微生物標本送檢的重要性與臨床應用

微生物標本送檢的重要性與臨床應用九0三醫(yī)院檢驗科李佳當前第1頁\共有89頁\編于星期四\17點參考標準及指南當前第2頁\共有89頁\編于星期四\17點參考標準及指南當前第3頁\共有89頁\編于星期四\17點一、微生物標本采集送檢的要點二、解讀微生物檢驗結果三、答疑解惑四、2014年四川地區(qū)細菌分布及耐藥性分析當前第4頁\共有89頁\編于星期四\17點感染性疾病感染的病原體：

細菌，病毒，真菌，寄生蟲，非典型病原體（支原體、衣原體、軍團菌、非結核分枝桿菌、螺旋體）等感染的部位：

各臟器（肝膽胰脾腎心肺胃腸道生殖泌尿道以及中樞神經系統(tǒng)等）、皮膚軟組織……….當前第5頁\共有89頁\編于星期四\17點醫(yī)院常見的感染性疾病呼吸道感染：

上呼吸道感染

下呼吸道感染：氣管（支氣管）炎

社區(qū)獲得性肺炎CAP

院內獲得性肺炎HAP泌尿系感染：上、下血流感染（敗血癥）腹部感染：腹膜、肝膽胰脾腎、盆腔中樞神經系統(tǒng)感染其他：心內膜炎、骨髓炎、關節(jié)化膿性病變…….

當前第6頁\共有89頁\編于星期四\17點TB-MDR

病原體的多樣化和復雜化

H7N9SARS

超級細菌當前第7頁\共有89頁\編于星期四\17點

我們應該追求：

“準確的病原學診斷”

“針對性病原學治療”

正確的微生物標本采集和運送，是準確的病原學診斷的前提！

微生物讓人類步步為營，當前第8頁\共有89頁\編于星期四\17點痰培養(yǎng)標本采集與運送當前第9頁\共有89頁\編于星期四\17點咳痰標本的采集標本采集方法醫(yī)師或護士直視下采集標本病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液當前第10頁\共有89頁\編于星期四\17點病原體種類繁多而復雜使下呼吸道感染病原診斷成為難題細菌（包括放線菌與奴卡菌，厭氧菌與分枝桿菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原體、衣原體與立克次體原蟲寄生蟲當前第11頁\共有89頁\編于星期四\17點咳痰途經口咽部唾液中口咽部定植菌的濃度可達108-109/ml。研究顯示，國內常規(guī)痰標本中約半數存在唾液嚴重污染現象。不可避免地受到污染當前第12頁\共有89頁\編于星期四\17點下呼吸道感染病原學診斷注意事項痰標本的正確采集（包括導痰）痰標本及時運送和處理的重要性痰標本的洗滌與勻化痰涂片：質量評估和細菌、真菌初步報告接種平板：質量與質控，血、巧克力、麥康凱、沙保弱培養(yǎng)環(huán)境：CO2培養(yǎng)時間：24h，48h菌落觀察要點結果報告：所有菌種（群），包括半定量臨床意義判定其他病原體的檢測：結核、真菌、厭氧菌、非典型病原體當前第13頁\共有89頁\編于星期四\17點關于咳痰標本在抗生素應用前采集痰標本;標本采集后1～2h內必須立即進行實驗室處理；咳痰標本應用最早且廣泛，但也是最受爭議的標本;取標本前應摘去牙托，清潔口腔如刷牙和漱口;深咳，采集標本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務人員指導;無痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導痰；也可用物理療法、體位引流、鼻導管抽吸等法取痰；當前第14頁\共有89頁\編于星期四\17點痰培養(yǎng)的送檢次數對于普通細菌性肺炎，痰標本送檢每天1次，連續(xù)2～3天。不建議24h內多次采集，除非痰液外觀性狀出現改變；懷疑分枝桿菌感染者，應連續(xù)收集3天清晨痰液送檢；當前第15頁\共有89頁\編于星期四\17點痰培養(yǎng)的拒收光學顯微鏡細胞學檢查發(fā)現口咽分泌物污染明顯。沒有標簽或貼錯標簽。運送容器選擇不當或有滲漏。標本采集不符合要求。同一天同一試驗重復送檢2次。延時送至實驗室的標本。當前第16頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)標本采集與運送當前第17頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)的采集時間對懷疑菌血癥、真菌血癥的患者，在考慮使用抗菌藥物之前，采集血培養(yǎng)標本。發(fā)熱前半小時，寒戰(zhàn)高熱期必須同時或間隔短時間內采集２套以上血培養(yǎng)標本。當前第18頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)的采集次數患者：推薦同時采集２－３套（不同部位）血培養(yǎng)標本。（即雙瓶雙臂同時采集血培養(yǎng)標本。）嬰幼兒患者：推薦同時采集２次（不同部位）血培養(yǎng)標本。當前第19頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)的采血量成年患者：推薦采血量為每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。嬰幼兒患者：推薦采血量每瓶不少于2ml。（少于病人總血容量的1%）當前第20頁\共有89頁\編于星期四\17點血液標本在需氧瓶和厭氧瓶中的分配常規(guī)血培養(yǎng)組合：一個需氧瓶和一個厭氧瓶作為一套血培養(yǎng)。當被用來做培養(yǎng)的采血量少于推薦值時，血必須首先接種需氧瓶，然后將剩余的血液接種入厭氧瓶。當前第21頁\共有89頁\編于星期四\17點皮膚消毒推薦使用碘町、洗必泰或碘伏作為皮膚消毒劑。碘町作用1min碘伏作用1.5-2min洗必泰作用時間與碘町一樣（但不能用于少于2個月嬰兒皮膚消毒）當前第22頁\共有89頁\編于星期四\17點采集部位推薦從外周靜脈采集血液標本。不推薦動脈血，因其診斷價值沒有比靜脈血更大。不推薦靜脈留置導管，因其常伴有高污染率。如果必須從留置導管內采血，也應同時從外周靜脈采集另外一個血培養(yǎng)標本以幫助陽性結果的判讀提供解釋。當前第23頁\共有89頁\編于星期四\17點采集方法在采血之前，血培養(yǎng)瓶的橡皮塞需使用70%酒精消毒并干燥。然后再進行穿刺部位的皮膚消毒。嚴格按照“酒精、含碘消毒劑、酒精”的消毒步驟操作，并等待足夠的消毒時間。嚴格無菌操作，不允許在皮膚消毒后用手接觸靜脈，除非帶有無菌手套。不推薦采血和接種血培養(yǎng)瓶更換注射器針頭。當前第24頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)標本的運送采集后的血培養(yǎng)瓶應在1小時之內送往實驗室。血培養(yǎng)瓶在采血接種后在室溫不超過數小時。血培養(yǎng)瓶在接種前和接種后均不得冷藏或冷凍。當前第25頁\共有89頁\編于星期四\17點血培養(yǎng)標本的拒收瓶子上帖的標簽錯誤或未帖標簽。血培養(yǎng)瓶打破的、損壞的或滲漏。血液凝固。當前第26頁\共有89頁\編于星期四\17點尿培養(yǎng)標本采集與運送當前第27頁\共有89頁\編于星期四\17點你知道嗎？尿液通常是無菌的或一過性有少量微生物，但是尿道內或尿道周圍皮膚的菌群會污染尿液標本，從而可能導致錯誤的培養(yǎng)結果。診斷癥狀明顯的病人（如尿急、尿頻、尿痛），一份標本就已足夠，治療48-72小時后再采集第二份標本。對于癥狀不明顯的病人，需采集2-3份標本。懷疑腎結核時，應連續(xù)3天采集晨尿。多次收集或24小時尿不能用作培養(yǎng)。申請單上必須注明病人癥狀是否明顯，這對于定量培養(yǎng)分析非常重要，尤其只有少量尿液標本。室溫都有利于病原菌和污染菌會生長繁殖，因此若30min內不能及時培養(yǎng)尿液則必須冷藏，但也不能超過24小時。當前第28頁\共有89頁\編于星期四\17點尿培養(yǎng)標本清潔中段尿導尿導管尿經恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內尿液送檢標本以晨起第一次尿液為佳不能立即送檢者，可暫存4℃冰箱，但保存不超過8h當前第29頁\共有89頁\編于星期四\17點清潔中段尿液盡量取早晨第一次尿液棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿詳細告知病人以下操作步驟女性病人收集標本前用清洗液沖洗干凈，從前向后仔細擦洗尿道區(qū)域分開陰唇，開始排尿排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人回縮包皮并清洗龜頭排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿當前第30頁\共有89頁\編于星期四\17點導尿管尿液集尿袋內的尿液不能用作培養(yǎng)；導尿管末端的尿液也不能用于培養(yǎng)，因為很難避免沒有尿道菌群污染。留置導管尿液標本常通過專門的采樣端口采集，不能把導尿管與尿袋拔開后收集尿液。采樣端口用酒精消毒；必要時，可先夾住導尿管但不能超過30分鐘；將注射器針頭插入采樣端口，抽吸出尿液；注入無菌杯或試管中當前第31頁\共有89頁\編于星期四\17點恥骨上穿刺吸取尿液常用于患兒、泌尿道厭氧菌感染或脊柱損傷病人等?？杀苊饽虻阑驎幖毦奈廴?，但對膀胱內少量尿液的小兒難以實施。方法：消毒自臍以下至尿道之間區(qū)域的皮膚，局麻穿刺點部位；在恥骨聯合與臍連線上，高于恥骨聯合2cm處進針刺入膀胱；取20ml尿液；置于無菌容器中并送往實驗室?？捎糜趨捬蹙鷻z測當前第32頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便培養(yǎng)標本采集與運送當前第33頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本的采集方法自然排便采集標本時，取有膿血、粘液、組織碎片部份的糞便1～3g。液體糞便則取絮狀物，一般取1～3ml，直接裝入糞便容器或運送培養(yǎng)基中送檢。直腸拭子采集糞便標本：先以肥皂、水和70%酒精，將肛門周圍洗凈，然后用經無菌鹽水濕潤的棉拭子插入肛門超越肛門括約肌約2-4cm，與直腸粘膜表面接觸，輕輕旋轉，必須將棉拭子置于運送培養(yǎng)基中送檢。當前第34頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本的運送一般糞便標本裝于無菌封閉廣口塑料杯；直腸拭子置于Cary－Bair拭子轉運系統(tǒng)。做霍亂弧菌檢查的糞便標本置于堿性蛋白胨水試管中。糞便標本：室溫1小時內送至。直腸拭子：室溫1小時內送至。高度懷疑霍亂弧菌感染的標本室溫1小時內送至，運送必須符合特殊標本的安全要求。當前第35頁\共有89頁\編于星期四\17點你知道嗎？住院超過3d或入院診斷不是胃腸炎的患者不做常規(guī)糞便培養(yǎng)。除嬰兒和有活動性腹瀉癥狀的患者外不推薦用拭子做常規(guī)病原檢測。有腹部痙攣的患者在發(fā)病6h內采集到的血便或液狀便的效果最好。對于弧菌的培養(yǎng)需要提出特別申請。當前第36頁\共有89頁\編于星期四\17點腦脊液標本采集與運送當前第37頁\共有89頁\編于星期四\17點腦脊液標本的采集方法以70%酒精或2%碘酊消毒背部下方，并麻醉之；然后以一特制通管針，輕輕的由第三與第四腰椎間的中線部位穿刺入脊髓蛛網膜，采集約3-5ml腦脊液于3支無菌試管中，每支試管至少1-2ml；然后馬上將第2支（或第1支）送至實驗室。做腦脊液培養(yǎng)時，建議同時做血培養(yǎng)。腰穿時必須作徹底消毒和無菌操作。當前第38頁\共有89頁\編于星期四\17點腦脊液標本的運送常溫立即送檢，實驗室收到標本后應立即接種。腦脊液標本送檢的理想時間為15分鐘內，半小時送檢是可接受的，如果送檢時間超過1小時，則會影響結果，在結果報告時，在備注處注明此情況。如不能及時送檢，可使用血培養(yǎng)瓶（懷疑腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染時，請勿使用血培養(yǎng)瓶）當前第39頁\共有89頁\編于星期四\17點穿刺液標本采集與運送當前第40頁\共有89頁\編于星期四\17點穿刺液標本的采集方法由臨床醫(yī)生進行。膽汁的采集方法有三種：十二指腸引流法（以“B”管—來自膽囊，做細菌培養(yǎng)意義較大）、膽囊穿刺法及手術采取法，由臨床醫(yī)生采取，約2ml左右放入無菌密封容器立即送檢。其它穿刺液的采集方法：2%碘酊消毒要穿刺的皮膚后，由臨床醫(yī)生穿刺采集標本（2ml左右），裝入無菌密封容器立即送檢。當前第41頁\共有89頁\編于星期四\17點穿刺液標本的送運采集后應正確蓋好，防止泄漏或容器外部留有殘留物。保溫立即送檢，保證在≤15min內送至實驗室，實驗室收到標本后應立即接種。為提高陽性率，像胸腹水等標本，可接種到血培養(yǎng)瓶中送檢。當前第42頁\共有89頁\編于星期四\17點手術切口與軟組織感染標本采集與運送當前第43頁\共有89頁\編于星期四\17點皮膚組織標本標本的選擇更大程度上依賴于感染的程度和性質而不是可疑的病原體。對大多數開放傷口，采集前應先去除表面菌群。除非有滲出物，干燥、結痂傷口一般不做培養(yǎng)。閉合膿腫應取滲出物和膿腫壁標本。開放膿腫處理同開放傷口。燒傷傷口應在廣泛清洗和清創(chuàng)術后采集培養(yǎng)。建議取活檢標本，傷口表面定量培養(yǎng)不一定有意義。代表性的標本應采自病灶活動區(qū)域或基底部有而不僅僅是膿液。當前第44頁\共有89頁\編于星期四\17點采集方法未破裂膿腫：不能用拭子。消毒覆于膿腫表面的皮膚，用注射器將膿腫內容物吸出。然后切開膿腫、引流，取部分膿腫壁送檢。送檢時，標本都置于厭氧培養(yǎng)基中。開放病灶和膿腫：盡量去除表面菌群，用拭子采集病灶及底部或邊緣的標本，置于需氧培養(yǎng)基中。也可對滲出液作厭氧培養(yǎng)。開放病灶不能做厭氧培養(yǎng)。燒傷傷口：清創(chuàng)，出現滲出液后以拭子用力采集，僅作需氧培養(yǎng)。也可送檢活檢組織標本。膿皰或水皰：酒精消毒使之干燥，對于患兒用23號針頭挑破膿皰，拭子采集膿皰液和基底部標本。標記：不要只寫“傷口”標記標本，應有專門的描述和解剖來源。注明滲出液來自開放傷口還是閉合傷口。當前第45頁\共有89頁\編于星期四\17點注意事項迅速送往實驗室，1小時內不能培養(yǎng)應將標本冷藏。皮膚消毒對培養(yǎng)結果至關重要。革蘭染色對標本進行評估。涂片中如出現上皮細胞提示標本已被污染。沒有上皮細胞而有白細胞說明標本采集正確。不要僅送檢膿液。膿液不能代表傷口特點，應在病灶活動區(qū)域或基底部采集標本。小兒要求：小兒感染常出現皮疹如水泡等，應在這些地方仔細采集標本培養(yǎng)以發(fā)現病原體。創(chuàng)傷標本如沒有炎性細胞可能說明采集了表皮正常菌群，與疾病過程無關，應重新采集。當前第46頁\共有89頁\編于星期四\17點一、合格的微生物標本是準確的病原學診斷的前提二、解讀微生物檢驗結果二、臨床常見的問題的答疑解惑三、2014年四川地區(qū)細菌分布及耐藥性分析當前第47頁\共有89頁\編于星期四\17點細菌涂片報告鑒定及藥敏報告當前第48頁\共有89頁\編于星期四\17點細菌涂片結果的解讀痰標本糞便標本無菌體液標本（尿液，穿刺液，腦脊液，膿液等）當前第49頁\共有89頁\編于星期四\17點痰液標本涂片報告解讀

痰標本細菌涂片：病人信息，標本質量評估，細菌種類，排列，細菌數量，特殊形態(tài)當前第50頁\共有89頁\編于星期四\17點痰標本細菌涂片當前第51頁\共有89頁\編于星期四\17點合格：WBC>25/LP鱗狀上皮細胞<10/LP混合標本：WBC>25/LP鱗狀上皮細胞10--25/LP非深部咳痰標本WBC<25/LP鱗狀上皮細胞>25/LP痰標本質量評估

當前第52頁\共有89頁\編于星期四\17點>10鱗狀上皮細胞/LPF——拒收！彈性纖維，中性粒細胞多，鱗狀上皮細胞少，有代表性的好標本。評估標本是否格WBC>25/LPF鱗狀上皮細胞<10/LPF痰液標本當前第53頁\共有89頁\編于星期四\17點淋病奈瑟氏菌or腦膜炎奈瑟氏菌革蘭陽性雙球菌提示肺炎鏈球菌初步判定致病菌：特殊形態(tài)、特殊結構、胞內吞噬當前第54頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本涂片報告解讀糞便標本細菌涂片：

病人信息，細菌總數評估，細菌種類，細菌比例當前第55頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本革蘭染色查菌群比例當前第56頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本革蘭染色查菌群比例當前第57頁\共有89頁\編于星期四\17點糞便標本革蘭染色查菌群比例當前第58頁\共有89頁\編于星期四\17點尿液涂片報告解讀尿液細菌涂片：病人信息、細菌種類細菌數量涂片與培養(yǎng)結果不符：涂片查見G+球菌及G-桿菌培養(yǎng)卻只有一種菌？？？優(yōu)勢菌大量生長當前第59頁\共有89頁\編于星期四\17點膿液標本涂片報告解讀膿液細菌涂片：病人信息細菌種類細菌數量涂片與培養(yǎng)結果不符：涂片查見大量G+球菌培養(yǎng)結果卻是陰性？？？

厭氧菌?。?！當前第60頁\共有89頁\編于星期四\17點無菌體液標本涂片報告解讀無菌體液標本（穿刺液，腦脊液等）細菌涂片：

病人信息，細菌種類，細菌數量當前第61頁\共有89頁\編于星期四\17點細菌鑒定及藥敏報告包括：病人信息，細菌鑒定結果，細菌計數，藥敏分析結果，耐藥機制

備注（耐藥機制解釋，天然耐藥規(guī)則，藥敏推導規(guī)則。。。）當前第62頁\共有89頁\編于星期四\17點陰性報告痰標本：培養(yǎng)兩日，正常菌群生長糞便：培養(yǎng)兩日，

未分離出沙門志賀菌尿液：培養(yǎng)兩日，無細菌生長>3種菌，考慮污染

未達到判定標準只報細菌種類及數量血培養(yǎng)：培養(yǎng)五日，無細菌生長無菌標本：培養(yǎng)兩日，無細菌生長

當前第63頁\共有89頁\編于星期四\17點陽性報告細菌種類細菌計數：痰培養(yǎng)尿培養(yǎng)藥敏分析結果：MIC敏感度耐藥機制當前第64頁\共有89頁\編于星期四\17點痰標本半定量培養(yǎng)結果

分級劃線區(qū)菌落數相當菌落數cfu/ml臨床意義一區(qū)二區(qū)三區(qū)1+<10≤10E4多為污染菌2+>10<510E5污染可能性大，建議重復培養(yǎng)3+>10>5<510E6感染可能性大建議重復培養(yǎng)4+>10>5>510E7多位感染病原菌當前第65頁\共有89頁\編于星期四\17點尿標本半定量培養(yǎng)結果病人留取方式有意義的菌落形成單位/ml無癥狀者清潔中段尿10e5有癥狀，不固定清潔中段尿10e41-2種機會致病菌，若多余2種則為污染有癥狀，性活躍女性清潔中段尿100個純菌落腸桿菌科細菌男性清潔中段尿10e3個，機會致病菌所有內置導尿管10e5任意數量機會致病菌所有直接導尿100個任意數量機會致病菌所有手術取得任意數量所有膀胱穿刺任意數量所有任意標本金黃色葡萄球菌當前第66頁\共有89頁\編于星期四\17點藥敏實驗報告當前第67頁\共有89頁\編于星期四\17點CLSI藥敏折點當前第68頁\共有89頁\編于星期四\17點正確理解細菌的藥敏報告意義?體外藥敏試驗的局限性?CLSI藥敏標準制定中的局限性?體外藥敏試驗不能反應病原菌和藥物在體內的 動態(tài)變化?體外藥敏判斷標準未考慮藥代學因素藥物本身 的特性(PK/PD)

不能完全反映體內的抗 菌效果當前第69頁\共有89頁\編于星期四\17點CLSI(NCCLs)的藥敏標準:

正常劑量藥物進入體內后血液中最高濃度(Cmx)與該藥物體外最低抑菌濃度（MIC）間的關系所制定。

一般情況下

Cmx高于待檢菌MIC4-8倍:敏感（S）

Cmx/MIC=1-2倍:Cmx/MIC<1:中介度(I);

耐藥(R)。CLSI還沒有對局部感染的藥敏判斷標準。如果在上述高藥物濃度部位感染時，按CLSI制定的標準判斷敏感性就不能獲得體外藥敏和體內療效一致的結果。CLSI藥敏標準制定中的局限性當前第70頁\共有89頁\編于星期四\17點

WHY?!我認真做了 的呀!

醫(yī)技與臨床的不和諧感控、藥學、微生物臨床一線當前第71頁\共有89頁\編于星期四\17點疑問一？？微生物檢驗時效性太差，一般需要3-5天出報告當前第72頁\共有89頁\編于星期四\17點對原始標本進行革蘭染色快速鑒定及藥敏1當前第73頁\共有89頁\編于星期四\17點

快速鑒定藥敏結果全自動鑒定藥敏儀器可以幫助實現48小時報告結果更快的為臨床提供準確的抗生素結果!當前第74頁\共有89頁\編于星期四\17點1day：接種標本涂片并接種，按標本類型分類有序的放入各籃筐里孵育培養(yǎng)。

2day：一位人員8:00am先把細菌較純的標本上機，再上機其它的標本。上機時間：8:00am

報告時間：上機當天3:00pm后陸續(xù)審核發(fā)送報告1day：接受標本接種無分類孵育。

2day：處理完所以標本后k開始上機鑒定藥敏時間:10:30am

3

day：報告時間：審核發(fā)送報告oldnew至少提前18-24h！當前第75頁\共有89頁\編于星期四\17點工作流程時間(分鐘)n=5株菌n=24株菌n=96株

菌涂布標本1516添加基質1310干燥227系統(tǒng)準備51243出結果時間總共922761.80.920.79MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization

Time-Of-Flight

(MALDI-TOF)

基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀VITEKMS更快地獲取結果當前第76頁\共有89頁\編于星期四\17點快速報告結果產生臨床效應有效治療早期診斷當前第77頁\共有89頁\編于星期四\17點疑問二？？有感染癥狀，細菌培養(yǎng)卻是陰性當前第78頁\共有89頁\編于星期四\17點陰性檢測結果臨床意義微生物標本陰性檢測結果的原因?微生物室

檢驗手段和技能?醫(yī)生

非感染性、已使用抗菌藥物

采樣部位、采樣時機、標本質量

送檢目的（細菌？真菌？非典型病原體？）

?護理或護工

保存、運送

采樣部位（血）

?當前第79頁\共有89頁\編于星期四\17點“真陰性”的幾種可能呼吸道標本

?常規(guī)方法（SP、BLAF）仍可能50%陰性， 漏檢的可能病原菌為：

肺鏈、流感嗜血、軍團