檢驗技術離心機

檢驗技術離心機第一頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日2經(jīng)典的分離分析技術：離心技術、電泳技術、光譜技術、色譜技術第二頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日3

離心現(xiàn)象是指物體在離心力場中表現(xiàn)的沉降運動現(xiàn)象。應用離心沉降進行物質(zhì)的分析和分離的技術稱為離心技術（centrifugaltechnique）,實現(xiàn)離心技術的儀器是離心機（centrifuge）。前言概念:第三頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日4離心技術的應用:主要用于各種生物樣品的分離、純化和制備低速離心機主要用于細胞、細胞核、細胞膜、細菌的沉淀和收集；高速離心機多用于制備和收集微生物、細胞碎片、大的細胞器、硫酸銨沉淀物以及免疫沉淀物等；超速離心機已成為分離、提純、鑒定、分析線粒體、微粒體、染色體、溶酶體、質(zhì)粒、病毒、大分子核酸和高分子蛋白質(zhì)第四頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日5第五頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日6第一節(jié)離心技術原理第二節(jié)離心機結構第三節(jié)離心方法第四節(jié)高、超速離心技術

主要內(nèi)容第六頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日7教學基本要求1.掌握離心技術的基礎原理，常用的離心方法.2.熟悉離心機的分類與結構，各種離心機的臨床應用3.了解離心機的維護、離心方法的進展第七頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日8

一、離心力

二、相對離心力

三、沉降系數(shù)

四、沉降速度第一節(jié)離心技術原理第八頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日9重力時間當懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用可使得其中懸浮的顆粒逐漸下沉，下沉的速度與微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場的強度及液體的黏度有關。如紅細胞顆粒，直徑為數(shù)微米，可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象。重力沉降：混合液靜置一段時間后第九頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日10擴散現(xiàn)象

擴散是由于微粒的熱運動而產(chǎn)生的質(zhì)量遷移現(xiàn)象,主要是由于密度差引起的。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的，因為顆粒越小，與溶液密度越相近，擴散現(xiàn)象則越嚴重，而沉降越慢。

擴散現(xiàn)象是不利于樣品分離的，如果加大重力，就可能克服擴散現(xiàn)象的不利影響,實現(xiàn)生物大分子的分離。

第十頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日11離心沉降：在離心機中，離心管（centrifugetube）放于離心轉頭里，當離心機開動時，離心管繞離心轉頭的軸旋轉，作圓周運動，在離心管內(nèi)的樣品顆粒將同樣運動。第十一頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日12

假如顆粒處于真空中，顆粒會沿切線方向飛去,也就是當離心管由圖中的0位轉到1位時，顆粒到達離心管底部A位。對于離心管而言，樣品顆粒由頂位移到了A位，也就是由離心管頂部移到了底部，這與重力場中的由高處落到低處相似。這種顆粒在圓周運動時的切線運動稱為離心沉降.

實際上顆粒是在介質(zhì)中運動的，顆粒作切線運動時將由于介質(zhì)的摩擦阻力，使其在離心管中依圖中虛線所示的曲線運動，當離心管由0位轉到2位時，顆粒由頂位移到B位。介質(zhì)的阻力越大，顆粒的沉降速度越小、沉降的距離也越短。旋轉速度越大，顆粒的沉降越快。第十二頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日13在離心力場中加速度達到數(shù)萬甚至數(shù)十萬倍重力加速度時，顆粒的沉降也加快了同樣的倍數(shù)。這就使得許多在重力場中不能沉降的細小顆粒及密度較低的物體組份能用離心技術進行分離純化。5ml血液離心5分鐘血漿血細胞第十三頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日14離心機工作原理:懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而使溶液得以分離、濃縮和提純，顆粒的沉降速度取決于離心機的轉速、物質(zhì)的沉降系數(shù)、顆粒的質(zhì)量、大小和密度。血漿試管離心沉降物血液第十四頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日15一、離心力當物體所受外力小于運動所需要的向心力時，物體將向遠離圓心的方向運動。物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象。也叫離心運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。旋轉離心力離心運動：第十五頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日16離心作用是根據(jù)在一定角速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2r與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

式中ω是旋轉角速度，Ｎ(rpm)是每分鐘轉頭旋轉次數(shù)，r為離心半徑(cm)，m是質(zhì)量。離心作用、離心力：第十六頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日17二、相對離心力(relativecentrifugalforce，RCF)

相對離心力是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。

由于各種離心機轉子的半徑或離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力也不同,因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力,例如25000×g,表示相對離心力為25000。只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。一般情況下,低速離心時相對離心力常以轉速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。=1.118×10-5×(rpm)2×rg為地球重力加速度(980cm·sec-2)第十七頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日18通常稱離心管頂部到旋轉中心的距離為最小離心半徑rmin，該處承受的離心力場為最小離心力場；稱離心管底部到旋轉中心的距離為最大離心半徑rmax，該處承受的離心力場稱為最大離心力場。最小離心半徑最大離心半徑在計算時規(guī)定旋轉半徑均用平均半徑“Rav”代替：第十八頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日19三、沉降系數(shù)微粒(分子)的沉淀性質(zhì)以沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient，S)表示，其量綱為秒(s)。1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。積分得:(X1為離心前粒子離旋轉軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉軸的距離)

若ω用2πn／60表示，則:定義10-13s為一個Ｓvedberg單位，即１Ｓ＝10-13s。第十九頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日20四、沉降速度(sedimentationvelocity)沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的黏度；ρp為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度.將2-7代入2-4可得①當ρp

＞ρm，則S>O，粒子順著離心方向沉降；②當ρp=ρm，則S=o，粒子到達某一位置后達到平衡；③當ρp

＜ρm，則S<0，粒子逆著離心方向上浮。第二十頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日21Fc=FB+Ff

+FKFc：離心力FB：由離心力場所引起的浮力Ff：摩擦阻力FK:擴散作用力

Fc=FB=Ff=f·(dx/dt)（f為摩擦系數(shù)，單位是g/s)FbFgFBFf沉降速度的推導方法:代入上式得：dx/dt=縱向力橫向力Fc-fFK第二十一頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日22第二節(jié)離心機構造一、各式離心機的主要結構裝置二、驅(qū)動部分三、制冷和溫度控制四、離心機的主要類型第二十二頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日23離心機的主要構件組成:驅(qū)動電機制冷系統(tǒng)(高速離心機)真空系統(tǒng)(超離離心機)

顯示系統(tǒng)自動保護系統(tǒng)控制系統(tǒng)必要配件:離心轉頭和離心管第二十三頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日24第二十四頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日25一、各式離心機的主要結構裝置第二十五頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日26二、驅(qū)動部分(一)轉頭室轉頭室的設計要求:安全、密閉、隔熱①應具有一定的強度，外有防護鋼板，保證內(nèi)部破裂飛濺物不能擊穿飛出。②達到高速旋轉時，自動鎖定，不能人為地開啟。③有隔熱保護屋。④有蒸發(fā)盤管組成的內(nèi)室壁，壁的材質(zhì)為不銹鋼的，便于清潔消毒和耐蝕。⑤有真空裝置的轉頭室，對室蓋、電機軸與轉室交換處設有密封裝置，保證轉頭室具有良好的密封性。第二十六頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日271．轉頭的型式(1)角式轉頭(2)蕩平式轉頭(3)垂直轉頭(4)區(qū)帶轉頭(5)連續(xù)流動轉頭連續(xù)流動轉頭扇形小室葉片徑向?qū)Ч軈^(qū)帶轉頭垂直轉頭敞開式轉頭角式轉頭第二十七頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日282．離心管設計要求:高強度、耐熱、透明性

(1)塑料離心管聚乙烯(polyethylene，PE)

聚碳酸酯(po1ycabonate，PC)

聚丙烯(poly-propylene，PP)特點:透明(或半透明)，硬度小，能耐高溫消毒，可用穿刺法取出梯度,易變形，抗強酸強堿及某些有機溶劑腐蝕性差，使用壽命.(2)不銹鋼管特點:強度大，不變形，能抗熱、抗凍、抗化學腐蝕。但價格高(3)玻璃試管特點:耐熱和透明性好，強度差3．管帽第二十八頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日29(二)驅(qū)動電機多為串激式,包括定子和轉子兩部分第二十九頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日30(三)轉速調(diào)節(jié)系統(tǒng)1．交流變頻調(diào)速將逐步取代直流調(diào)速2．多功能、自動化和微機控制第三十頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日31三、制冷和溫度控制１．制冷系統(tǒng)高超速離心機和一部分低速大容量制備用離心機配置2．溫度控制轉頭室內(nèi)的溫度由測溫元件完成,如蒸汽壓力式溫度表、半導體熱敏電阻和紅外線遙感元件。測溫元件感測到的信號，通過放大器放大來控制制冷系統(tǒng)第三十一頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日32四、離心機的主要類型根據(jù)用途：分析型、制備型、分析－制備型根據(jù)操作方式：間歇、連續(xù)和半連續(xù)

根據(jù)分離形式：沉降式和過濾式

根據(jù)離心機轉速：分常速(低速)、高速和超速

根據(jù)結構特點：管式、吊籃式、轉鼓式和碟式

根據(jù)是否冷凍：高速冷凍離心機、大容量冷凍離心機第三十二頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日33制備性離心機:用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大

分析性離心機:

一般都帶有光學系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)第三十三頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日341.制備性離心機:

根據(jù)轉速常速（低速）高速超速rpm

500010000~25000＞25000ＲＣＦ6000×g89000×g＞89000×g適用分離對象細胞微生物菌體、大細胞器亞細胞器、病毒和和細胞碎片等

生物大分子等第三十四頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日352.分析性離心機:都是超速離心機使用了特殊設計的轉頭和光學檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程，從而確定其物理性質(zhì)在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個“峰”，由于沉降不斷進行，界面向前推進，因此峰也移動，從峰移動的速度可以計算出樣品顆粒的沉降速度。第三十五頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日36第三節(jié)離心方法一、分離離心法二、分析離心法三、普通低速離心機使用的注意事項第三十六頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日37離心方法分類：差速離心法密度梯度離心方法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法分離離心方法分析離心方法：監(jiān)測沉降過程，研究生物大分子的沉降特性和結構第三十七頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日38一、分離離心法又稱制備離心法，包括差速離心法和密度梯度離心法第三十八頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日391．差速離心法

是以不同離心力來分離不同質(zhì)（沉降系數(shù)）的微粒的一種動力學方法，因不同的粒子在同一離心條件的離心力場中沉降速度不同，若不斷增加相對離心力，一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子將分步沉淀。原理：速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第三十九頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日40用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

特點及應用：

特點：分辨率不高；離心次數(shù)多，操作繁雜；產(chǎn)品的純度和回收率都達不到理論值。應用：用于組織勻漿液中細胞器和病毒的分離及其他分離手段之前的粗制品提取。如破碎細胞各組分(細胞核、細胞膜碎片、線粒體、溶酶體、核糖體)的沉淀分離。第四十頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日412．密度梯度離心法原理：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

分類：依據(jù)離心分離原理。（連續(xù)密度梯度離心法）

（不連續(xù)密度梯度離心法）

第四十一頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日42(1)速率區(qū)帶離心法原理：

在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖)，把待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，與梯度液一起離心?？拷D軸處的介質(zhì)密度最小，離旋轉軸最遠處的介質(zhì)密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度。

這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。

第四十二頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日43梯度液（聚蔗糖(ficoll)、硅溶膠(pereoll)及蔗糖(sucrose)）在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。第四十三頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日44特點及應用：特點：分辨力高，但離心時間要嚴格控制。應用：速率區(qū)帶離心法是一種動力學方法，適用于測定生物大分子顆粒的沉降系數(shù)。速率區(qū)帶離心是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般應用于物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。第四十四頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日45(2)等密度區(qū)帶離心法原理：根據(jù)樣品組分的密度差別進行分離純化，一般是將待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合

，密度梯度液柱的密度范圍很大，液柱底部的密度明顯大于樣品組分的密度。如果樣品中有幾個密度不相同的組分，它們將分別集中于密度梯度液柱中相應的密度位置上，形成幾個分離的區(qū)帶，收集各個區(qū)帶即得到各個提純的組分。第四十五頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日46分辨力高，耗時。是一種測定生物大分子或顆粒的浮力密度的靜力學方法。此法一般應用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時，如分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，簡單蛋白質(zhì)不適用。梯度介質(zhì)通常為氯化銫(CsCl)特點及應用：第四十六頁，共五十三頁，編輯于2023年，星期日47二、分析離心法目的:

為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組分。方法:

使用特殊的轉子和檢測手段，連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程

沉降速度法沉降平衡法等密