分子生物常用技術(shù)未修改

第一節(jié)分子雜交技術(shù)一、核酸分子雜交的基本原理二、核酸探針及標(biāo)記三、核酸分子雜交的應(yīng)用

Southern印跡Northern印跡Western印跡原位雜交生物芯片

當(dāng)前第1頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)原理分子雜交技術(shù)是利用單鏈核酸堿基互補(bǔ)配對，抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其它分子的相互作用進(jìn)行目的核酸、蛋白檢測的技術(shù)。當(dāng)前第2頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)DNA變性在某些因素的作用下，雙鏈間氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，形成無規(guī)則線團(tuán)狀分子的過程。本質(zhì)是雙鏈間的氫鍵的斷裂當(dāng)前第3頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)

變性的DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的DNA單鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。變性復(fù)性復(fù)性：變性的逆過程。復(fù)性當(dāng)前第4頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)當(dāng)前第5頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子當(dāng)前第6頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)定義：核酸探針是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。二、核酸探針及標(biāo)記動(dòng)畫當(dāng)前第7頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)制備特異性探針?biāo)枰幕緱l件1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；2.有明確的基因產(chǎn)物;具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。當(dāng)前第8頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)探針?biāo)鶖y帶的標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：標(biāo)記后的探針的分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原來的分子結(jié)構(gòu)相同，絕不影響其堿基配對特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。標(biāo)記探針的檢測方法簡便、省時(shí)、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高。穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價(jià)廉。當(dāng)前第9頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)常用的探針標(biāo)記物：放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。當(dāng)前第10頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)三、分子雜交的應(yīng)用Southern印跡法Northern印跡Western印跡法原位雜交生物芯片當(dāng)前第11頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)一、Southern印跡雜交1975年，英國Southern創(chuàng)建DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測的方法。當(dāng)前第12頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測當(dāng)前第13頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)SouthernBlot-+動(dòng)畫當(dāng)前第14頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)二、Northern印跡雜交(Northernbloting)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性當(dāng)前第15頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高當(dāng)前第16頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)核酸原位雜交的基本步驟細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測當(dāng)前第17頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)利用FISH技術(shù)診斷Down綜合征圖示：利用21號(hào)染色體特異性探針對一位高齡妊娠婦女進(jìn)行產(chǎn)前診斷，未培養(yǎng)的羊水細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交,顯示所檢測的細(xì)胞均有3個(gè)雜交信號(hào),經(jīng)選擇性人工流產(chǎn)后確診為Down綜合征患兒。當(dāng)前第18頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室三、Westernblotting免疫印跡(Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)是檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的一項(xiàng)十分有效的方法。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第19頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室蛋白質(zhì)樣品電泳非標(biāo)記抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)熒光素酶或放射性同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）方法：MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第20頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)WesternBlotting

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第21頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第22頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)6/1/2023232.蛋白質(zhì)印跡法用于二級(jí)抗體的檢測有以下三種：放射性標(biāo)記的抗體與酶偶聯(lián)的抗體與生物素相偶聯(lián)的抗體當(dāng)前第23頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)24PTBBeta-actin---P+P++P+++P++++AproteingelstainedbyCoomassieBlueWesternanalysisusingtwospecificantibodies當(dāng)前第24頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)三種印跡技術(shù)的比較當(dāng)前第25頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)五、DNA芯片技術(shù)的概念基因芯片(Genechip)技術(shù)是指通過微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。當(dāng)前第26頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)基因芯片當(dāng)前第27頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)A.用于微陣列芯片制作的點(diǎn)樣儀。；B.封裝在卡盒中的微陣列芯片;C.用于微陣列芯片熒光標(biāo)記檢測的激光共聚焦掃描器；D.微陣列芯片的局部放大；E.微陣列芯片上固定DNA探針的示意圖。圖中藍(lán)色的DNA鏈?zhǔn)穷A(yù)先固定在芯片表面的捕獲探針，紅色的DNA鏈?zhǔn)桥c捕獲探針互補(bǔ)的靶DNA分子。當(dāng)前第28頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)生物芯片分析過程試樣處理點(diǎn)陣固定反應(yīng)或雜交芯片制作標(biāo)記洗滌檢測掃描光刻合成微量點(diǎn)樣噴墨純化、標(biāo)記光化學(xué)檢測電化學(xué)檢測計(jì)算處理當(dāng)前第29頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)生物芯片技術(shù)的應(yīng)用

applicationsofbiochiptechnology1.1998年底美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)將基因芯片技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一，足見其在科學(xué)史上的意義。當(dāng)前第30頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是快速簡便；三是可同時(shí)檢測多種疾病。如應(yīng)用于產(chǎn)前遺傳性疾病檢查，抽取少許羊水就可以檢測出胎兒是否患有遺傳性疾病，同時(shí)鑒別的疾病可以達(dá)到數(shù)十種甚至數(shù)百種，這是其他方法所無法替代的，非常有助于“優(yōu)生優(yōu)育”這一國策的實(shí)施。。當(dāng)前第31頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)又如對病原微生物感染診斷，目前的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)所需的時(shí)間比較長，檢查也不全面，醫(yī)生往往只能根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)做出診斷，降低了診斷的準(zhǔn)確率，如果在檢查中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)就能知道病人是哪種病原微生物感染；而且能測定病原體是否產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素敏感等等，這樣醫(yī)生就能有的放矢地制定科學(xué)的治療方案；當(dāng)前第32頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)生物芯片技術(shù)的應(yīng)用再如對具有高血壓、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接觸毒化物質(zhì)人群惡性腫瘤普查等等，如采用了基因芯片技術(shù)，立即就能得到可靠的結(jié)果，其他對心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、代謝性疾病等，如采用了基因芯片技術(shù)，其早期診斷率將大大提高，而誤診率會(huì)大大降低，同時(shí)有利于醫(yī)生綜合地了解各個(gè)系統(tǒng)的疾病狀況當(dāng)前第33頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)第二節(jié)目的基因制備技術(shù)當(dāng)前第34頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)一、PCR技術(shù)PCR技術(shù)：是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。經(jīng)n次擴(kuò)增后,一個(gè)DNA分子可變?yōu)?n個(gè)DNA分子。其中目的片斷為2n-2n，非目的片斷為2n。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第35頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)；1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第36頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)OUTLINE3concepts5EssentialComponents3stepsOnesentence

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第37頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)3ConceptsofthePCRDenaturation:

變性Renaturation：復(fù)性3.Semiconservativereplication：半保留復(fù)制thedoublestrand

DNAopentosinglestrandedDNAtwosinglestrandedDNAformdoublestrand

DNAreplication,onemaketwoMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第38頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)Semi-conservativereplicationOldnewMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第39頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)5

EssentialComponentsofPCRReaction

salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第40頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)Taq

DNAPolymeraseTaq:Thermusaquaticus2.95℃,T1/2(halflife)40min3.PolymerizationMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第41頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)Polymerization

聚合反應(yīng)Taq

PolymerasedTdAdGdCdT5’3’3’5’ATaq

polymerase:

72℃,2,000～4,000bases/minMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第42頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)threesteps:HowPCRworksDenaturation

(變性):90～97℃Annealing

(退火):45～55℃Extension

(延伸):

around72℃MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第43頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:Denaturation

變性94℃

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第44頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:Annealing

退火T

℃

primer-dependent

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第45頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:Extension

延伸72℃CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATCGCGATATTACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第46頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.Denaturation2.Annealing3.ExtensionPCR.EXEMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第47頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)LastStep:72

℃

2minAfter25~30cycles?MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第48頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)OnesentenceOnemakestwo,twomakefour,fourmakeanything一生二，二生四，四生萬物MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第49頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第50頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察1-2

小時(shí)5、PCR應(yīng)用MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第51頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)二、cDNA噬菌粒文庫基因文庫的類型基因組文庫：由某種生物體總?cè)旧wDNA組成的文庫。cDNA文庫：代表特定細(xì)胞或組織中mRNA的文庫。

一個(gè)細(xì)胞在任何時(shí)間可以產(chǎn)生幾千種不同的蛋白質(zhì)，所有的蛋白質(zhì)都有相應(yīng)的mRNA分子。為了鑒別其中任何一個(gè)mRNA分子，每一單獨(dú)mRNA的克隆都得考慮，但是mRNA不能直接用于克隆，因?yàn)樗懿环€(wěn)定，因此，可以合成與選定組織中所有mRNA互補(bǔ)的DNA分子（complementaryDNA，cDNA）。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第52頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)高質(zhì)量mRNA的制備反轉(zhuǎn)錄生成cDNA與噬菌粒載體分子相連接噬菌粒的包裝建立cDNA噬菌粒文庫的主要步驟MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第53頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)1、高質(zhì)量mRNA的制備用試劑盒提取總RNA加入與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育加入與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第54頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)2、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以寡聚dT或隨機(jī)6核苷酸為引物反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準(zhǔn)備與載體連接MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第55頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)為了得到有方向性的cDNA應(yīng)該接上不同的接頭加入帶有酶切位點(diǎn)的寡聚dT引物高活性的反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈合成cDNA第二鏈用RNaseH分解RNA鏈加EcoRI接頭用XhoI內(nèi)切酶切割得到雙接頭有方向性的cDNA(5'C↓TCGAG)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第56頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)3、與噬菌體載體分子相連接帶有接頭的cDNA噬菌粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶切割含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第57頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)4、噬菌粒的包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA體外蛋白質(zhì)外殼的包裝反應(yīng)有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體進(jìn)行基因組學(xué)的研究含有某種組織或器官的噬菌粒文庫MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第58頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第59頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)目的基因篩選MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細(xì)胞生物及遺傳學(xué)教研室當(dāng)前第60頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)6/1/2023南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院61第三節(jié)基因敲除技術(shù)1.基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸╣eneknock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。6/1/202361南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第61頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)1.基本原理基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。6/1/20236262南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第62頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)6/1/202363用取代型（a）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)?zāi)暇┺r(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第63頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)6/1/2023南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院64正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第64頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)第三節(jié)基因敲除技術(shù)2.高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。6/1/2023南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院656/1/202365南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第65頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)6/1/2023南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院66模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院當(dāng)前第66頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)第四節(jié)反義核酸及藥物一反義核酸概述二反義技術(shù)三反義核酸的應(yīng)用當(dāng)前第67頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)反義核酸的概念反義核酸是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物有機(jī)體合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段，這類特異的核酸片段能夠與目的序列結(jié)合，通過空間位阻效應(yīng)或誘導(dǎo)RNAase活性，在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)及翻譯等水平上，抑制或封閉目的基因的表達(dá)。當(dāng)前第68頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)反義核酸作用的區(qū)域1mRNA5’端非翻譯區(qū)包括SD序列及核糖體結(jié)合位點(diǎn)；2mRNA5’編碼區(qū)主要是起始密碼AUG；3mRNA5’末端帽子形成位點(diǎn)；4前體mRNA外顯子與內(nèi)含子結(jié)合部位；5mRNAPolyA形成位點(diǎn)；當(dāng)前第69頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)二、反義技術(shù)反義技術(shù)概念：根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物有機(jī)體合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段抑制或封閉目的基因表達(dá)的技術(shù)。當(dāng)前第70頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)（一）反義DNA反義DNA是人工合成的與待封閉基因的某一區(qū)段互補(bǔ)的正?；蚧瘜W(xué)修飾的DNA片斷，用來抑制或封閉這一基因的表達(dá)。（1）正常DNA片斷；（2）甲基磷酸型DNA片斷；（3）硫代磷酸型DNA片斷；（4）雙硫代磷酸型DNA片斷；（5）ɑ-構(gòu)型DNA片斷；（6）其他。當(dāng)前第71頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)（二）反義RNA是指核苷酸序列與其所調(diào)控的RNA的序列互補(bǔ)的RNA片斷。（三）肽核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在特定肽鏈上連接不同堿基，也就是以類氨基多肽鏈代替核酸中核糖磷酸骨架，并按一定序列結(jié)合上標(biāo)準(zhǔn)的A、T、C、G堿基所形成的肽核酸，這種肽核酸能與其互補(bǔ)的DNA或RNA特異性結(jié)合，從而抑制或封閉基因表達(dá)。當(dāng)前第72頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)三、反義核酸應(yīng)用

迄今為止，醫(yī)學(xué)界所了解的疑難雜癥絕大多數(shù)與體內(nèi)某些基因的病變有關(guān)，包括腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、糖尿病、視網(wǎng)膜黃斑退化癥、克羅恩氏癥（慢性結(jié)腸炎）、非典型性肺炎（SARS）、血管炎以及艾滋病引起的并發(fā)癥（如巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎）等，而反義藥物能在第一時(shí)間內(nèi)制止能產(chǎn)生致病蛋白質(zhì)的基因，如果可開發(fā)出針對上述病變基因的反義藥物，就能從源頭上遏制致病蛋白質(zhì)從而治療疾病當(dāng)前第73頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)早期開發(fā)的反義藥物大多使用人體固有遺傳物質(zhì)作為藥物骨架，而這類產(chǎn)品在進(jìn)入人體后很快就會(huì)被分解與排泄，所以實(shí)際使用效果大多不盡如人意。例如，上個(gè)世紀(jì)90年代已進(jìn)入Ⅲ期臨床的多種反義藥物（包括治療心血管再狹窄的藥物、抗多發(fā)性硬化癥的藥物與抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物等），均因在體內(nèi)試驗(yàn)后效果不明顯，而被美國FDA拒之門外。20世紀(jì)初，納米技術(shù)的新應(yīng)用使反義藥物的加工和體內(nèi)作用機(jī)理發(fā)生了翻天覆地的變化，自此之后反義藥物才真正成為一種可供臨床使用的新藥。反義藥物研究的一大新進(jìn)展是：將納米黃金顆粒加工成反義藥物的載體，使其更容易與靶器官結(jié)合，從而加快治療進(jìn)程當(dāng)前第74頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)第五節(jié)RNAi一、RNAi的發(fā)現(xiàn)及作用方式二、RNAi的應(yīng)用當(dāng)前第75頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)RNA干擾

一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),促使ｍRNA降解,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi,也譯作RNA干預(yù)或者干涉)。當(dāng)前第76頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了RNAi：首次發(fā)現(xiàn)dsRNA能夠?qū)е禄虺聊木€索來源于秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis.elegans)的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues嘗試用反義RNA(antisenseRNA)去阻斷par1基因的表達(dá)以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA的確能夠阻斷基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA(senseRNA)作為對照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。

ＧｕｏＳ,ＫｅｍｐｈｕｅｓＫＪ.ＰａｒＬ.[Ｊ].Ｃｅｌｌ,1995,81:611-620.當(dāng)前第77頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)

這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后1998才被解開———華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次將雙鏈dsRNA———正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈ＲＮＡ純化后注射線蟲時(shí),基因抑制效應(yīng)變得十分微弱,而經(jīng)過純化的雙鏈ＲＮＡ能夠高效地特異性阻斷同源基因的表達(dá)。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈ＲＮＡ已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá)。后來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈ＲＮＡ不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為ＲＮＡ干擾。

ＦｉｒｅＡ,ＸｕＳ,ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙＭＫ,ｅｔａｌ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅ,1998,391:806～811.當(dāng)前第78頁\共有87頁\編于星期五\18點(diǎn)現(xiàn)有的RNAi機(jī)制的模型

通過生化和遺傳學(xué)研究，產(chǎn)生了現(xiàn)有的RNAi作用機(jī)制模型，包括起始階段和效應(yīng)階段.在起始步驟，加入的dsRNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段（smallinterferingRNAs，siRNAs）.

在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）。激活RISC需要一