用性，從而對(duì)糖基化作用進(jìn)行調(diào)控。利用ER-Golgi膜微囊以及運(yùn)輸系統(tǒng)有缺陷的突變體細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，Golgi體擁有的運(yùn)輸系統(tǒng)如圖4.21所示，而ER擁有其中UDP-Glc、UDP-GlcA、ATP、UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的運(yùn)輸系統(tǒng)。這些運(yùn)輸系統(tǒng)實(shí)際上是雙向搬運(yùn)工，一方面把活化糖基供體運(yùn)入ER-Golgi腔內(nèi)，使它們的濃度增加10～50倍，足以達(dá)到或超過(guò)估算的多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)其糖基供體的Km，保證了糖基化反應(yīng)對(duì)供體的需求；另一方面，糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的5′-NMP不僅抑制運(yùn)輸裝置，還強(qiáng)烈抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，及時(shí)將其移出ER-Golgi腔對(duì)保證糖基轉(zhuǎn)移酶有足夠的活性很重要。作為整個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制的一環(huán)，上述運(yùn)輸系統(tǒng)顯然是不可或缺的。當(dāng)前第69頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.21Golgi膜上糖-核苷酸、ATP和PAPS的運(yùn)輸系統(tǒng)當(dāng)前第70頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（3）遺傳控制：

除了不多幾種加工性糖苷酶，聚糖生物合成主要涉及糖基轉(zhuǎn)移酶。大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是膜蛋白，迄今已研究過(guò)的Golgi糖基轉(zhuǎn)移酶均為Ⅱ型膜蛋白：短的N-端在細(xì)胞溶膠內(nèi)，單跨膜，巨大的C-端催化域位于膜的非胞液一側(cè)。與溶酶體中P-6-Man合成有關(guān)的兩個(gè)酶：N-乙酰氨基葡萄糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶和α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶為Ⅰ型膜蛋白，N-端催化域在Golgi腔內(nèi)。糖基轉(zhuǎn)移酶顯著的特點(diǎn)是具有極高的底物專一性，即對(duì)糖基供體和受體的結(jié)構(gòu)有高度選擇性，前一個(gè)酶的產(chǎn)物優(yōu)先被另一糖基轉(zhuǎn)移酶用作后續(xù)糖基化的受體底物，結(jié)果一組相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶按一定的順序作用，以非凡的精確度把單糖基彼此連接成特定的聚糖。當(dāng)前第71頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

人體紅細(xì)胞A、B、O（H）血型抗原是說(shuō)明聚糖結(jié)構(gòu)受基因型間接控制的良好范例。圖4.22出示了1～4型A、B、O（H）血型抗原結(jié)構(gòu)。A、B、O（H）抗原的合成起始于α1-2Fuc轉(zhuǎn)移酶對(duì)前體聚糖的修飾。人類基因組的H基因編碼一個(gè)Hα1-2FucT，Se基因編碼一個(gè)Seα1-2FucT，前者在紅細(xì)胞中表達(dá)，利用2型和4型聚糖前體；后者在消化道、呼吸道、生殖道和唾液腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，利用1型和3型聚糖前體，合成分泌型血型抗原，分泌到血漿中，被紅細(xì)胞吸附于表面。α1-2FucT把1個(gè)Fuc以α1-2鍵連接到1～4型聚糖前體的非還原端Gal殘基上，形成O（H）抗原。A基因型ABO基因座位的A基因編碼一種α1-3GalNAcT（A轉(zhuǎn)移酶），在H抗原的Gal上添加1個(gè)α1-3連接的GalNAc,成為A抗原。B基因型ABO基因座位的B等位基因編碼一種α1-3GalT（B轉(zhuǎn)移酶），在H抗原的Gal上添加1個(gè)α1-3連接的Gal，形成了B抗原（圖4.23）。當(dāng)前第72頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第73頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)當(dāng)前第74頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.22A、B、O（H）、血型抗原的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第75頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

O基因型的O等位基因缺258位堿基，結(jié)果不能編碼有活性的酶，不能對(duì)H抗原進(jìn)一步修飾。AB血型的人既有α1-3GalNAcT，又有α1-3GalT，所以同時(shí)擁有A抗原和B抗原。A轉(zhuǎn)移酶和B轉(zhuǎn)移酶要求其糖基受體末端β1-3（4）Gal必須α1-2巖藻糖基化。當(dāng)前第76頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.23A、B、O（H）血型抗原的合成當(dāng)前第77頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

Bombay基因型個(gè)體因α1-2FucT缺失而不能進(jìn)行巖藻糖基化，或者先被唾液酸化，A轉(zhuǎn)移酶或B轉(zhuǎn)移酶都不再利用它作為底物。所以Bombay型的人既沒(méi)有H抗原，也沒(méi)有A抗原和B抗原,再次表明，在糖基轉(zhuǎn)移酶組成的聚糖裝配線上，位置越靠前的酶，一旦出現(xiàn)缺失影響的聚糖結(jié)構(gòu)越多。人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的IgM可與相應(yīng)的ABO抗原相互作用。O型個(gè)體可產(chǎn)生抗A抗原的抗體和抗B抗原的抗體，血液中都保持相當(dāng)高的IgM效價(jià)；A型個(gè)體血漿中含有相當(dāng)多的抗B抗原的IgM抗體；B型個(gè)體血漿中含有很高的抗A抗原的IgM抗體；而AB型個(gè)體既不產(chǎn)生抗A抗原的IgM，也不產(chǎn)生抗B抗原的IgM。血漿中的IgM抗體能與“異己的”紅細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，并激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致低血壓、休克、腎衰竭、循環(huán)衰竭甚至死亡。因此必需對(duì)供血者和受血者進(jìn)行正規(guī)的交叉匹配，以避免發(fā)生輸血反應(yīng)。當(dāng)前第78頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)合成A抗原的A轉(zhuǎn)移酶與合成B抗原的B轉(zhuǎn)移酶同屬一個(gè)α1-3Gal轉(zhuǎn)移酶家族，它們之間只有4個(gè)氨基酸不同，它們的基因也只有4個(gè)堿基不同：氨基酸殘基位置176235266268A轉(zhuǎn)移酶的殘基及密碼子Arg(CGC)Gly(GGC)Lys(CTG)Gly(GGG)B轉(zhuǎn)移酶的殘基及密碼子Gly(GGC)Ser(AGC)Mct(ATG)Ala(GCG)當(dāng)前第79頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

研究表明，不同種屬的同一組織或同一種屬的不同組織中，相同肽鏈上連接的聚糖并不相同，即聚糖結(jié)構(gòu)具有種屬和組織專一性。例如質(zhì)膜糖蛋白γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT），人和牛的腎γ-GT聚糖結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，主要區(qū)別為①人腎γ-GT的N-聚糖全部為復(fù)雜型，而牛腎γ-GT含10%高甘露糖型；②人腎γ-GT含酸性聚糖僅31%，且均為C2,4C2三天線，而牛腎γ-GT含62%的酸性聚糖，除三天線外還有二天線和四天線；③人腎γ-GT的天線外鏈有60%以上的GlcNAc與α1，3Fuc相連，且有LN重復(fù)序列，而牛腎γ-GT沒(méi)有外鏈Fuc和LN重復(fù)序列。同一物種的腎γ-GT的N-聚糖全部含有平分型GlcNAc，而其肝γ-GT則幾乎完全沒(méi)有平分型GlcNAc。4.2.2.5糖鏈結(jié)構(gòu)的微觀不均一性（microheterogenity）當(dāng)前第80頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

此外，同一個(gè)體同一組織中不同糖蛋白也表現(xiàn)出糖鏈結(jié)構(gòu)的不均一性。例如同樣在人肝中合成的γ-GT與運(yùn)鐵蛋白（Tf），γ-GT的N-聚糖約2/3為二天線，其余1/3為三天線和四天線，其中四天線聚糖約1/3含LN重復(fù)序列，而Tf超過(guò)95%都是不含LN重復(fù)序列的二天線N-聚糖。即使是同一蛋白，其中不同的N-糖基化位點(diǎn)所連接的N-聚糖結(jié)構(gòu)也不盡相同。上述聚糖結(jié)構(gòu)的這種不均一性又被稱為糖形（glycoform）。圖4.24出示大鼠胸腺細(xì)胞和腦中Thy-1糖蛋白3個(gè)位點(diǎn)上聚糖結(jié)構(gòu)的變化。盡管肽鏈結(jié)構(gòu)完全相同，但在這兩種細(xì)胞中這3個(gè)糖基化點(diǎn)上的聚糖不盡相同，甚至同一位點(diǎn)上聚糖結(jié)構(gòu)也有明顯改變。當(dāng)前第81頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.24大鼠Thy-1中N-聚糖的不均一性存在率<2%的N-聚糖略去不計(jì)。圓圈的符號(hào)：M代表高甘露糖型；S代表唾液酸化復(fù)雜型；L代表有LN重復(fù)序列；H代表雜合型；C代表中性復(fù)雜型；F代表有核心巖藻糖當(dāng)前第82頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

造成聚糖結(jié)構(gòu)不均一性的確切機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為，參與聚糖生物合成的主要酶系統(tǒng)幾乎全定位于ER-Golgi膜系統(tǒng)。這是個(gè)動(dòng)態(tài)膜系統(tǒng)，其中的酶，尤其是各種糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，在不同種屬、不同的組織中或同一組織不同的發(fā)育階段和不同的生理病理?xiàng)l件下，這些酶的相對(duì)活性會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致聚糖結(jié)構(gòu)出現(xiàn)各種微妙的變化。聚糖結(jié)構(gòu)不均一性有什么生物學(xué)功能同樣也不清楚，不過(guò)有的聚糖結(jié)構(gòu)改變已被當(dāng)作感染某些疾病或發(fā)育階段的標(biāo)志加以利用。4.2.3糖蛋白的降解當(dāng)前第83頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)溶酶體是糖蛋白的降解場(chǎng)所，在一系列蛋白酶和糖苷的聯(lián)合作用下，經(jīng)歷一個(gè)有序的、常常是高度專一的過(guò)程被徹底降解，釋放出的氨基酸和單糖可被細(xì)胞重復(fù)利用。溶酶體內(nèi)至少有60多種水解酶，包括組織蛋白酶、脂酶、核酸酶、糖苷酶等，幾乎可以作用于糖蛋白中每一種鍵。這些糖苷酶有可溶性酶和膜結(jié)合酶，大多數(shù)具有4.0～5.5的最適pH，例如α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶，α-甘露糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-巖藻糖苷酶等外切糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖-天冬酰胺酶等內(nèi)切酶。外切糖苷酶一般僅識(shí)別糖鏈非還原端的一個(gè)（偶而兩個(gè)）單糖殘基及其形成的糖苷鍵，因而有較廣泛的專一性，但這些酶通常不能作用于經(jīng)硫酸化、乙酰化等修飾的糖基。內(nèi)切糖苷酶似乎更能容忍糖鏈中對(duì)糖基的修飾，有時(shí)甚至需要某些修飾才能達(dá)到最佳催化效果。

當(dāng)前第84頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

N-糖基化的蛋白質(zhì)一般先由蛋白酶在其未被糖鏈覆蓋的部分開始水解，肽鏈降解為一定的片段后才開始降解N-聚糖。N-聚糖的降解過(guò)程如圖4.25所示，通常先切除核心的α1-6Fuc，再由β-N-乙酰氨基葡萄糖-天冬酰胺酶和內(nèi)切糖苷酶將聚糖與肽段分開，并切下還原端的一個(gè)GlcNAc。接下來(lái)由硫酸酶除去非還原端唾液酸基上的硫酸基，最后各種糖苷酶依次從非還原端進(jìn)行降解。當(dāng)前第85頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)圖4.25靈長(zhǎng)類和嚙齒動(dòng)物復(fù)雜型N-聚糖的降解星號(hào)標(biāo)明下一步水解的目標(biāo)殘基當(dāng)前第86頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)疾病名稱酶缺陷臨床癥狀Ⅰ型或Ⅱ型甘露糖苷過(guò)多癥α-甘露糖苷酶Ⅰ型：嬰兒期發(fā)作，進(jìn)行性精神遲鈍，肝大，3～12歲亡Ⅱ型：童年/成年發(fā)作，癥狀較Ⅰ型輕β-甘露糖苷過(guò)多癥β-甘露糖苷酶嚴(yán)重的四肢麻痺，很嚴(yán)重的15個(gè)月死亡；中等程度的精神遲鈍，面部變形天冬酰胺氨基葡萄糖尿癥天冬酰胺-氨基葡萄糖苷酶精神遲鈍，面部粗糙唾液酸沉積癥唾液酸酶嚴(yán)重的粘多糖沉積癥樣面容，精神遲鈍Ⅰ型和Ⅱ型Schindler綜合癥α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶Ⅰ型：嬰兒期發(fā)作，神經(jīng)突軸營(yíng)養(yǎng)不良，嚴(yán)重的痙攣和精神遲鈍，失明Ⅱ型：中度智力損傷，血管角質(zhì)瘤巖藻糖苷沉積癥α-巖藻糖苷酶痙攣、精神遲鈍，面部粗糙，生長(zhǎng)遲緩表4.4糖蛋白降解缺陷當(dāng)前第87頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)糖蛋白中聚糖部分的一般生物學(xué)功能當(dāng)前第88頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.4糖蛋白中聚糖部分的一般生物學(xué)功能

糖蛋白中聚糖部分的生物學(xué)功能是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)關(guān)注的中心問(wèn)題之一。糖鏈加工或合成反應(yīng)抑制劑、糖基化位點(diǎn)的定點(diǎn)突變以及糖基轉(zhuǎn)移酶的反義技術(shù)或基因轉(zhuǎn)染和敲除等技術(shù)的應(yīng)用，使聚糖生物學(xué)功能研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。糖蛋白中的聚糖不僅影響糖蛋白的折疊、聚合、溶解和降解，還參與糖蛋白的分揀和投送等細(xì)胞過(guò)程，而且還與許多糖蛋白的生物學(xué)活性有關(guān)。聚糖最重要的功能是參與細(xì)胞識(shí)別和分子識(shí)別，這些功能是蛋白質(zhì)和核酸所不能替代的。因此，闡明聚糖的功能，對(duì)于洞察生物大分子在功能上的分工與合作，完全揭開生命之謎具有十分重要的意義。當(dāng)前第89頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)聚糖在蛋白質(zhì)分子正確折疊和亞基締合中的作用N-糖基化是伴翻譯過(guò)程，必然對(duì)肽鏈折疊產(chǎn)生明顯影響。N-寡糖前體中α1-3臂外端的Glc殘基是糖蛋白肽鏈正確折疊的重要信號(hào)（圖4.10）。ER可溶性蛋白鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin）也有類似于鈣連蛋白的分子伴侶功能，可識(shí)別并幫助多肽鏈形成正確構(gòu)象。糖基化抑制劑N-butyldeoxy-nojirimycin（NB-DNJ）專一抑制ERα-葡萄糖苷酶，阻斷N-聚糖前體的加工；deoxymannojirimycin（DMJ）專一抑制Golgi體α-甘露糖苷酶I，中斷寡糖加工，形成高甘露糖型N-聚糖。酪氨酸酶有6個(gè)糖基化位點(diǎn)和兩個(gè)Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，其中3個(gè)糖基化位點(diǎn)在活性中心附近。用NB-DNJ處理小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，所合成的酪氨酸酶3個(gè)糖基化位點(diǎn)連接的是未經(jīng)加工的N-寡糖前體（十四糖），沒(méi)有Cu2+結(jié)合能力和酶活性。用DMJ處理后，酪氨酸酶N-寡糖加工停留在高甘露糖型階段，但此時(shí)肽鏈折疊已經(jīng)完成，酶仍具有Cu2+結(jié)合能力和催化活性。結(jié)果表明，糖鏈可影響肽鏈的正確折疊，為天然構(gòu)象的形成和酶活性作出貢獻(xiàn)，糖鏈本身并不是活性中心的組分，其結(jié)構(gòu)的變化未引起酶失活。當(dāng)前第90頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

乙型肝炎病毒外殼由大（L）、中（M）和小（S）三種亞基組裝而成。這3個(gè)亞基是同一mRNA從3個(gè)不同起點(diǎn)開始翻譯而生成的。M亞基前體PreS-2區(qū)段中Asn-4的糖基化與病毒蛋白的整合及分泌有關(guān)。L、M、S上S段的Asn-146也被糖基化，但Asn-4上的N-寡糖前體經(jīng)ERα-葡萄糖苷酶途徑開始加工，Asn-146上的N-寡糖前體則經(jīng)由Golgi體內(nèi)切甘露糖苷酶途徑進(jìn)行加工。在NB-DNJ存在下，M亞基上Asn-4N-寡糖前體不能進(jìn)行加工，影響其正確折疊以及與L和S的組裝，細(xì)胞只分泌較小的不含核酸的亞病毒，因而沒(méi)有感染性。有人已在研究利用α-葡萄糖苷酶抑制劑治療乙型肝炎、愛(ài)滋病等病毒性感染的可能性。當(dāng)前第91頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的屏蔽效應(yīng)

聚糖覆蓋于糖蛋白表面，一個(gè)單糖大約覆蓋約0.6nm長(zhǎng)度的表面積，聚糖越大，天線數(shù)越多，覆蓋的面積就越大，對(duì)糖蛋白抗御蛋白酶水解具有重要的意義。如運(yùn)鐵蛋白（Tf）受體是質(zhì)膜上的糖蛋白，它的251、317和727位的Asn上各有一個(gè)N-聚糖，如果Asn-251突變而不能N-糖基化，就不能形成正常的二聚體和定位于質(zhì)膜，隨即被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶迅速降解。Tf受體Arg102和Leu101也是蛋白酶作用部位，正常情況下，有Thr104O-GalNAc糖鏈的屏蔽使其免受蛋白酶攻擊。牛胰RNaseBAsn34上有一條高甘露糖型N-聚糖，而RNaseA沒(méi)有糖鏈。3種糖鏈大小不同的RNaseB對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抗御能力比RNaseA增大6～10倍，這兩種蛋白酶降解RNaseB的速度與它的N-聚糖Man殘基數(shù)成反比。當(dāng)前第92頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

糖蛋白基因在缺乏糖基化酶系統(tǒng)的大腸桿菌中表達(dá)，因產(chǎn)物缺少糖鏈?zhǔn)闺逆湶荒苷_地折疊，還可引起異常聚集，因此常形成包涵體很少分泌出細(xì)胞。在大腸桿菌中表達(dá)的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）因缺乏糖基化而被免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生抗體。正常的GM-CSF抗原決定簇被近旁的O-GalNAc糖鏈屏蔽。當(dāng)前第93頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)聚糖在糖蛋白細(xì)胞內(nèi)分揀、投送和分泌中的作用溶酶體蛋白上帶有Man-6-P的高甘露糖型N-聚糖是其分揀和投送的信號(hào)。合成Man-6-P的關(guān)鍵酶N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的缺失導(dǎo)致溶酶體酶無(wú)法投送到位，造成胎死腹中。盡管并非全部糖蛋白的分揀和投送都離不開糖鏈，但用GlcNAc-1-磷酸酶抑制劑衣霉素（tunicamycin）處理細(xì)胞阻斷N-寡糖前體組裝，導(dǎo)致許多質(zhì)膜蛋白質(zhì)無(wú)法投送。原因可能是無(wú)糖鏈的蛋白不能正確折疊和組裝；或其ER滯留信號(hào)KDEL模體失去屏蔽暴露在外；或因暴露蛋白酶攻擊位點(diǎn)而被迅速降解。IgM和IgA的每條重鏈各有3～5條糖鏈，IgG每條重鏈有1條糖鏈。未糖基化的IgM和IgA不能被細(xì)胞分泌，未糖基化的IgG溶解度下降，影響分泌。用衣霉素處理小鼠漿細(xì)胞，IgM、IgA和IgG的分泌分別減少81%、61%和28%。當(dāng)前第94頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)4.2.4.4聚糖對(duì)糖蛋白生物活性的影響多數(shù)糖蛋白酶類去掉糖鏈后催化活力沒(méi)有明顯變化。但是，糖鏈的引入必然改變蛋白分子親水表面的大小與布局和/或電荷平衡，影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而不同程度地影響其生物學(xué)性質(zhì)。有不少的糖蛋白酶類去糖基化之后酶活性降低或喪失。例如用衣霉素處理細(xì)胞或在細(xì)菌中表達(dá)的溶酶體β-葡萄糖苷酶只有免疫原性而沒(méi)有催化活性；HMG-CoA還原酶去掉糖鏈后活力降低90%以上；脂蛋白脂酶N-聚糖的五糖核心為其活力所必需，可能與維持其天然構(gòu)象有關(guān)。流感病毒主要被膜蛋白HA需經(jīng)蛋白酶專一切割成兩個(gè)較小的糖蛋白HA1和HA2。在糖基化抑制劑存在下形成非糖基化的HA0，其分解產(chǎn)物HA01和HA02是不均一的；看來(lái)由于缺乏糖鏈的保護(hù)，HA0失去了蛋白酶切割的專一性控制。當(dāng)前第95頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

人絨毛膜促性腺激素（hCG）由α和β兩個(gè)亞基組成，α亞基含92個(gè)氨基酸殘基，在Asn52和78N-糖基化，β亞基含145個(gè)氨基酸殘基，Asn13和30N糖基化，Ser121、127、132和138O-糖基化。其中α的Asn52和β的Asn13N-糖基化與其活性密切相關(guān)。去掉Asn52N-聚糖的α能與正常β亞基形成二聚體，但是活性較低，還與天然hCG競(jìng)爭(zhēng)受體。αAsn52和βAsn13同時(shí)去糖基化，則完全喪失活性。正常的αAsn78和β亞基Asn13、30上的N-聚糖均為雙天線復(fù)雜型，αAsn52上有單天線復(fù)雜型N-聚糖，它們的非還原端均為α2-3Neu5Ac，去掉αAsn78上的糖鏈影響其分泌而不影響活性。β亞基上的O-GalNAc聚糖與維持其半壽期有關(guān)，對(duì)活性的影響不大。hCG二聚體與其受體結(jié)合后使靶細(xì)胞內(nèi)[cAMP]升高，刺激類固醇激素的合成。如果把hCGN-聚糖末端的Neu5Ac去掉，它與受體的親和力增大，但cAMP的生成卻減少；如將末端改為α2-6Neu5Ac，不影響其生物活性，說(shuō)明有無(wú)末端Sia很重要，而Sia連接方式并不重要。有趣的是如果把α亞基上的N-聚糖變成多天線，則不再與β亞基締合，游離的α單體具有刺激催乳素分泌的活性。當(dāng)前第96頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)聚糖在分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別中的作用

越來(lái)越多的資料表明，糖類是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)之外的又一類生物大分子，尤其是一類重要的信息分子。破譯特定糖鏈結(jié)構(gòu)包涵的信息，闡明糖鏈信號(hào)接收、傳遞途徑，以及糖鏈信號(hào)的生理學(xué)和病理學(xué)意義，是當(dāng)代糖生物學(xué)的主要內(nèi)容。也就是說(shuō)，糖鏈最重要的生物學(xué)功能是在分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別中充當(dāng)信號(hào)分子。當(dāng)前第97頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（1）在受體-配體相互識(shí)別中的作用：受體與配體的識(shí)別及結(jié)合，實(shí)質(zhì)上是受體上的結(jié)合部位與配體上的識(shí)別標(biāo)記之間專一的結(jié)合。這種專一的相互作用在很多情況下與其聚糖結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。例如圖4.13中出示的促黃體激素（LH）雙天線復(fù)雜型N-聚糖非還原端為SO4-4GalNAcβ1-4-，而促濾泡激素（FSH）則為Siaα2-3/6Galβ1-4-。肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞有一種膜受體能專一識(shí)別SO4-4GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Man結(jié)構(gòu)，將其內(nèi)吞清除。因此LH從血液中的清除率比FSH高，它在體內(nèi)的生物半壽期也比FSH短。當(dāng)前第98頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（2）在維持血漿糖蛋白平衡中的作用：血漿中至少有60多種糖蛋白，以一定的速率合成，經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞以一定的速率清除，在血漿中保持動(dòng)態(tài)平衡。血漿銅藍(lán)蛋白含有復(fù)雜型N-聚糖，用唾液酸酶切去其非還原端的Sia殘基，暴露出次末端的Gal，經(jīng)氧化/再還原，用3H對(duì)Gal進(jìn)行標(biāo)記，注射到兔子體內(nèi)，這種失去部分（20%以上）唾液酸殘基的血漿銅藍(lán)蛋白在血液中的半壽期從54h縮短到3～5分鐘。從肝細(xì)胞分離出識(shí)別Gal的受體，也是唾液酸化的糖蛋白。糖鏈非還原端必須有唾液酸，才具有配體結(jié)合活性。它的結(jié)合活性需要Ca2+。血漿銅藍(lán)蛋白的更新機(jī)制有一定的普遍性，已在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種以識(shí)別非還原端糖基為基礎(chǔ)的受體，如成纖維細(xì)胞上的Man-6-P受體、肝細(xì)胞上的Gal受體和Fuc受體，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞上的Man受體和GlcNAc受體等。類似的機(jī)制還見(jiàn)于血漿脂蛋白的清除和血細(xì)胞的更新。當(dāng)前第99頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（3）構(gòu)成某些抗原決定簇：生物大分子和細(xì)胞上的抗原決定簇是被生物系統(tǒng)“驗(yàn)明正身”的識(shí)別標(biāo)志，有許多抗原決定簇實(shí)際上就是特定的糖結(jié)構(gòu)。例如，ABO血型抗原就是個(gè)范例。除人類和亞洲、非洲的猴子外，其它哺乳動(dòng)物器官內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原決定簇為Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R，又稱αGal抗原決定簇。αGal決定簇是2型鏈經(jīng)Golgi體α1-3GalT添加一個(gè)Gal而形成的。人類編碼α1-3GalT的基因由于一個(gè)堿基缺失而不能合成有活性的產(chǎn)物，因而不存在αGal決定簇。2型鏈在α1-2FucT催化下變成H抗原，或再由α1-3FucT修飾成Ley抗原。人體內(nèi)的抗Gal抗體（IgG和IgM）可識(shí)別αGal決定簇并引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，是異種器官移植的主要障礙。當(dāng)前第100頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

完全除去人體內(nèi)的抗Gal抗體或被抗Gal抗體-αGal抗原復(fù)合物激活的補(bǔ)體，已被證明是行不通的。因而采用反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)抑制α1-3GalT基因的表達(dá)，甚至敲除α1-3GalT基因；或過(guò)度表達(dá)α-半乳糖苷酶，把αGal抗原決定簇減少至1/30，使這些細(xì)胞與天然抗體的反應(yīng)降至1/10；或?qū)肴说摩?-2FucT基因與α1-3Gal競(jìng)爭(zhēng)，使細(xì)胞表面的αGal決定簇減少90%；還可在導(dǎo)入人α1-2FucT的同時(shí)過(guò)量表達(dá)α-半乳糖苷酶，把αGal決定簇的表達(dá)量減少到可以忽略不計(jì)的水平。由于引發(fā)超急性排斥反應(yīng)的不僅是αGal決定簇，實(shí)現(xiàn)異種器移植的目標(biāo)尚需時(shí)日。當(dāng)前第101頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

個(gè)體發(fā)育不同階段細(xì)胞表面上會(huì)出現(xiàn)特異的抗原，例如受精卵發(fā)育至8～16細(xì)胞期出現(xiàn)階段特異胚抗原Lex（SSEA-1），它的出現(xiàn)可能與桑椹期的致密過(guò)程有關(guān)。有些特異性抗原還成了某些病理改變的標(biāo)志，如胰、肝、胃、大腸等消化道癌標(biāo)志性糖鏈抗原為α2-3唾液酸化的Lea抗原；肺癌、卵巢癌標(biāo)志性糖鏈抗原為α2-3唾液酸化的Lex抗原。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑性狼瘡等自身免疫性疾病也與抗原決定簇的改變有關(guān)。例如IgG每條重鏈有一個(gè)復(fù)雜型雙天線N-聚糖，當(dāng)β1-4GalT活性不足時(shí)，外鏈上Gal含量明顯減少，GlcNAc為末端的糖鏈增多，結(jié)果變成一種自身抗原，被免疫系統(tǒng)識(shí)別而產(chǎn)生自身抗體，二者結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物沉積在血管、關(guān)節(jié)腔等處，引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。當(dāng)前第102頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)（4）凝集素對(duì)單糖和聚糖的識(shí)別作用：

糖類作為信號(hào)分子，其生物學(xué)功能離不開專一識(shí)別并與其結(jié)合的另一類大分子——凝集素。凝集素（lectin或agglutinin）是非免疫原的（其合成并非免疫應(yīng)答所致）、能專一地識(shí)別并結(jié)合某種特定結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定糖基序列的蛋白質(zhì)。許多凝集素自己也是糖蛋白。多數(shù)凝集素是同源四聚體，少數(shù)為二聚體或6～20個(gè)亞基的寡聚體。通常每個(gè)亞基有一個(gè)糖結(jié)合部位，個(gè)別的有兩個(gè)結(jié)合部位或兩個(gè)亞基共有一個(gè)結(jié)合部位。每個(gè)凝集素分子至少有兩個(gè)或更多的糖結(jié)合部位，這種糖結(jié)合多價(jià)性是凝集素能凝集細(xì)胞和沉淀含糖大分子的基礎(chǔ)。當(dāng)前第103頁(yè)\共有156頁(yè)\編于星期三\16點(diǎn)

凝集素最基本的特征就是糖結(jié)合專一性。動(dòng)植物和微生物中都含有糖結(jié)合專一性不同的凝集素，目前至少已純化上百種植物或真菌凝集素，各自識(shí)別不同的單糖和聚糖的類型、核心結(jié)構(gòu)、天線數(shù)以及外鏈的結(jié)構(gòu)和取代