第三章基因工程制藥

第三章基因工程制藥第一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一作業(yè)查閱資料，準(zhǔn)備ppt、課程論文介紹某種基因工程藥物的生產(chǎn)工藝。

第二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一一、基因工程藥物

1982年第一個基因重組產(chǎn)品——人胰島素在美國EliLilly公司問世，吸引和激勵了大批科學(xué)家利用基因工程技術(shù)研制新藥品，迄今累計(jì)已有近30種基因工程藥物投入市場，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。第三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程技術(shù)可生產(chǎn)的藥物和制劑包括：（1）免疫性蛋白：如各種抗原和單克隆抗體；（2）細(xì)胞因子：如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長因子、表皮生長因子、凝血因子；（3）激素：如胰島素、生長激素、心素納；（4）酶類：如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。第四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一

主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素（Insulin）1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素（HIL）1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國第五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一美國已批準(zhǔn)了56種生物制劑部分摘錄（1）產(chǎn)品 公司 主要適應(yīng)癥

人胰島素 EilLilly糖尿病人生長激素 EilLilly兒童生長激素缺乏癥&2a干擾素 Hoffmann-LaRocke 白血病a-2b干擾素 Schering-Plough 白血病、愛滋病、肝炎小鼠抗CO3單抗 OrthoBiotech 腎、心移植排斥反應(yīng)乙肝疫苗MSD Merck 乙型肝炎t-pA（altepl-ase） Genentech 急性心肌梗死、肺栓塞B型嗜血性流感疫苗PraxisBiologicsB型嗜血性流感第六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一美國已批準(zhǔn)了56種生物制劑部分摘錄（2）產(chǎn)品 公司 主要適應(yīng)癥

EPO OrthoBiotech 慢性腎衰竭貧血a-n3干擾素 InterferonSciences 性疣r-1b干擾素 Genentech 類風(fēng)濕rG-CSF Amgen 化療所致的白細(xì)胞減少GM-CSF Immunex 自體骨髓移植白細(xì)胞介素-2 Chiron 轉(zhuǎn)移性腎癌凝血因子VII GeneticsInstitute 血友病第七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一美國已批準(zhǔn)了56種生物制劑部分摘錄（3）產(chǎn)品 公司主要適應(yīng)癥

β-1b干擾素 BerlexLabChiron 多發(fā)性硬皮病β-葡萄糖苷脂酸 Genzyme Gaucher遺傳病單抗治療劑 Centocor 抗血液凝固因子VIII Novo 血友病Humalog Lilly 糖尿病Nateplase 三井-持田 溶血栓alfacon-1干擾素 Amgen 慢性丙肝干擾素8-nl Otsuka（日本）治療蕈樣真菌病第八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)：（1）利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白質(zhì)和多肽，為臨床使用提供有效保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的引用范圍；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)，挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；（4）內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用存放的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去;（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。第九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一我國基因工程藥物研究和開發(fā)：起步較晚，基礎(chǔ)較差。α1b型基因工程干擾素是由我國自行研制開發(fā)的具有國際先進(jìn)水平的生物高科技成果，于1997年

通過Ⅲ期臨床，并獲得國家一類新藥證書，成為“863”計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域第一個實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基因工程藥物。目前我國已批準(zhǔn)12種基因工程藥物和疫苗上市，在研究開發(fā)中的也有10余種。第十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2006年4月前我國批準(zhǔn)上市的35種生物技術(shù)藥物批準(zhǔn)年份藥品批準(zhǔn)年份藥品1989干擾素IFN-α1b1999125AlaIL-2人胰島素Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a2000人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表皮生長因子（EGF）EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液[131I]重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）2004重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）促紅細(xì)胞生成素（EPO）2005重組人腦利鈉肽重組人血管內(nèi)皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）重組人腫瘤壞死因子α（rhTNFα）重組人血小板生成素（rhEPO）1998IFN-γ125SerIL-2生長激素（GH）痢疾疫苗牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）2006重組TNFR-Fc融合蛋白第十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬美元/病人200－300美元/病人第十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì)——基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。第十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一供體細(xì)胞載體分子外源DNA外源基因分離酶切酶切連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增DNA重組分子受體細(xì)胞鑒定與表達(dá)重組轉(zhuǎn)化子工程菌或細(xì)胞蛋白產(chǎn)物工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)重組產(chǎn)物分離純化第十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線第十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程的操作流程1、分：分離目的基因2、切：對目的基因和載體適當(dāng)切割3、接：目的基因與載體連接4、轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、篩：篩選出含有重組體的受體細(xì)胞6、表：目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，受體細(xì)胞成長為基因改造生物第十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程制藥的基本過程獲得目的基因

↓

構(gòu)建重組質(zhì)粒

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組建基因工程菌或者基因工程細(xì)胞

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工程菌培養(yǎng)

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產(chǎn)物分離純化

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基因工程藥物的質(zhì)量控制第十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一目的基因的獲得一、酶切法直接分離目的基因二、PCR直接擴(kuò)增目的基因三、文庫法分離目的基因四、化學(xué)合成目的基因第十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一酶切法直接分離目的基因第二十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一plasmidDNAGenomicDNA第二十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一gagctcaagctt第二十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一限制性內(nèi)切酶在DNA克隆中的應(yīng)用第二十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCRPolymerasechainreaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈第二十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一模板DNA95℃第二十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55℃引物1引物2DNA引物第二十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第二十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95℃第2輪開始第二十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55℃TaqTaqTaqTaq第三十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第三十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增第三十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一

PCR動畫1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA復(fù)制第三十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時第三十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一片段化、分級分離基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝第三十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第三十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一化學(xué)合成目的基因第三十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一什么是載體？載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。載體概述第三十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體載體概述第三十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一三個顯著特點(diǎn)：

（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細(xì)胞含500-700個拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZ′，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。質(zhì)粒載體第四十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一連接第四十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞第四十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、抗藥性檢測篩選法第四十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、顯色檢測IPTG：異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)物X-gal:

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷第四十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、限制酶切圖譜檢測第四十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、PCR擴(kuò)增檢測用PCR的方法檢測是否插入外源基因片段。優(yōu)點(diǎn)：不需要合適的酶切位點(diǎn)。缺點(diǎn)：假陽性高。第四十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一5、原位雜交檢測根據(jù)插入DNA片段的序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)

第四十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一6、序列測定雙脫氧測序第四十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第四十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一雙脫氧末端終止測序法的基本反應(yīng)：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA第五十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一雙脫氧末端終止測序法

Sanger雙脫氧終止法測序過程第五十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第五十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一模板序列第五十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一測序讀片第五十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一近年來，建立了一種使用熒光染料的無放射性標(biāo)記的DNA測序法。它使用4種不同顏色的熒光染料分別標(biāo)記4種不同的堿基，并在一個凝膠電泳的泳道中進(jìn)行電泳，然后通過激光作用誘發(fā)熒光，達(dá)到檢測堿基的目的。激光檢測器把收集到的信息傳到電腦，計(jì)算機(jī)會自動顯示或打印出堿基順序。這樣一個泳道一次電泳可讀出450左右個堿基，一塊凝膠36個泳道可測36×450約16200個堿基，大大加快了測序的速度。后來又發(fā)明了一種用毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳的方法，可大大加快電泳的速度分辨率，并可實(shí)現(xiàn)自動灌膠和自動進(jìn)樣。第五十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一測序結(jié)果第五十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一7、外源蛋白質(zhì)檢測利用插入DNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能或者結(jié)構(gòu)性質(zhì)，檢測外源蛋白質(zhì)的存在。適用于表達(dá)載體的檢測。第五十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一受體細(xì)胞選擇外源基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在病毒中的表達(dá)外源基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)第五十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。第五十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第六十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點(diǎn)：枯草桿菌具有胞外酶分泌－調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性?？莶輻U菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)。枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的β干擾素、白細(xì)胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等。第六十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，形成被膜包裹或無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長處所在。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程，因此永遠(yuǎn)成為無活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作。

包涵體表達(dá)第六十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一融合型表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá),由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。質(zhì)粒基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割第六十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一常用的受體蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)）第六十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（D3）受體蛋白的切除方法化學(xué)斷裂法：溴化氰（CNBr）--Met-（切點(diǎn)）-AA酶促斷裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，識別序列:Ile－Glu－Gly－Arg-（切點(diǎn)）-AA第六十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第六十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一分泌表達(dá)蛋白

細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。“分泌”：

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第六十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一分泌蛋白表達(dá)的原理圖示第六十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一常用的大腸桿菌信號肽堿性磷酸酶信號肽（phoA）膜外周質(zhì)蛋白質(zhì)信號肽（OmpA）霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）。

第七十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一酵母表達(dá)系統(tǒng)第七十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一能提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變酵母菌第七十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程細(xì)胞的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)（一）基因工程菌的穩(wěn)定性（二）基因工程菌培養(yǎng)的程序（三）基因工程菌的培養(yǎng)方式（四）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素分析（五）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備生物反應(yīng)器第七十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程菌質(zhì)粒不穩(wěn)定與2個因素有關(guān)：

（1）分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。

（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失而導(dǎo)致工程菌性能的改變。由于丟失質(zhì)粒的細(xì)菌要比含有質(zhì)粒的工程菌更具有生長優(yōu)質(zhì)，因此在競爭中最后會取代工程菌，而演變成為優(yōu)勢菌。最后導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量的減少。第七十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（1）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂于不含抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計(jì)所長出的菌落數(shù)A；（2）然后隨機(jī)挑選100個菌落，接種到含有抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計(jì)所長出的菌落數(shù)B；（3）計(jì)算出B/A的比值。該比值能夠反映出質(zhì)粒的穩(wěn)定性。因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含的抗生素的培養(yǎng)基環(huán)境中是不能正常生長的。第七十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因1、分裂不穩(wěn)定是指基因工程菌在分裂的子代菌體中，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的現(xiàn)象。它主要與2個因素有關(guān)：

（1）工程菌產(chǎn)生丟失質(zhì)粒的概率，拷貝量低的工程細(xì)菌，它所產(chǎn)生不含質(zhì)粒的細(xì)菌變異株和概率較大。

（2）丟失質(zhì)粒的細(xì)菌、含有質(zhì)粒的工程菌之間的競爭力大小。

2、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失、或者發(fā)生堿基后果排、缺失現(xiàn)象，最終導(dǎo)致工程菌性能改變的現(xiàn)象。第七十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法（1）、分階段培養(yǎng)法（2）、在培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力（3）、通過溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施第七十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（1）、分階段培養(yǎng)法工程菌的培養(yǎng)一般分為2個階段：

（1）第一階段先使菌體生長至一定密度。

（2）第二階段開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。由于第一階段外源基因沒有表達(dá)，減少了丟失質(zhì)粒的細(xì)菌的產(chǎn)生概率，也就增加了工程菌的穩(wěn)定性。第七十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（2）、培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含的抗生素的培養(yǎng)基環(huán)境中是不能正常生長的。所以可以通過加入抗生素來抑制質(zhì)粒丟失的細(xì)菌的生長。第七十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（3）、通過溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施通過以下方法可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。（1）間歇送氧（2）改變稀釋速率第八十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（二）基因工程菌培養(yǎng)的程序1、搖瓶操作通過搖瓶操作，來子解工程菌生長的基礎(chǔ)條件，如溫度值、培養(yǎng)基的組分、氮碳比、表達(dá)產(chǎn)物的積累對于工程細(xì)胞的影響。2、培養(yǎng)罐操作通過培養(yǎng)罐操作，來確定培養(yǎng)參數(shù)、確定培養(yǎng)方案、以及確定培養(yǎng)順序。第八十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（三）基因工程菌的培養(yǎng)方式1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)2、連續(xù)培養(yǎng)3、透析培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)5、高密度培養(yǎng)第八十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)是指將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間之后，間歇式地、或者連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。其目的是為了創(chuàng)造一個良好的微生物環(huán)境，延長菌體的對數(shù)生長期，來獲得高密度的菌體總量。第八十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌式培養(yǎng)達(dá)到一定的菌體濃度之后，同時進(jìn)行進(jìn)料、出料的操作，通過控制一定的營養(yǎng)物稀釋比率，來進(jìn)行不間斷式培養(yǎng)的方式，稱為連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)有利于保持生產(chǎn)環(huán)境的恒定，有利于控制菌體的生長速率。但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致連續(xù)培養(yǎng)比較困難。第八十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)是利用膜的半透性原理，使得代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分開，通過去除培養(yǎng)液中的借調(diào)產(chǎn)物的方法來消除代謝產(chǎn)物對工程菌的不良影響。透析裝置是用半透膜將發(fā)酵器隔成二半，形成發(fā)酵液區(qū)、和透析液區(qū)，通過透析來及時移去合成產(chǎn)物。半透膜的種類、孔徑、面積、發(fā)酵液和透析液的比例、透析液的組成、循環(huán)流速、培養(yǎng)持續(xù)時間等等因素會影響產(chǎn)物的得率。用透析法培養(yǎng)大腸桿菌E.coli—HB101（pPKAS2）生產(chǎn)青霉素?；?，其產(chǎn)率可以提高11倍。第八十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、固定化培養(yǎng)為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，人們將固定化技術(shù)和基因工程菌結(jié)合起來，進(jìn)行固定化式連續(xù)培養(yǎng)，有利于提高生產(chǎn)效率。

第八十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一高密度培養(yǎng)技術(shù)又稱高密度發(fā)酵技術(shù)，指提高基因工程菌菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，即單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量。優(yōu)點(diǎn)：不僅可以減少培養(yǎng)體積、強(qiáng)化下游分離提純，而且可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成本。第八十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一大腸桿菌高密度培養(yǎng)技術(shù)大腸桿菌高密度發(fā)酵理論最大值為400gDCW/L（DCW：drycellweight），相對于發(fā)酵液中25%是大腸桿菌細(xì)胞。迄今為止，最高密度發(fā)酵的兩個例子是非重組菌E.coliW3110（密度為174gDCW/L）；生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸的重組菌（密度為175.4gDCW/L）第八十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素發(fā)酵培養(yǎng)基：碳氮比；碳源氮源濃度表達(dá)基因的調(diào)控宿主菌質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)強(qiáng)度大腸桿菌高密度發(fā)酵的補(bǔ)料調(diào)控：恒速流加補(bǔ)料、變速流加補(bǔ)料和指數(shù)流加補(bǔ)料乙酸對生長和表達(dá)的影響：減少乙酸第八十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一酵母菌高密度培養(yǎng)技術(shù)大腸桿菌高密度發(fā)酵理論最大值為280gDCW/L（DCW：drycellweight），目前發(fā)酵過程中，一般認(rèn)為酵母密度為100~200gDCW/L即為高密度發(fā)酵。常用高密度發(fā)酵宿主菌是巴氏畢赤酵母第九十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一畢赤酵母高密度培養(yǎng)技術(shù)首先用含甘油的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)，外源基因的表達(dá)被完全抑制。當(dāng)甘油消耗完，開始流加甘油至培養(yǎng)物種，使細(xì)胞限速生長。最后流加甲醇或甲醇與甘油混合物，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，同時檢測培養(yǎng)液中的外源蛋白濃度，到適當(dāng)水平停止發(fā)酵和收獲目的蛋白。第九十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一實(shí)例：表達(dá)重組人血清白蛋白（rHSA）畢赤酵母工程菌高密度培養(yǎng)在15L多參數(shù)全自動發(fā)酵罐中，OD600達(dá)500~700，密度達(dá)115~160gDCW/L，rHSA蛋白表達(dá)量達(dá)3.6g/L。工藝：22h分批發(fā)酵結(jié)束后，開始流加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，通過控制流加速率，以控制溶氧濃度（DO）在20%以上。在46h達(dá)到OD值700，達(dá)到高密度，停止流加。當(dāng)DO陡然上升到70%，開始流加誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，通過控制流加速率，以控制溶氧濃度（DO）在20%以上。在120h，rHSA表達(dá)量最大達(dá)到3.6g/L。第九十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（四）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素分析基因工程菌 傳統(tǒng)微生物生物材料 含外源重組基因 不含外源重組基因發(fā)酵工藝 使外源基因高效表達(dá)使自身基因表達(dá)目的 產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生自身的代謝產(chǎn)物

1、培養(yǎng)基的影響2、接種量的影響3、溫度的影響4、溶解氧的影響5、誘導(dǎo)時機(jī)的影響6、PH值的影響第九十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、培養(yǎng)基的影響（1）常用的碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、制定水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。（3）其它組成成份：無機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素。（4）無機(jī)磷在許多初級代謝的酶促反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子。第九十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、接種量的影響接種量是指所移入的種子液體量與培養(yǎng)液體量的比例，它的大小會影響發(fā)酵物的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。（1）接種量小，菌體生長延遲，不利于外源基因的表達(dá)。（2）接種量適中，生產(chǎn)菌能夠迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，減少菌體污染的機(jī)會。（3）接種量過大，菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。一般來說，10-15%的接種量，菌體的延遲期短、菌群迅速繁衍、很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適用于個源基因的表達(dá)。第九十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、溫度的影響溫度對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、小分子蛋白質(zhì)的合成水平等方面。（1）在復(fù)制水平，溫度可影響基因拷貝數(shù)量。（2）在轉(zhuǎn)錄水平，溫度可影響RNA聚合酶的作用，而來調(diào)控基因表達(dá)。（3）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋白質(zhì)的合成水平來影響基因表達(dá)。（4）溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。舉如說明如下第九十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一溫度影響的例子（1）大腸桿菌合成青霉素酰化酶，從37℃起隨著溫度的下降，青霉素酰化酶的合成產(chǎn)量逐漸增加，20℃--22℃時達(dá)到高峰，16℃以下，青霉素?；傅漠a(chǎn)量反而下降。這是由于在18℃--16℃時，工程菌生長減慢。實(shí)驗(yàn)證明，造成這種減慢的原因是由于溫度影響了細(xì)胞內(nèi)青霉素?；竚RNA的濃度。（2）分泌型人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子工程菌E.coli—W3100/pGM-CSF，在30℃時，蛋白質(zhì)表達(dá)量最高，37℃時，由于細(xì)菌的熱休克系統(tǒng)被激活，其蛋白質(zhì)表達(dá)量反而下降。（3）重組人生長激素工程菌，在30℃時的產(chǎn)物是可溶的，而在37℃所表達(dá)出的蛋白質(zhì)則是不溶的。第九十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、溶解氧的影響溶解氧對于工程菌發(fā)酵過程中的菌體代謝是具有十分重要的作用。細(xì)菌在大量擴(kuò)增過程中，要進(jìn)行消耗氧氣的生化反應(yīng)過程。因此，維持較高水平的溶解氧水平（DO2≥40%），才能維持工程菌的快速生長和繁衍。分泌型人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子工程菌E.coli—W3100/pGM-CSF的發(fā)酵過程中，如果溶解氧≤20%，則產(chǎn)生大量雜蛋白。影響以后的純化。必須維持溶解氧≥25%的水平。采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。第九十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一5、誘導(dǎo)時機(jī)的影響對于λPL—clts875突變株工程菌來說，在28℃-30℃培養(yǎng)時，這時突變體能產(chǎn)生阻遏蛋白、來阻止啟動子的轉(zhuǎn)譯。而當(dāng)溫度上升到42℃時，這種阻遏作用就消失。在這里，溫度對于工程菌的表達(dá)起著誘導(dǎo)作用。

一般來說，對于處在生長期后期的工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)，如菌體細(xì)胞密度在109個/ml時，通過升溫誘導(dǎo)，可以達(dá)到蛋白質(zhì)表達(dá)增產(chǎn)的效果。這在工業(yè)化生產(chǎn)中具有較大的潛力。第九十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一6、PH值的影響PH對于細(xì)胞的正常生長、外源蛋白的高效表達(dá)都有影響。（1）細(xì)胞生長期的最佳PH范圍是6.8--7.4。（2）外源蛋白表達(dá)的最佳PH范圍是6.0--6.5。在發(fā)酵過程中，細(xì)菌自身對PH值具有一定的調(diào)節(jié)能力。當(dāng)PH值超出其調(diào)節(jié)能力的范圍時，就會影響細(xì)菌的生長。發(fā)酵前期，PH值可控制在7.0，隨著蛋白質(zhì)的表達(dá)，PH值不斷下降，當(dāng)PH≤6.0時，則應(yīng)及時開動堿泵，加入堿液。第一百頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（五）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備生物反應(yīng)器第一百零一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程藥物的分離純化技術(shù)（一）工程細(xì)菌所表達(dá)出蛋白質(zhì)的特點(diǎn)（二）分離純化技術(shù)的重要性（三）分離純化的基本步驟和方法第一百零二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（一）工程細(xì)菌所表達(dá)出蛋白質(zhì)的特點(diǎn)1、目的產(chǎn)物在初始物料中含量很低。2、初始產(chǎn)物的組成十分復(fù)雜。除了目的蛋白質(zhì)之外，還含有殘余細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、殘余培養(yǎng)基、各種無機(jī)鹽。3、目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性很差，容易失活、變性，對于溫度、PH、金屬離子、有機(jī)溶劑十分敏感和脆弱。4、目的蛋白質(zhì)的種類繁多，存在著大小不同的片段。5、純度不高、常常含有雜菌、熱原等等物質(zhì)。第一百零三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（二）分離純化技術(shù)的重要性為了獲得高純度、可供藥用有生物活性蛋白質(zhì)，必須對基因工程藥物進(jìn)行一定的分離和純化。1、分離以大腸桿菌為宿主的基因工程藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，分離提取這類產(chǎn)物時，需要經(jīng)過細(xì)胞收集、細(xì)胞破碎、細(xì)胞碎片分離的過程。2、純化經(jīng)過破碎和分離之后，目的產(chǎn)物仍然存在著大量的雜質(zhì)，雜蛋白質(zhì)、類似蛋白質(zhì)的異構(gòu)體，為了獲得合格的目的產(chǎn)物，必須進(jìn)行純化操作。3、精制非蛋白質(zhì)類純質(zhì)在經(jīng)過純化操作之后，仍然無法除去，需要進(jìn)行滅菌和精制操作。第一百零四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一發(fā)酵液

↓

細(xì)胞分離

↙↘胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物→濃縮→初步純化→高度純化→產(chǎn)品↓細(xì)胞破碎↓固液分離↙↘包含體細(xì)胞碎片→濃縮→初步純化→高度純化→制劑→產(chǎn)品↓變性除膜↓復(fù)性→濃縮→初步純化→高度純化→制劑→產(chǎn)品（三）分離純化的基本步驟第一百零五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一分離純化的基本方法1、細(xì)胞收集離心法。2、細(xì)胞破碎：

（1）機(jī)械破碎法高壓勻漿法、超聲波破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法、

（2）非機(jī)械破碎法酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法。3、固液分離離心法、膜過濾法、雙水相分配萃取法。4、純化色譜技術(shù)離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色彩譜、凝膠過濾色譜、高壓液相色譜。5、除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)技術(shù)除DNA、除熱原、除病毒。

下面針對不同的技術(shù)作講解總共22種技術(shù)和方法。第一百零六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程藥物的質(zhì)量控制與傳統(tǒng)意義上的藥物生產(chǎn)不同，基因工程藥物所獲得的蛋白質(zhì)，其相對分子量較大，并且多數(shù)是參與人體生理功能調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，極微量就可以產(chǎn)生顯著反應(yīng)，如白介素-12的作用劑量為0.1ug、干擾素的作用劑量也只須20-30ug?；蚬こ趟幬镌谒幮?、藥劑上的任何偏差，都有會帶來嚴(yán)重的人體損傷和危害，因此，必須對于進(jìn)行十分嚴(yán)格的質(zhì)量控制和檢測。具體有以下5項(xiàng)內(nèi)容：（一）原材料的質(zhì)量控制（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)（三）純化過程中的質(zhì)量控制（四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制（五）產(chǎn)品的保存要求第一百零七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（一）原材料的質(zhì)量控制1、重組DNA序列的正確性。2、進(jìn)行重組的基因工程菌必須來自單一克隆株。3、所使用的載體、質(zhì)粒必須純正、而且穩(wěn)定。4、應(yīng)明確以下各事項(xiàng)：

（1）目的基因的來源

（2）限制性內(nèi)切酶的種類

（3）載體的名稱和遺傳特性

（4）基因重組的位點(diǎn)圖譜

（5）抗生素標(biāo)記物

（6）宿主細(xì)胞的名稱和來源、傳代歷史

（7）重組染色體的生物特性、拷貝數(shù)、遺傳性

（8）基因表達(dá)所導(dǎo)讀的核苷酸序列

（9）啟動克隆基因在工程細(xì)菌中的表達(dá)水平第一百零八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1、工程菌菌種純正、穩(wěn)定。2、每一批次的菌種不含致癌基因，無雜菌、病毒、真菌和支原體的污染。3、發(fā)酵生產(chǎn)過程中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定。4、生產(chǎn)過程控制微生物污染。5、生產(chǎn)過程保證產(chǎn)量恒定。保證工程菌的穩(wěn)定性，確定細(xì)胞的最高傳種代數(shù)。6、定期檢測工程菌的載體系統(tǒng)、質(zhì)?？截悢?shù)、載體在工程細(xì)胞內(nèi)是否丟失。第一百零九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（三）純化過程中的質(zhì)量控制1、每一批次生產(chǎn)產(chǎn)物的一致性檢驗(yàn)。2、外源蛋白質(zhì)含量限度檢驗(yàn)3、DNA限度檢驗(yàn)4、熱原限度檢驗(yàn)：（1）血清學(xué)檢驗(yàn)（2）鱟試劑（3）兔子熱敏試驗(yàn)第一百一十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制包括7項(xiàng)指標(biāo)。1、產(chǎn)品鑒別的定性分析2、純度分析3、雜質(zhì)檢測4、生物活性測定5、穩(wěn)定性考察6、產(chǎn)品一致性保證7、產(chǎn)品的安全性第一百一十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、產(chǎn)品鑒別的定性分析重組蛋白質(zhì)藥物常用的鑒定方法（8項(xiàng)檢測）（1）電泳方法聚丙烯酰安凝膠電泳（SDS-PAEG）、等電點(diǎn)電泳、免疫電泳。

（2）免疫學(xué)分析方法放射性免疫測定法（RIA）、放射性免疫擴(kuò)散法（RID）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），免疫印漬方法（immunoblotting）。

（3）受體結(jié)合試驗(yàn)。

（4）各種高效液相分析法（HPLC）。

（5）肽圖分析法。

（6）氨基酸EdmanN末端序列分析法

（7）園二色譜方法（CD）

（8）核磁共振（NMR）下面選擇其中重要的方法作講解5種第一百一十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（1）肽圖分析是通過酶解法、或者化學(xué)降解法的手段，對構(gòu)成目的蛋白質(zhì)的每一段肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)和成份分析的方法。肽圖分析法是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化最為有效的方法。可以作為基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品之間進(jìn)行精密比較的鑒別手段。方法上可采用：

（1）各種高效液相分析法（HPLC），

（2）毛細(xì)管電泳（CE）第一百一十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（2）氨基酸成份分析這是一種對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸單體進(jìn)行測定的方法。缺點(diǎn)和局限性：

（1）對于由不超過50個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其測定精度較好，

（2）當(dāng)氨基酸數(shù)量超過100個時，就會出現(xiàn)較大的偏差。

（3）相對分子量越大，其偏差就越嚴(yán)重。

這是因?yàn)闃?gòu)成蛋白質(zhì)的肽鏈在水解過程中，有的水解并不完全，而有的則已經(jīng)被破壞。第一百一十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（3）部份氨基酸序列分析氨基酸EdmanN末端序列分析法，可以作為蛋白質(zhì)和肽鏈和重要測定指標(biāo)。第一百一十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（4）重組蛋白質(zhì)濃度、相對分子量測定重組蛋白質(zhì)的濃度測定方法有：

（1）紫外分光光譜法，

（2）雙縮脲（BCA）法，

（3）考馬斯藍(lán)法，

（4）Loywry法，

（5）凝膠染色與掃描分析法。重組蛋白質(zhì)的相對分子量測定方法有：

（1）凝膠過濾法，

（2）聚丙烯酰胺聚膠電泳法。第一百一十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析二硫鍵的巰基與蛋白質(zhì)的生物活性有著密切的關(guān)系?；蚬こ坍a(chǎn)物中的-S-S-鍵是否正確配對是一個重要的問題。測定方法有：

（1）對氯汞苯甲酸法（PCMB），

（2）5、5-二巰基-雙-2-硝基苯甲酸法（DTNB）第一百一十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、純度分析目的蛋白質(zhì)含量測定通常根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性來進(jìn)行測定。采用的方法有4項(xiàng)檢測：

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAEG）、

（2）等電點(diǎn)電泳、

（3）各種高效液相分析法（HPLC）、

（4）毛細(xì)管電泳（CE）。第一百一十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、雜質(zhì)檢測雜質(zhì)分為2種類型：蛋白質(zhì)雜質(zhì)、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。（1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源（2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別（3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測方法第一百一十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源（A）殘余的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，（B）目的蛋白質(zhì)自身變性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷凍脫鹽導(dǎo)致的沉淀、由于凍干引起的聚合。第一百二十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別（A）雜菌污染，可通過微生物學(xué)方法來測定。（B）熱原質(zhì)和內(nèi)毒素，檢測可用鱟試劑。（C）宿主細(xì)胞所殘余的DNA，一般認(rèn)為DNA殘余含量小于100pg/劑量，是安全的?；鶞y定方法可采用核酸雜交法。第一百二十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測方法雜質(zhì)和污染物 常用檢測方法

1：內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法

2：宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 免疫分析、SDS、CE

3：其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)（如培養(yǎng)基）免疫分析、SDS、HPLC、CE

4：殘余DNA NA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合

5：蛋白變異 肽譜、等電點(diǎn)聚焦（IEF）、HPLC、CE

6：甲酰基甲硫氨酸 肽譜、IEF、HPLC、CE

7：甲硫氨酸氧化 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析

8：產(chǎn)物變性、聚合、脫氨基 凝膠分子篩、SDS、HPLC、CE

9：單克隆抗體親和配基脫落 免疫分析、SDS

10：氨基酸取代 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析

11：微生物污染物 微生物學(xué)檢查

12：支原體污染物 微生物學(xué)檢查

13：病毒污染物 微生物學(xué)檢查第一百二十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、生物活性測定（1）免疫測定法重組蛋白質(zhì)是一種抗原，均有相應(yīng)的抗體、或者單克隆抗體，可采用放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫法測定基免疫學(xué)活性。（2）實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)試驗(yàn)法根據(jù)目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)、藥理學(xué)特性，建立活的動物模型，進(jìn)行各種指標(biāo)的測定。（3）細(xì)胞培養(yǎng)體外效價評定法：（A）細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（B）3H-TaR摻入法（C）酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)。對照國家認(rèn)定的標(biāo)準(zhǔn)、或者參考品進(jìn)行評價。第一百二十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一5、穩(wěn)定性考察這是評價藥物有效性、安全性的重要手段。也是藥品貯存條件、使用期限的主要依據(jù)。由于基因工程所生產(chǎn)出一蛋白質(zhì)都是生物活性物質(zhì)，它們對于溫度、氧、光照、離子濃度、pH等環(huán)境因素均十分敏感。常常會在貯存過程中發(fā)生脫氨、氧化、磺?；?、聚合、降解等反應(yīng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)必須與一致性試驗(yàn)、純度測定、生物學(xué)效價試驗(yàn)等結(jié)合起來，進(jìn)行多方面的綜合評判。才能保證結(jié)果的客觀性。第一百二十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一6、產(chǎn)品一致性保證是用來保證每一批生產(chǎn)出的最終產(chǎn)品在安全性、有效、含量、雜質(zhì)限度、穩(wěn)定性等等方面都是一致的。因?yàn)橥ㄟ^基因工程生產(chǎn)藥物是一個十分復(fù)雜的過程。作用因素和影響因子錯綜復(fù)雜。只有從原料開始、到生產(chǎn)、到產(chǎn)品形成的每一步驟翥進(jìn)行嚴(yán)格的工藝要求、并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)量檢測手段，才能保證產(chǎn)品的一致性恒定。第一百二十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一7、產(chǎn)品的安全性三致試驗(yàn)：（1）致畸（2）致敏（3）致癌

第一百二十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一基因工程藥物的修飾與改造目的：提高穩(wěn)定性，解除抗原性，提高活性，延長半衰期方法：構(gòu)建突變體IL-2的Cys125→Ser或Ala，活性提高2倍，在體內(nèi)半衰期有幾分鐘提高到1h。Insulin的A鏈Asp21→Gly，B鏈插入Arg30和Arg31，等電點(diǎn)變?yōu)閜H6.7，在酸性環(huán)境下為澄清溶液，一旦注入皮下組織，則形成不溶性微沉淀物，藥物濃度曲線趨于正常生理胰島素的基礎(chǔ)分泌曲線，每天注射1次即可。融合蛋白人血清白蛋白（HAS）與人生長激素（HGH）、IFN-a、IFN-β、rIL-2、rG-CSF等以融合蛋白表達(dá)，在保持原有生物活性基礎(chǔ)上，延長了半衰期，降低了體內(nèi)清除率。

PEG化：增加分子量，降低蛋白酶作用，屏蔽蛋白質(zhì)，降低抗原性第一百二十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（五）：產(chǎn)品的保存要求1、液態(tài)保存2、固態(tài)保存第一百二十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、液態(tài)保存（1）低溫保存在-10℃到-20℃以下的低溫環(huán)境，可以保存蛋白質(zhì)制劑。（2）在穩(wěn)定的PH條件下保存蛋白質(zhì)只有在很窄的PH范圍內(nèi)才能維持穩(wěn)定，即當(dāng)PH=pI（等電點(diǎn)）時，因此應(yīng)該小心調(diào)整保存蛋白質(zhì)的PH范圍。（3）高濃度保存蛋白質(zhì)在高濃度溶液中比較穩(wěn)定，而在低濃度溶液內(nèi)，常常發(fā)生亞基解離、表面變性。（4）真空保存蛋白質(zhì)在真空狀態(tài)、或者在惰性氣體中密閉保存，能抵抗氧化作用。（5）保護(hù)劑保存：（A）某些蛋白質(zhì)在疏水環(huán)境中能夠長期保存，這類穩(wěn)定劑有糖類、脂肪、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑。（B）某些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的極性環(huán)境中能夠長期保存，這類穩(wěn)定劑有中性鹽類。（C）某些蛋白質(zhì)由于含有半胱氨酸的巰基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，這類穩(wěn)定劑有2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇。第一百二十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、固態(tài)保存--凍干粉保存、結(jié)晶保存蛋白質(zhì)含水時超過10%時就容易失去活性。含水量下降到5%時，在室溫、或者冰箱中保存較為穩(wěn)定。但是在37℃時，活性顯著下降。固態(tài)蛋白質(zhì)則較穩(wěn)定。最好的方法是將蛋白質(zhì)制成凍干粉、或者結(jié)晶。它們具有很強(qiáng)的抗熱性和穩(wěn)定性，干燥器中在4℃以下，蛋白質(zhì)可保存相當(dāng)長的時間。第一百三十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一三、基因工程制藥實(shí)例第一百三十一頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)基因工程制藥的具體實(shí)例（一）干擾素a-2b（二）乙型肝炎表面抗原（三）人胰島素（四）人生長激素（p109）（五）重組人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子（p101）（六）促紅細(xì)胞生成素（p107、p59）（七）重組甲狀腺旁素（p51）（八）重組人白細(xì)胞介素-2以上內(nèi)容（一、二）作課堂講解，（三到八）作為課外自己完成的作業(yè)第一百三十二頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（一）干擾素a-2b干擾素（INF）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等等作用,是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分,干擾素（INF）最早被用于誘導(dǎo)人體產(chǎn)生白細(xì)胞。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異，將干擾素（INF）分為α、β、γ、ω四種類型。又根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)不同將干擾素分為a-1b、a-2a、a-2b等等亞型。

1、基因工程菌的組建2、基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)3、干擾素的制備4、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求第一百三十三頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一1、基因工程菌的組建人染色體上的干擾素基因只有1.5%，拷貝量極少，所以不能直接從人體的染色體上分離干擾素基因。

第一百三十四頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一工程菌構(gòu)建誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸↓通過寡dT-纖維素柱提取mRNApBR322質(zhì)粒↓↓5%-23%蔗糖密度梯度離心提取12S-mRNA內(nèi)切酶切割↓↓由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi)↓結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素雙鏈cDNA用末端Pst-I酶切割↓ 再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段加上dA或者dC++++++++++++++++

退火獲得雜交質(zhì)粒

↓

轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒

↓篩選能夠抗四環(huán)素、但是對氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株↓采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA的克隆

↓

將干擾素cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體

↓

在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)↓（進(jìn)入下游工藝）第一百三十五頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一2、基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)人干擾素a-2b的基因工程菌為SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。

質(zhì)粒使用PL啟動子，含有氨芐青霉素抗性基因。

種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。

↓

基因工程菌接種到4個1000ml三角燒瓶之中，每個燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)10小時，作為發(fā)酵罐的種子。

↓

用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L

發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml氨芐青霉素、少量防泡沫劑。PH=6.8。）

↓

攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%

30℃發(fā)酵8小時（細(xì)菌增殖階段）

42℃誘導(dǎo)2-3小時（產(chǎn)物生產(chǎn)階段）

↓

[鑒控手段：每隔不同時間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。]第一百三十六頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一3、干擾素的制備發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min，除去上清液。得濕菌，從其中取100g。懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）500ml之中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。

↓

4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml抽提液在室溫條件下，進(jìn)行攪拌抽提2小時，抽提液組成配方[8mol/L尿素、20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）、0.5mmol/L二巰基蘇糖醇]。

↓

抽提液15000r/min離心30min，下層棄去。取上清液，用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）稀釋至尿素濃度0.5mol/L

↓

加入0.1mmol/L二巰基蘇糖醇，4℃攪拌15小時。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮

↓

濃縮液采用SephadexG50層析柱分離，層析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離

↓

收集人干擾素a-2b部分，用SDS檢查。再經(jīng)DE-52柱進(jìn)行純化

層析柱2cm*50cm、上柱之后，分別采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.0）洗滌。

↓

收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

[得率要求：全過程蛋白質(zhì)回收率為20-25%，產(chǎn)品不含雜蛋白質(zhì)、DNA、熱原質(zhì)檢測合格。]第一百三十七頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一4、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求（1）半成品檢定（2）成品檢定第一百三十八頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（1）半成品檢定--13項(xiàng)指標(biāo)1、干擾素效價測定采用細(xì)胞病變抑制法，用Wish細(xì)胞、VSV病毒作為基本檢測系統(tǒng)，對照國家標(biāo)準(zhǔn)、或者國標(biāo)參考品。2、蛋白質(zhì)含量測定用福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對照3、比活性測定干擾素效價國際單位÷蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)4、純度測定（1）銀染顯色法測定應(yīng)為單一顯色區(qū)帶，（2）掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上，（3）SDS電泳測定允許少量聚合體存在，但不超過10%，（4）高效液相色譜測定應(yīng)呈一個吸收峰狀態(tài)，主峰應(yīng)占峰總面積的95%，（5）GPC柱純度測定也應(yīng)呈一個吸收峰狀態(tài)，主峰應(yīng)占峰總面積的95%。第一百三十九頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（1）半成品檢定--13項(xiàng)指標(biāo)5、相對分子量測定用還原型SDS法，加樣不低于5ug，用已知分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化系列作對照，遷移率為橫坐標(biāo)、相對分子質(zhì)量的對數(shù)作為縱坐標(biāo)，計(jì)算相對分子質(zhì)量，其誤差不得高于10%。6、殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每一劑量中的殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。7、殘余血清Ig含量測定用酶標(biāo)免疫測定法，每劑量（20ug）的鼠IgG的含量應(yīng)在100ng以下（即10pg以下）。8、殘余抗生素活性測定凡是菌種傳代中使用過抗生素的基因工程產(chǎn)物，必須進(jìn)行殘余抗生素活性測定，半成品中不得檢出殘余抗生素活性。9、紫外光譜掃描用全自動掃描紫外分光光度計(jì)測定光譜圖，其最大吸收值應(yīng)為280nm∝2nm。10、肽圖測定用CNBr裂解法測定，每一批次之間應(yīng)該保持一致。11、等電點(diǎn)測定等電點(diǎn)聚焦電泳法，每一批次之間應(yīng)該保持一致。12、無菌試驗(yàn)微生物學(xué)檢測法。13、熱原質(zhì)試驗(yàn)鱟試劑法。第一百四十頁，共一百六十頁，編輯于2023年，星期一（2）成品檢定--7項(xiàng)指標(biāo)1、物理性狀外觀為折色、微黃色疏松體，加入注射用蒸餾水之后，不得含有肉眼可見的不溶物。2、鑒別試驗(yàn)（1）ELISA試驗(yàn)、（2）中和試驗(yàn)3、水分