檢驗診斷試劑(免疫)

固相酶免疫測定ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)當前第1頁\共有54頁\編于星期五\10點酶標志物、抗原、抗體、酶免疫復合物當前第2頁\共有54頁\編于星期五\10點酶標志物——酶標記抗體或抗原酶免疫技術的核心組成部分

酶結合物（conjugate）酶標記物通過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的結合物

當前第3頁\共有54頁\編于星期五\10點酶標記抗體或抗原制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法當前第4頁\共有54頁\編于星期五\10點1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關輔基是酶的活性中心(ELISA中應用最為廣泛的標記用酶)ELISA常用酶2.堿性磷酸酶（AP）

當前第5頁\共有54頁\編于星期五\10點辣根過氧化物酶HRP上的糖羥基可以被高碘酸鈉（NaPIO4）激活生成醛基，這些醛基能通過Schiff堿與蛋白中的氨基偶聯(lián)，緊接著還原Schiff堿形成穩(wěn)定的偶聯(lián)產物。這種HRP偶聯(lián)標記方法已經被廣泛認可，但是也存在一定的缺陷，特別是去除過量高碘酸鈉（NaPIO4）的過程較為繁瑣。需要注意的是，被高碘酸鈉（NaPIO4）激活的HRP很不穩(wěn)定，其酶活力會在幾天內丟失當前第6頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第7頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第8頁\共有54頁\編于星期五\10點評價當前第9頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第10頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第11頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第12頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第13頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第14頁\共有54頁\編于星期五\10點均相酶免疫測定

homogenousenzymeimmunoassay

用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理當前第15頁\共有54頁\編于星期五\10點均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術酶放大免疫測定技術EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

當前第16頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第17頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第18頁\共有54頁\編于星期五\10點

利用重組DNA技術制備β-半乳糖苷酶的兩個片段：大片段稱為酶受體（enzymeacceptor,EA），小片段稱為酶供體（enzymedonor,ED），兩個片段本身均不具酶活性，但結合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測定稱為克隆酶供體免疫測定(CEDIA)。CEDIA的反應模式為競爭法。克隆酶供體免疫測定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）當前第19頁\共有54頁\編于星期五\10點一、基本原理：標本中的抗原和ED標記的抗原與特異性抗體競爭結合，形成兩種抗原抗體復合物。ED標記的抗原與抗體結合后由于空間位阻，不能再與EA結合。反應平衡后，剩余的ED標記抗原與EA結合，形成具有活性的酶，加入底物測定酶活力，酶活力的大小與標本中抗原含量呈正比。當前第20頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第21頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第22頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第23頁\共有54頁\編于星期五\10點：健康人O型血或綿羊靜脈血，應2w內固化當前第24頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第25頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第26頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第27頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第28頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第29頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第30頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第31頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第32頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第33頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第34頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第35頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第36頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第37頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第38頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第39頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第40頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第41頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第42頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第43頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第44頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第45頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第46頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第47頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第48頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第49頁\共有54頁\編于星期五\10點當前第50頁\共有54頁\編于星期五\10點1.概述：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。（斑點免疫滲濾試驗最初是從斑點ELISA基礎上發(fā)展起來建立的，應用的結合物是酶標記的，稱為斑點酶免疫滲濾試驗。90年代初發(fā)展了以膠體金為標記物的斑點免疫滲濾試驗（DIGFA），又名滴金免疫測定法（簡稱滴金法）。在滴金法中不需酶對底物的反應，更加簡便、快速，在臨床檢驗中應用日漸廣泛。）斑點免疫滲濾試驗2.原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當?shù)渭釉谀ど系臉吮疽后w滲濾過膜時，標本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標記也在滲濾中與已結合在膜上的抗原相結合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應即在膜中央顯示紅色斑點。3.試劑和操作滲濾裝置是滴金法測定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒的圓孔下，緊密關閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置（圖19-1）。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個反應過程都是在滲濾裝置上進行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應板。當前第51頁\共有54頁\編于星期五\10點

圖19-1DIGFA滲濾裝置及操作示意圖A：操作示意圖B:裝置分解圖斑點免疫滲濾試驗當前第52頁\共有54頁\編于星期五\10點斑點免疫層析試驗1.原理：斑點免疫層析試驗（DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般2.試劑和操作免疫層析試驗以單克隆雙抗體夾心法為例。試驗所用試劑全部為干試劑，多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條（圖19-2），試劑條上端（A）和下端（B）分別粘貼吸水材料，免疫金復合物干片粘貼在近下端（C）處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有兩個反