園藝植物生物技術第七章2

第七章植物基因工程的基礎知識與技術

李英(南京農業(yè)大學園藝學院)Tel科樓B6018E-mail:yingli@當前第1頁\共有164頁\編于星期三\22點課程主要內容第一章緒論第二章園藝植物組織培養(yǎng)的理論基礎與基本技術第三章園藝植物脫毒與離體快速繁殖第四章園藝植物種質離體保存與無性變異系篩選第五章園藝植物的細胞工程第六章園藝植物的染色體工程第七章植物基因工程的基礎知識與技術第八章園藝植物基因的分離與克隆第九章園藝植物遺傳轉化載體的構建第十章園藝植物遺傳轉化第十一章轉基因技術在園藝植物育種的應用第十二章園藝植物的分子標記第十三章園藝植物生物信息學第十四章園藝植物生物技術的安全性評價與管理授課教師:李英,王建軍,侯喜林當前第2頁\共有164頁\編于星期三\22點

基因工程是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯、表達的系列操作技術總稱。外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征。當前第3頁\共有164頁\編于星期三\22點第七章植物基因工程的基礎知識與技術第一節(jié)植物遺傳物質的基礎知識第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶第三節(jié)植物基因工程常用的載體第四節(jié)植物基因工程的基本技術當前第4頁\共有164頁\編于星期三\22點第一節(jié)植物遺傳物質的基礎知識核酸：是以核苷酸為基本單位組成的生物大分子。DNA,RNA核苷酸:堿基，戊糖，磷酸A,T,G,C;A,U,G,CΒ-D-2脫氧核糖遺傳物質？當前第5頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第6頁\共有164頁\編于星期三\22點第一節(jié)植物遺傳物質的基礎知識DNA的結構與功能RNA的結構與功能蛋白質的結構與功能遺傳信息的傳遞基因的概念當前第7頁\共有164頁\編于星期三\22點一、DNA的結構與功能？DNA的一級結構指DNA分子中脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過磷酸二脂鍵連接形成的多核苷酸。又稱堿基順序。DNA的二級結構即雙螺旋結構。DNA的三級結構DNA雙螺旋進一步扭結、折疊形成的更加復雜的結構稱為DNA三級結構，這種雙螺旋結構可再次螺旋形成超螺旋結構。當前第8頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第9頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第10頁\共有164頁\編于星期三\22點生物的遺傳信息儲存于DNA的核苷酸序列中，生物界物種的多樣性就在于DNA分子4種核苷酸千變萬化。當前第11頁\共有164頁\編于星期三\22點DNAModel當前第12頁\共有164頁\編于星期三\22點DNA右手雙螺旋結構是DNA分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的結構，但并不是不變的，當改變溶液的離子強度或相對濕度時，DNA結構會發(fā)生改變。當前第13頁\共有164頁\編于星期三\22點DNA超螺旋結構DNA超螺旋結構的存在可能有兩方面的生物學意義，一方面，DNA雙鏈經過盤繞壓縮使松弛性DNA更為緊密，體積更小，更能保持穩(wěn)定。另一方面，影響DNA雙螺旋的解鏈過程，從而影響與其他大分子如蛋白質、酶的結合。當前第14頁\共有164頁\編于星期三\22點二、RNA的結構與功能mRNAmRNA存在于細胞質中，直接指導蛋白質的合成。tRNAtRNA是細胞內分子質量最小的一類核酸，由70~120核苷酸構成。rRNA是最多的一類RNA，也是3類RNA中相對分子質量最大的一類RNA，它與蛋白質結合而形成核糖體，其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實現蛋白質的合成。rRNA單獨存在時不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質結合成核糖體，作為蛋白質生物合成的“裝配機”。當前第15頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第16頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第17頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第18頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第19頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第20頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第21頁\共有164頁\編于星期三\22點三、蛋白質的結構與功能蛋白質的一級結構由氨基酸通過肽鍵連接成一條多肽鏈，由一個氨基酸的羥基和另一個氨基酸的氨基進行縮合反應產生。蛋白質的二級結構指多肽采取的不同構象。兩種主要形式是α螺旋和β折疊，二者都由多肽的不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。蛋白質的三級結構指將多肽鏈的二級結構組分折疊成為三維構型而形成的。主要被氫鍵、二硫鍵和疏水作用所穩(wěn)定。蛋白質的四級結構即兩條或更多已形成三級結構的多肽鍵組合在一起形成一個多亞基蛋白。不是所有蛋白都有四級結構。當前第22頁\共有164頁\編于星期三\22點定義：蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。1.蛋白質的一級結構主要化學鍵：肽鍵

二硫鍵的位置屬于一級結構研究范疇。當前第23頁\共有164頁\編于星期三\22點一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。胰島素的一級結構3021當前第24頁\共有164頁\編于星期三\22點2.蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。定義：穩(wěn)定因素：

氫鍵

當前第25頁\共有164頁\編于星期三\22點（一）肽單元(peptideunit)

參與組成肽鍵的6個原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質構象的基本結構單位。當前第26頁\共有164頁\編于星期三\22點肽單元HHHH當前第27頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第28頁\共有164頁\編于星期三\22點

蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉角(-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

當前第29頁\共有164頁\編于星期三\22點（二）-螺旋結構要點:

①多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。②每圈螺旋含3.6個氨基酸，螺距為0.54nm。③每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。當前第30頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第31頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第32頁\共有164頁\編于星期三\22點（三）-折疊①多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。②兩段以上的β-折疊結構平行排列，兩鏈間可順向平行，也可反向平行。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β-折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。

當前第33頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第34頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第35頁\共有164頁\編于星期三\22點（四）-轉角和無規(guī)卷曲-轉角：無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構。①肽鏈內形成180o回折。②含4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。③第二個氨基酸殘基常為Pro。當前第36頁\共有164頁\編于星期三\22點-轉角：當前第37頁\共有164頁\編于星期三\22點（五）模體蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間構象，被稱為模體(motif)。當前第38頁\共有164頁\編于星期三\22點螺旋－環(huán)－螺旋

鋅指當前第39頁\共有164頁\編于星期三\22點3.蛋白質的三級結構疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。穩(wěn)定因素：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。定義當前第40頁\共有164頁\編于星期三\22點

肌紅蛋白(Mb)N端C端當前第41頁\共有164頁\編于星期三\22點纖連蛋白分子的結構域結構域(domain)大分子蛋白質的三級結構?？煞指畛梢粋€或數個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結構域。當前第42頁\共有164頁\編于星期三\22點結構域Triosephosphateisomerase當前第43頁\共有164頁\編于星期三\22點亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。4.蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。每條具有完整三級結構的多肽鏈，稱為亞基(subunit)。當前第44頁\共有164頁\編于星期三\22點血紅蛋白（Hb）的四級結構當前第45頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第46頁\共有164頁\編于星期三\22點（1.）一級結構是空間構象的基礎蛋白質結構與功能的關系牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵當前第47頁\共有164頁\編于星期三\22點

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性當前第48頁\共有164頁\編于星期三\22點（2）一級結構與功能的關系例：鐮刀形紅細胞貧血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)當前第49頁\共有164頁\編于星期三\22點

這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。當前第50頁\共有164頁\編于星期三\22點肌紅蛋白與血紅蛋白的結構（3.）蛋白質空間結構與功能的關系當前第51頁\共有164頁\編于星期三\22點（4.）蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象病：若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。當前第52頁\共有164頁\編于星期三\22點蛋白質構象病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。當前第53頁\共有164頁\編于星期三\22點瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病當前第54頁\共有164頁\編于星期三\22點1.DNA雙螺旋結構發(fā)現（Watson

＆Crick,1953）四、遺傳信息的傳遞TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962當前第55頁\共有164頁\編于星期三\22點CentralDogma2.中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004當前第56頁\共有164頁\編于星期三\22點反轉錄機制闡明（Temin1970

）補充的中心法則當前第57頁\共有164頁\編于星期三\22點五、基因的概念三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。當前第58頁\共有164頁\編于星期三\22點現在人們認為，基因是實體，它的物質基礎是DNA或RNA，基因是具有一定遺傳效應的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遺傳信息傳遞和性狀分化、發(fā)育的依據，基因是可分的。根據基因的產物可將其分為結構基因、調節(jié)基因、無翻譯產物基因。簡而言之，基因是一個含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳物質的最小功能單位。當前第59頁\共有164頁\編于星期三\22點第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶限制性內切核酸酶DNA連接酶DNA聚合酶其他工具酶當前第60頁\共有164頁\編于星期三\22點常用工具酶及其功能限制性核酸內切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標記、補平3′末端反轉錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標記末端轉移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸當前第61頁\共有164頁\編于星期三\22點一、限制性內切核酸酶限制性核酸內切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端的小片段。

Ⅰ型限制性內切酶Ⅱ型限制性內切酶Ⅲ型限制性內切酶當前第62頁\共有164頁\編于星期三\22點定義：凡在識別并切割雙螺旋DNA分子內特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。名稱屬名（大寫）種名（小寫）株名分離序號來源菌體EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacollR株HindⅢHindⅢHaemophilusInfluenzaed株HindⅡHindⅡHaemophllusInfluenzaed株HpaⅠHpa/ⅠHaemophllusParainfluenzae限制性內切酶的命名舉例當前第63頁\共有164頁\編于星期三\22點Ⅱ型限制酶的作用性質1、基本特性：（1）識別位點為4~8個核苷酸序列；（2）識別位點即為切割位點；（3）位點上核苷酸順序通常呈雙重旋轉對稱結構，即呈回文結構。5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點當前第64頁\共有164頁\編于星期三\22點切割方式通常有三種：①在識別順序兩條鏈對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如HaeⅢ，PvuII。②在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側同時從5’端切斷磷酸二酯鍵，形成5’磷?；?-5個核苷酸單鏈粘性末端。如EcoRⅠ。③在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側同時從3’端切斷磷酸二酯鍵，形成3’羥基端2~5個核苷酸單鏈粘性末端。如PstⅠ。當前第65頁\共有164頁\編于星期三\22點PvuII等產生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

當前第66頁\共有164頁\編于星期三\22點EcoRI等產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

Ho-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP當前第67頁\共有164頁\編于星期三\22點PstI等產生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP當前第68頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第69頁\共有164頁\編于星期三\22點二、DNA連接酶（一）DNA連接酶和T4DNA連接酶DNA連接酶1976年發(fā)現，廣泛存在于細胞內。目前應用的多數來自于大腸桿菌，稱為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5‘-磷?；?’-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick（T4DNA連接酶）當前第70頁\共有164頁\編于星期三\22點T4DNA連接酶T4DNA連接酶來自于T4噬菌體感染的E.coli，為T4噬菌體自身的表達產物。分子量6.8萬dal，輔因子位ATP，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’當前第71頁\共有164頁\編于星期三\22點連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶當前第72頁\共有164頁\編于星期三\22點（二）連接酶的作用

用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構建出新的DNA雜種分子。當前第73頁\共有164頁\編于星期三\22點

DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化學合成的具有粘性末端的DNA片段。當前第74頁\共有164頁\編于星期三\22點三、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段T4DNA聚合酶反轉錄酶T7噬菌體DNA聚合酶當前第75頁\共有164頁\編于星期三\22點（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要作用是采用缺口平移法標記DNA，制備放射性DNA探針，用于核酸雜交分析。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’-3’的聚合酶活性；

2.5’-3’的外切酶活性；

3.3’-5’的外切酶活性（較低）。當前第76頁\共有164頁\編于星期三\22點（二）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經舒替蘭酶處理，去除全酶中的5’3’外切核酸酶活性，保留了5’3’聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性。當前第77頁\共有164頁\編于星期三\22點（三）T4DNA聚合酶T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一種模板依賴的DNA聚合酶，可以在結合有引物的單鏈DNA模板上，從5‘→3’方向催化DNA合成反應。T4

DNA

Polymerase具有3‘→5’外切酶活性，但不具有5‘→3’外切酶活性。

特點：可以用于將5‘端突出末端補平或3’端突出末端削平。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’DNA外切酶活性對于單鏈DNA要比雙鏈DNA活性更高，即單鏈DNA要比雙鏈DNA中的非配對鏈部分更容易被T4

DNA

Polymerase所消化。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’外切酶活性比KlenowFragment要高約200倍。

當前第78頁\共有164頁\編于星期三\22點（四）反轉錄酶反轉錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉錄酶兩種。當前第79頁\共有164頁\編于星期三\22點（五）T7噬菌體DNA聚合酶

T7噬菌體DNA聚合酶來源于T7噬菌體感染的E.coli，為兩種緊密結合的蛋白質復合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個是宿主蛋白的硫氧還蛋白。T7噬菌體DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強的一個，產物平均長度要大得多，在測定核苷酸序列時有優(yōu)勢。它的活性功能與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3‘--5’外切活性為Klenow的1000倍。T7噬菌體DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于長模板的引物延伸。Sequenase（測序酶）是美國UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進行測序的理想用酶。當前第80頁\共有164頁\編于星期三\22點四、其他工具酶末端轉移酶堿性磷酸酶DNA甲基化酶S1核酸酶當前第81頁\共有164頁\編于星期三\22點（一）末端轉移酶

分子克隆中常用的末端轉移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細胞及分化早期的類淋巴樣細胞內的一種不尋常的DNA聚合酶，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘-OH。若dNTP為T或C，此二價陽離子首選CO2+；若dNTP為A或G此二價陽離子首選Mg2+。在基因工程中，利用末端轉移酶不需要模板，dNTP中任何一個都可以作為反應前體物的特征，給平末端DNA片段3‘-OH加上同聚物poly(C)或poly(G)，也可以加上poly(T)或poly(A)，形成同聚物加尾構建重組技術。當前第82頁\共有164頁\編于星期三\22點（二）堿性磷酸酶堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要5’端同位素標記或為了避免DNA片段自身連接（或環(huán)化）時可進行脫磷酸反應。當前第83頁\共有164頁\編于星期三\22點堿性磷酸酶的活性當前第84頁\共有164頁\編于星期三\22點堿性磷酸酶的應用當前第85頁\共有164頁\編于星期三\22點（三）DNA甲基化酶原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。在E.coli中，大多數都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。甲基化酶使DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶堿基甲基化，免受內源性限制酶切割，從而將能被限制性內切酶識別的未被甲基化的DNA分子和不可識別的甲基化方式的DNA分子區(qū)別開來，起到保護DNA分子的作用。當前第86頁\共有164頁\編于星期三\22點（四）S1核酸酶來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結構的處理。當前第87頁\共有164頁\編于星期三\22點核酸酶SⅠ的應用當前第88頁\共有164頁\編于星期三\22點第三節(jié)園藝植物基因工程常用的載體能將目的基因攜帶至宿主細胞并可在其中自主復制的遺傳因子謂之為基因工程載體。當前第89頁\共有164頁\編于星期三\22點相關概念有用基因亦稱為目的基因或插入物用于接受重組DNA的擴增載體及其插入物或表達目的基因的受體細胞謂之宿主插入物的擴增過程稱為分子克隆攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細胞（菌）或重組細胞（菌）當前第90頁\共有164頁\編于星期三\22點基因工程載體的必備條件1、能自主復制2、具有可供選擇的遺傳標記3、具克隆位點4、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,

載力要大5、載體特征明確：基因，酶切位點，核苷酸序列當前第91頁\共有164頁\編于星期三\22點質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體當前第92頁\共有164頁\編于星期三\22點一、質粒質粒是能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子質粒的生物學性質①分子量小，差異顯著，1-500kb。②易于在宿主間轉移和遷移。③在宿主內可伴隨宿主染色體復制而復制，與宿主呈共生關系。④且其存在與否與宿主生死無關。⑤編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細胞額外遺傳特性（如抗生素抗性）當前第93頁\共有164頁\編于星期三\22點pBR322

是一種人工構建的重要質粒

特點：①帶有多種抗藥性的強選擇標記②具有低分子量，高拷貝③外源DNA插入不影響復制功能④有多種核酸內切限制酶單切割位點命名:p：表示質粒

BR:分別取自兩位主要構建者F.Bolioax

和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個字母

322:指實驗室編號當前第94頁\共有164頁\編于星期三\22點普通型載體pBR322的結構圖1、來源于pSF2124質粒易位子Tn3的ampr2、來源于pSC101質粒的tetr3、來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點當前第95頁\共有164頁\編于星期三\22點pBR322質粒載體的優(yōu)點①自身分子量小4363bp②同時具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號③具有較高的拷貝數當前第96頁\共有164頁\編于星期三\22點pUC質粒載體pUC質粒是在pBR322載體質粒的基礎上，組入了一個在其5‘端帶有一段多克隆位點的lacZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。pUC取名是根據它們的加州大學(UniversityofCalifornia)的科學家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構建的當前第97頁\共有164頁\編于星期三\22點(1)pUC質粒載體的結構pUC系列質粒載體包括以下四個組成部分：①來自pBR322質粒的復制起點ori）；②氨芐青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的識別位點；③大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ`基因；④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。當前第98頁\共有164頁\編于星期三\22點pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛藍（藍色）當前第99頁\共有164頁\編于星期三\22點(2)pUC質粒載體的優(yōu)點①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷貝數(500～700)②適用于組織化學方法檢測重組體③具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因當前第100頁\共有164頁\編于星期三\22點二、噬菌體載體(一)λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的結構和性質λ噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復制而復制。當前第101頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第102頁\共有164頁\編于星期三\22點λ噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量3.1×107dal。迄今已定位的基因至少61個，其中一半參與了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基因為λ噬菌體的“必要基因”；另一部分基因，當它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因為λ噬菌體的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎。當前第103頁\共有164頁\編于星期三\22點2、

λ噬菌體DNA克隆載體野生型的λDNA不適宜作為克隆載體。因為⑴其分子量較大，⑵常用的限制酶切點較多。如EcoRI切點5個，HindⅢ切點7個，而這些切點大多位于溶菌周期生長所必須基因內，容納不下比其更大的外源性DNA片段，必須對其進行改造。當前第104頁\共有164頁\編于星期三\22點改造后，可構建兩類λ噬菌體派生載體①取代型載體或替換型載體（replacementvector）它具有成對的克隆位點，這兩個位點之間的λDNA

區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4

和Charon40。當前第105頁\共有164頁\編于星期三\22點②插入型載體（insertionvectors）只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點（也有一些具有兩個插入位點）。外源性DNA克隆到插入型的λ載體分子上會使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應。如免疫功能失活的和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。當前第106頁\共有164頁\編于星期三\22點特點：以λ噬菌體DNA為載體構成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。經包裝后重組DNA分子轉化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。當前第107頁\共有164頁\編于星期三\22點1、概述λ噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達35-40kb，甚至更大，同時λ噬菌體不能夠同時克隆兩個連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質粒載體，可滿足以上需要。“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(cos)的質粒。三、柯斯載體(cosmid)

當前第108頁\共有164頁\編于星期三\22點定義：科斯質粒是人工構建的，含有λDNA的粘性(cos)末端序列、質粒復制起始區(qū)及質粒一個抗藥性標記的、兼具質粒與λ噬菌體DNA載體雙重性質的特殊載體。當前第109頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第110頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第111頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第112頁\共有164頁\編于星期三\22點2、Cosmid的特點目前已有許多不同類型的科斯質粒載體，其特點如下：①具有λ噬菌體的特性；②具有質粒載體特性；③具有高容量的克隆能力；④具有與同源序列的質粒進行重組的能力。當前第113頁\共有164頁\編于星期三\22點四、人工染色體載體

YAC載體主要是用來構建大片段DNA文庫，特別用來構建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。真核生物染色體的幾個關鍵部分：著絲粒端粒自主復制序列當前第114頁\共有164頁\編于星期三\22點當前第115頁\共有164頁\編于星期三\22點第四節(jié)植物基因工程的基本技術核酸分離技術核酸電泳技術核酸體外擴增技術分子雜交技術當前第116頁\共有164頁\編于星期三\22點一、核酸分離技術（一）

DNA的提取CTAB法SDS法當前第117頁\共有164頁\編于星期三\22點DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中當前第118頁\共有164頁\編于星期三\22點1.RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不易失活（二）

RNA的提取當前第119頁\共有164頁\編于星期三\22點

2’-deoxyribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&thymineDNAisapolymerof

2’-deoxyribonucleotidesGCTAp5’end3’endCGTAHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2NH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OOOPOCH2ONCCOHNCHCOCH31’2’3’4’5’3’當前第120頁\共有164頁\編于星期三\22點RNAisapolymerofribonucleotides

ribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&uracilGCUApCGUA5’end3’end1’2’3’4’5’3’OHHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2OHOOOPOCH2ONCHCOHNCHCOOHNH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OH當前第121頁\共有164頁\編于星期三\22點RNAiseasilyhydrolyzedunderalkalineconditionsThereactionproceedsthrougha2’,3’-cyclicmonophosphateintermediate.EnzymatichydrolysisofRNAbyRNaseproceedsthroughasimilarintermediate.BecauseDNAlacksthe2’-OHgroup,itisstableunderalkalineconditions.....OPO-CH2OOONOHOOPOCH2OONOHOOPOO...OHONOHOOPOO...HOCH2O....OPO-CH2OONOOPOOH+....OPO-CH2OOONOHOOPOHOmixtureof2’-and3’-monophosphatederivativesH2OshortenedRNARNA當前第122頁\共有164頁\編于星期三\22點提取RNA的注意事項(1)玻璃制品、塑料制品和電泳槽:玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。(2)研究人員造成的污染:經常更換新手套(3)污染的溶液:避免交叉污染。當前第123頁\共有164頁\編于星期三\22點常用RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。當前第124頁\共有164頁\編于星期三\22點RNA提取的步驟材料的裂解雜質的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機相。硅質材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經DEPC處理的水溶解RNA當前第125頁\共有164頁\編于星期三\22點材料準備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質少生長較快的幼嫩部位，現取現提。組培細胞及血液應盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質少的部位,細菌和酵母需要勻漿處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。液氮研磨時不要使液氮揮發(fā)凈，隨時補充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。當前第126頁\共有164頁\編于星期三\22點雜質的抽提采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間，使蛋白質、多糖和DNA分布到中間層和有機相中，RNA留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質層，可以再次用有機溶劑抽提當前第127頁\共有164頁\編于星期三\22點RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質或使用異丙醇沉淀RNA應充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經DEPC處理過的水或專門的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時應置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用當前第128頁\共有164頁\編于星期三\22點二、核酸電泳技術自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段。當前第129頁\共有164頁\編于星期三\22點基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質量的基因組DNA

帶型單一無拖尾現象DNA濃度及純度的檢測（A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；A260/280約為1.8）

當前第130頁\共有164頁\編于星期三\22點RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測（A260=1，約40μg/mLRNA；

A260/A280

約為1.9-2.1）當前第131頁\共有164頁\編于星期三\22點瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。當前第132頁\共有164頁\編于星期三\22點

溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現出橘黃色熒光，易于鑒定。當前第133頁\共有164頁\編于星期三\22點

普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。當前第134頁\共有164頁\編于星期三\22點三、核酸體外擴增技術——PCR技術PCR基本概念PCR基本原理及示意圖PCR反應的組成物質PCR反應體系及擴增程序由基本PCR拓展的相關技術當前第135頁\共有164頁\編于星期三\22點PCR技術

（Polymerasechainreaction）當前第136頁\共有164頁\編于星期三\22點

PCR(Polymerasechainreaction)即：聚合酶鏈式反應，是指在體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術，也稱無細胞分子克隆系統(tǒng)。是1985年由美國的KaryB.Mullis等人首創(chuàng)并由美國Getus公司開發(fā)的一項專利，應用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時內迅速擴增到百萬倍。具有特異性強，靈敏度高和快速準確的優(yōu)點，因而發(fā)展迅速，應用范圍越來越廣泛，不僅可用于基因表達調控，基因克隆與測序，特異基因篩選等基礎研究，而且在醫(yī)學、農業(yè)科學等領域得到了廣泛的應用。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993KaryB.Mullis（1944–）

LaJolla,CA,USA1.PCR基本概念當前第137頁\共有164頁\編于星期三\22點2.PCR技術的基本原理

根據已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外將DNA模板在酶促作用下進行擴增。PCR全過程可分為DNA模板變性、退火、延伸三個步驟，經若干循環(huán)所組成。首先高溫作用使模板DNA變性解鏈，然后降低溫度使引物與模板DNA鏈退火，在TaqDNA聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物鏈將沿著5’

～3’方向延伸與模板互補的新鏈，新鏈則可作為下一次反應的模板，因此擴增產物的量以指數級方式增加。通常單一拷貝的基因經25~30循環(huán)可擴增100萬～200萬拷貝。當前第138頁\共有164頁\編于星期三\22點未擴增的DNAA上游引物B下游引物5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端沒有固定的終止點特定的擴增產物在第2個循環(huán)中出現，以后快速擴增，成為主要擴增產物BABBABAABABABABA循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2變性、退火延伸靶序列未擴增的DNA當前第139頁\共有164頁\編于星期三\22點循環(huán)3n個循環(huán)后，5'端是特定的人工合成的引物，3'端沒有固定的終止點的DNA鏈擴增量為2n。變性、退火延伸ABBBAABAABBABABABABBA當前第140頁\共有164頁\編于星期三\22點3.PCR反應的組成物質

完成PCR反應的組成物質主要有引物、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、緩沖液、Mg2+及DNA模板等，其基本特征和要求介紹如下。當前第141頁\共有164頁\編于星期三\22點3.1引物引物是與待擴增DNA片斷兩側互補的寡核苷酸，是決定PCR擴增特異性的關鍵因素，引物設計與合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。引物設計主要考慮：⑴引物長度一般為15～30堿基，太短容易產生許多不同的DNA擴增片段，產生與非靶序列的雜交；太長影響PCR效率。⑵堿基組成引物3’不應超過3個連續(xù)的G（或C），引物自身及引物間不應存在互補序列，否則易形成引物二聚體。⑶引物3‘不能進行修飾，由于引物與模板結合后，是從3’開始延伸引物的，第一位的錯配將影響擴增效率。當前第142頁\共有164頁\編于星期三\22點3.2dNTP

dNTPs是PCR反應所必須的底物，為四種核苷酸的混合物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。最適宜的dNTPs終濃度應根據被擴增片斷的長度和堿基組成來確定。當前第143頁\共有164頁\編于星期三\22點3.3DNA聚合酶

目前PCR擴增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA，它是由水生棲熱菌產生，熱穩(wěn)定性好。它的用量多少對PCR擴增效率及特異性有一定影響。另外近年來還使用耐熱的PfuDNA聚合酶和rTthDNA聚合酶，nTthDNA聚合酶可由其將RNA反轉錄后擴增出大量的DNA片斷，大大減化操作程序，提高了效率。當前第144頁\共有164頁\編于星期三\22點3.4緩沖液、Mg2+、DNA模板PCR常用的緩沖液是10～50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3～8.8)體系，注意不能把不同廠家的Taq酶與緩沖液交叉使用。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度高低明顯影響PCR產物的特異性和產量。一般選用2～5mmol/L的濃度。作為模板的可以是染色體DNA，也可是質粒DNA，通常PCR反應體系中所需的模板的量是102～105拷貝的靶序列。當前第145頁\共有164頁\編于星期三\22點4.PCR反應體系（20μl反應體系）1.6μldNTP(2.5mmol/L)，1.6μlMg2+(10mmol/L)，0.2μlTaqE(5U/μl)，1μlDNA(25ng/μL)，1μlupperPrimer(10μmol/L)，1μllowerPrimer(10μmol/L)，2.0μl10×Buffer，11.6μlH2O當前第146頁\共有164頁\編于星期三\22點PCR擴增程序

94℃變性3min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個循環(huán)；72℃保溫10min。反應停止后加溴酚藍5μL進行電泳，擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE作電泳緩沖液。電泳結束后將凝膠置于紫外可見分析儀上觀察照相。

當前第147頁\共有164頁\編于星期三\22點5.由基本PCR拓展的相關技術簡并PCR逆轉錄PCR(reversetranscriptionPCR)、反向PCR(invertedPCR)、巢式PCR(nestedPCR)、錨定PCRRealtimePCR分子標記：RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifie