色譜柱的選擇及應(yīng)用

色譜柱的選擇及應(yīng)用宋學(xué)英;楊華【摘要】目的：：分析時(shí)正確選擇色譜柱，使其能夠達(dá)到較好的分離效果。方法:通過(guò)綜述色譜柱的分類(lèi)、基質(zhì)及不同鍵合相的最新發(fā)展?fàn)顩r，結(jié)合自身的科研工作實(shí)例說(shuō)明不同的色譜柱對(duì)樣品分離效果的重要影響以及色譜柱在使用過(guò)程中的維護(hù)方法。結(jié)果：正確選擇色譜柱能夠達(dá)到較好的分離效果。結(jié)論：不同基質(zhì)的色譜柱對(duì)樣品的分離效果不同，實(shí)驗(yàn)中需要根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適的色譜柱；做好色譜柱的日常維護(hù)，才可以提高色譜柱的使用壽命。%Inthispaper,thelatestdevelopmentofthetypes,matrix,thebondedphaseandtheappli-cationofchromatographiccolumnwereintroduced.【期刊名稱(chēng)】《分析儀器》【年(卷)，期】2016(000)006【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P84-88)【關(guān)鍵詞】色譜柱;選擇;維護(hù)【作者】宋學(xué)英;楊華【作者單位】首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心現(xiàn)代藥學(xué)測(cè)試室北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心現(xiàn)代藥學(xué)測(cè)試室北京100069【正文語(yǔ)種】中文在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想的分離，是色譜工作者的重要工作。色譜是一種分離分析的手段，分離是核心，因此可以說(shuō)擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟［1］。對(duì)色譜柱的要求是：柱效高、選擇性好，分析速度快等［2］。目前市售的用于HPLC的各種色譜柱種類(lèi)繁多，從色譜柱填料來(lái)分，可分為硅膠基質(zhì)和有機(jī)雜化球基質(zhì)的色譜柱，還有不同長(zhǎng)短、不同微粒大小的色譜柱，因此選擇一個(gè)合適的色譜柱非常重要。液相色譜儀：1525-2487:1525泵、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，美國(guó)沃特世；CoulArray5600，包括：EAS482泵、ESA542自動(dòng)進(jìn)樣器、CoulArray56008通道庫(kù)侖陣列檢測(cè)器，美國(guó)戴安；色譜柱：ESAMD150x3.23pm美國(guó)戴安；Symmetry150x3.95pm;SymmetryShield150x4.65pm;NovaPak150x4.64pm均為美國(guó)沃特世；zorbaxSB-c18150x4.65pm美國(guó)安捷倫；色譜甲醇（Fisher美國(guó)）；其余均為分析純?cè)噭?。色譜柱的選擇可根據(jù)待分析樣品的極性、分子量大小、是否可溶于水等因素來(lái)考慮。如樣品分子量大于2000的，可溶于水的，可選擇凝膠色譜柱、大孔徑反相色譜柱、大孔徑離子交換色譜柱。分子量小于2000的，溶于有機(jī)相的，可選擇正相模式色譜柱。溶于水，可電離的樣品可選擇反相模式（用離子對(duì)試劑的鍵合固定相、用離子化控制鍵合固定相）色譜柱或離子交換或未經(jīng)涂漬親水模式的色譜柱等。2.1色譜柱的分類(lèi)色譜柱可分正相模式色譜柱、反相模式色譜柱和親水模式柱［3］正相模式色譜柱：采用極性固定相（如乙二醇、氨基與腈基等鍵合相）；常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等）。反相模式色譜柱：一般用非極性固定相，以硅膠為基質(zhì)鍵合不同的基團(tuán)（如C18、C8）；適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜（RPC）在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最多，據(jù)統(tǒng)計(jì)它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右［4］。由于超臨界色譜的崛起，—些過(guò)去用正相色譜的實(shí)驗(yàn)逐漸被超臨界色譜所代替,所以反相色譜柱的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。隨著色譜柱填料的快速發(fā)展，某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析也可用反相色譜法。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖鹽控制流動(dòng)相的pH值。硅膠基質(zhì)鍵合相(C8和C18)色譜柱使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落［2］。近年來(lái)技術(shù)的更新，利用包被、空間位阻、雜化顆粒等新技術(shù)，已經(jīng)可以使硅膠基質(zhì)的色譜柱使用范圍擴(kuò)大到pH為1~12，流動(dòng)相為較強(qiáng)酸性或堿性時(shí)，可選擇寬pH值的色譜柱。親水(HILIC)模式：HILIC不同于反相色譜技術(shù)，流動(dòng)相為反相色譜的流動(dòng)相，它提供了相對(duì)于反相的互補(bǔ)選擇性，通?？杀Ａ魝鹘y(tǒng)反相色譜方法無(wú)法保留的高極性化合物。需要注意的是HILIC模式中硅膠基質(zhì)無(wú)鍵合相的色譜柱，流動(dòng)相pH適用范圍。2.2固定相的基質(zhì)2.2.1無(wú)機(jī)基質(zhì)無(wú)機(jī)基質(zhì)有硅膠、羥基磷灰石、石墨化碳、氧化鋁、氧化鈦以及氧化鋯等金屬氧化鈦等［5］。硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還提供一個(gè)表面，可以通過(guò)成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜所用填料。2.2.2有機(jī)聚合物基質(zhì)以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無(wú)機(jī)填料低。苯乙烯二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)?？墒褂萌魏瘟鲃?dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用氫氧化鈉或強(qiáng)堿來(lái)清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過(guò)適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水性的。雖然不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮，用于HPLC的填料其膨脹和收縮要有限制。因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成了小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能與硅膠基質(zhì)相差無(wú)幾。因此，聚合物基質(zhì)更廣泛用于分離大分子物質(zhì)［5］。2.2.3鍵合相的種類(lèi)化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相［1,2,5］。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團(tuán)與溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強(qiáng)的組分保留值較大。極性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相，如氨基柱。常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣［1］。非極性鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)對(duì)樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，一般來(lái)說(shuō)，樣品容量隨烷基鏈長(zhǎng)增加而增大，且長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，常?？筛纳品蛛x的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時(shí)得到的色譜峰對(duì)稱(chēng)性較好。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似，適用于分離芳香化合物。分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相：對(duì)于雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離，有較好的選擇性。氨基鍵合相：具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對(duì)如甾體、強(qiáng)心或等有較好的分離能力；并被廣泛用于糖類(lèi)的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)等。分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長(zhǎng)的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì)的緣故，C18基團(tuán)空間體積較大，有效孔徑小，所以C18色譜柱更適合分離小分子化合物。利用特殊的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù)和反相離子對(duì)色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecylsilane)是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對(duì)各種類(lèi)型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。對(duì)于極性比較大的化學(xué)物還可采用HILIC模式的色譜柱，HILIC的保留機(jī)制是基于分配、離子交換、氫鍵作用等復(fù)雜機(jī)制，從而獲得對(duì)極性分子物有更強(qiáng)的保留能力[6]，如分離糖類(lèi)化合物，可選用鍵合酰胺鍵的硅膠基質(zhì)的色譜柱。2.3色譜柱的應(yīng)用以最常用的C18色譜柱為例，不同廠(chǎng)家或相同廠(chǎng)家不同系列的色譜柱之間存在一定的差異，如填料均為C18的色譜柱就有含有親水基團(tuán)和不含親水基團(tuán)色譜柱，含親水基團(tuán)的色譜柱可以用100%水相作為流動(dòng)相，而不含親水基團(tuán)的色譜柱用純水作為流動(dòng)相會(huì)造成色譜柱疏水塌陷，柱效降低。2.3.1不同型號(hào)的色譜柱對(duì)分離結(jié)果的影響在分離ATP、ADP、AMP時(shí)，由于樣品的極性較強(qiáng)，流動(dòng)相為緩沖鹽及1%甲醇的緩沖鹽溶液，用WatersSymmetryShieldRPC18的色譜柱就可以得到較好的分離，如圖1所示。而用AgilentSB-C18的色譜柱不能得到滿(mǎn)意的色譜圖，這是因?yàn)閃atersSymmetryShield這款色譜柱鍵合了親水基團(tuán)，可以使用純水作為流動(dòng)相，而AgilentSB-C18不含親水基團(tuán)，使用純水作為流動(dòng)相會(huì)降低柱效。所以在分離極性較大的化合物需要使用純水作為流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)使用含親水基團(tuán)的C18色譜柱或親水模式的色譜柱。利用反相離子對(duì)色譜法分離極性化合物，含親水基團(tuán)和不含親水基團(tuán)的色譜柱其保留能力不相同，通常在沒(méi)有應(yīng)用離子對(duì)試劑時(shí)，我們認(rèn)為含親水基團(tuán)的色譜柱保留極性化合物的能力更強(qiáng)，但在應(yīng)用了離子對(duì)試劑后，含親水基團(tuán)的色譜柱的保留能力不一定比不含親水基團(tuán)的色譜柱保留強(qiáng)，如用SymmetryC18測(cè)定多巴胺、多巴柯、五羥吲哚乙酸、五羥色胺、及高香草酸時(shí)，相同條件下(流動(dòng)相：檸檬酸50mM、無(wú)水乙酸鈉70mM、EDTA-2Na0.2mMs辛^磺酸鈉0.2mM，緩沖鹽:甲醇=92:8,pH=4.1）兩種色譜柱保留時(shí)間有所不同，含親水基團(tuán)的色譜柱保留時(shí)間更短，分離效果不如普通的C18柱，五羥色胺與高香草酸未完全分開(kāi)，如圖2所示。這可能是離子對(duì)試劑可以與C18結(jié)合形成帶電的基團(tuán)，而含親水基團(tuán)的C18柱與離子對(duì)試劑結(jié)合不如C18柱強(qiáng)，因此對(duì)于用離子對(duì)色譜，C18的色譜柱保留更強(qiáng)（圖3）。2.3.2不同pH值對(duì)色譜柱分離結(jié)果的影響如用ESAMD150x3.2mm,3pm的色譜柱測(cè)DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA時(shí)pH=3.5和pH=4.1時(shí)提保留時(shí)間及保留順序均發(fā)生了變化（流動(dòng)相為70mM的乙酸鈉，50mM的檸檬酸，0.2mMEDTA-Na,0.2mM辛烷磺酸鈉，1.32%三乙胺用乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH值分別為3.5），如圖4所示。pH3.5時(shí)，多巴胺與多巴柯沒(méi)有完全分開(kāi)，pH4.1時(shí)5個(gè)峰得到也較好的分離，出峰順序較pH3.5時(shí)發(fā)生了改變，多巴胺與多巴柯位置相互交換了，高香草酸與五羥色胺位置也進(jìn)行了交換。所以說(shuō)pH值不同，色譜柱的選擇性也不相同，通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，可以達(dá)到改善分離度的目的。2.3.3不同型號(hào)的色譜柱分離結(jié)果的差異同樣用Waters公司不同型號(hào)的色譜柱分離DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA，其分離的效果也不相同，如圖5所示。由圖5可以看出相同條件下，NovaPakC18150x3.94pm不能將多巴胺與多巴柯很好的分離，而SymmetryC18150x3.95pm的色譜柱5種物質(zhì)得到了較好的分離，這說(shuō)明雖然都是C18的色譜柱其填料也會(huì)有一定的差異。2.4色譜柱清洗與使用中的注意事項(xiàng)2.4.1常用硅膠鍵合相色譜柱的清洗與再生對(duì)于常用的硅膠鍵合相的色譜柱被污染后，表現(xiàn)為：色譜峰變形，柱壓升高，保留時(shí)間改變等，說(shuō)明色譜柱需要清洗，色譜柱的清洗與再生方法見(jiàn)表1[7]。由于離子對(duì)試劑污染的色譜柱很難沖洗干凈，如在測(cè)定多巴胺、五羥色胺及其代謝產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)中，色譜柱被離子對(duì)試劑污染，保留時(shí)間延長(zhǎng)，用異丙醇沖洗色譜柱，保留時(shí)間恢復(fù)正常，但再次實(shí)驗(yàn)時(shí)，又會(huì)表現(xiàn)為保留時(shí)間延長(zhǎng)，因此離子對(duì)試劑污染了色譜柱很難恢復(fù)。2.4.2鍵合相色譜柱的使用注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。避免壓力、溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱床；柱壓的突然升高或降低也會(huì)對(duì)柱床有影響，因此要緩慢升高或降低流速，閥進(jìn)樣時(shí)，閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不宜過(guò)緩(如前所述)[8-10]。應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑直接改變?yōu)樗?，反之亦然。⑶一般說(shuō)來(lái)色譜柱不宜反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖以除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。(4)避免生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，還可以在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是與色譜柱填料相似的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。⑸經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在清洗色譜柱時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75mL。(6)保存色譜柱時(shí)應(yīng)用乙腈或柱說(shuō)明書(shū)上指定的溶劑充滿(mǎn)色譜柱，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥，絕對(duì)禁止將緩沖鹽溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜。使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相時(shí)，可先用高比例的水替換掉色譜柱中的有機(jī)相，然后再用含有緩沖鹽的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用高比例的水替換掉緩沖鹽，沖洗20倍的柱體積，再逐漸升高有機(jī)相的比例，直至100%乙腈或高比例乙腈，沖洗20倍柱體積，保存色譜柱。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘