植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)演示文稿

植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（優(yōu)選）第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)當(dāng)前第2頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)的特性：

1.植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，具有纖維素細(xì)胞壁，抗剪切力差；2.細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，易受微生物污染，有時(shí)需用抗生素；3.細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)350um一400um的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難；4.培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng)5.培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過(guò)程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。當(dāng)前第3頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)1當(dāng)前第4頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基１.營(yíng)養(yǎng)需求：

植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜，除水分外，其它營(yíng)養(yǎng)成分可分為如下幾類(lèi)：

(1)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng):如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；

(2)維生素：如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；

(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；

(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋(píng)果汁等；

當(dāng)前第5頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)(5)植物激素:如生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸；其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類(lèi)、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸類(lèi):如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋(píng)果酸及反丁烯二酸等.2.培養(yǎng)基：

(1)固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等

(2)液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等當(dāng)前第6頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)三、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括單細(xì)胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）、懸浮培養(yǎng)、固相化培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。當(dāng)前第7頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)單細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)分離的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法。（1）單細(xì)胞的分離：從葉片直接分離：采用機(jī)械法（將葉片輕輕研碎、然后過(guò)濾和離心純化）或酶解法（采用果膠酶處理葉片）由葉肉細(xì)胞分離。B.從愈傷組織分離：由離體組織獲得愈傷組織，再由愈傷組織分離單細(xì)胞通過(guò)愈傷組織振蕩培養(yǎng)、過(guò)濾和離心等步驟分離單細(xì)胞。當(dāng)前第8頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)單細(xì)胞培養(yǎng)方法：（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過(guò)程稱(chēng)為平板培養(yǎng)法。。方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過(guò)篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散的細(xì)胞，洗滌離心除酶，細(xì)胞濃縮物經(jīng)計(jì)數(shù)及稀釋?zhuān)臃N到加熱熔化而剛冷卻至35℃左有的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25℃含5％CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞即可生長(zhǎng)成團(tuán)。當(dāng)前第10頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)當(dāng)前第11頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（2）看護(hù)培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞放在一個(gè)方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長(zhǎng)的愈傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。當(dāng)前第12頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（3）微室培養(yǎng)法：懸浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。當(dāng)前第13頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（4）條件培養(yǎng)：是指采用條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)單細(xì)胞的方法，條件培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入高密度的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，一定時(shí)間后這些細(xì)胞就會(huì)向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件化，簡(jiǎn)單的方法是采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6周高密度細(xì)胞過(guò)濾掉，制成液體或固體培養(yǎng)基接種單細(xì)胞。（5）紙橋培養(yǎng)：是用于植物莖尖分生組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法，也可用于單細(xì)胞。是使濾紙的兩端進(jìn)入培養(yǎng)基，中央部分露出培養(yǎng)基表面，將所要培養(yǎng)的細(xì)胞置于濾紙上培養(yǎng)。（P80，圖5-4）當(dāng)前第14頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.懸浮培養(yǎng)法：

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)即植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使之在體外生長(zhǎng)和發(fā)育，并保持良好的分散性。特點(diǎn)：可以工廠化生產(chǎn)，提供大量一致的細(xì)胞懸浮細(xì)胞的來(lái)源：愈傷組織，某個(gè)器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過(guò)物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得。當(dāng)前第15頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)(1)優(yōu)良的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必需滿足：

A.懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十個(gè)以下的細(xì)胞組成。B.均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。C.生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的量一般2—3天甚至更短時(shí)間便可增加一。當(dāng)前第16頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)(2)培養(yǎng)過(guò)程：

將愈傷組織、無(wú)菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，單細(xì)胞濾液作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。(3)懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)：

培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞總數(shù)不斷增加，一定時(shí)間后產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)，生長(zhǎng)趨于停止。然后進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，其過(guò)程表現(xiàn)出嚴(yán)格可重復(fù)周期性變化，細(xì)胞增長(zhǎng)規(guī)律與微生物相同，有延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、直線生長(zhǎng)期、減慢期及靜止期等階段。植物細(xì)胞接種時(shí)要達(dá)到一定細(xì)胞濃度，通常為0.25xl0‘細(xì)胞／ml一0.5x10‘細(xì)胞／m1。當(dāng)前第17頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線當(dāng)前第18頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)(4)懸浮培養(yǎng)類(lèi)型：A.分批培養(yǎng)(Batchculture)：

分批培養(yǎng)是在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞材料生長(zhǎng)在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會(huì)使細(xì)胞停止生長(zhǎng)。繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生長(zhǎng)過(guò)程包括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。分緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（1-2rpm）、震蕩培養(yǎng)（100rpm）、快速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（80-120rpm）和攪拌培養(yǎng)。當(dāng)前第19頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)B.連續(xù)培養(yǎng)(Continuousculture):

是用一定容積的特定容器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過(guò)程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖連續(xù)進(jìn)行，同時(shí)有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉式連續(xù)培養(yǎng)和開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)。最大特點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)速率標(biāo)準(zhǔn)一致，新形成的細(xì)胞補(bǔ)償了被排出的細(xì)胞，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞密度、生長(zhǎng)速度、化學(xué)成分、細(xì)胞代謝活性都維持恒定?？赏ㄟ^(guò)改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)。

化學(xué)恒化法：通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液或某一成分的含量進(jìn)行控制。

濁度恒定法：比濁計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)定渾濁度而進(jìn)行流量控制。當(dāng)前第20頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)當(dāng)前第21頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)C.半連續(xù)培養(yǎng)：

利用培養(yǎng)罐進(jìn)行細(xì)胞大量培養(yǎng)的一種方式，當(dāng)培養(yǎng)罐內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增殖到一定量后，倒出一半細(xì)胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐內(nèi)，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)進(jìn)行再培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠獲得大量均勻一致的培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)前第22頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（5）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化：同步化培養(yǎng)室之培養(yǎng)基中的大部分細(xì)胞都能同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期（G1、S、G2和M）的各個(gè)階段。實(shí)現(xiàn)懸浮細(xì)胞同步化的方法有：

A饑餓法：先對(duì)細(xì)胞斷絕供應(yīng)一種進(jìn)行細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓后，當(dāng)重新加入該限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同時(shí)進(jìn)行分裂。

B抑制法：使用DNA合成抑制劑，如5-氨基嘧啶等也可以使細(xì)胞同步化。由于核酸類(lèi)似物的存在阻止了DNA的合成，細(xì)胞周期只能進(jìn)行到G1期，細(xì)胞都滯留在G1或S期的邊界，當(dāng)去除抑制劑后，細(xì)胞就進(jìn)入同步分裂。C.采用發(fā)酵器系統(tǒng)進(jìn)行同步化：通過(guò)充入氮?dú)獾姆椒刂萍?xì)胞分裂活力，然后恢復(fù)普通空氣狀態(tài)時(shí)再度分裂。當(dāng)前第23頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（6）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的植株再生：

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞形成體細(xì)胞胚或誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后再由愈傷組織再生植株。（7）影響懸浮培養(yǎng)的因素：A培養(yǎng)基：通常需要高硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，以及含磷量高的培養(yǎng)基。B.細(xì)胞密度：最低密度為0.5×105~1.0×105。C.植物激素和其他附加成分:添加適當(dāng)濃度的激素和氨基酸。D.培養(yǎng)基pH值：通過(guò)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)比例或加入化學(xué)成分穩(wěn)定pH值。E.CO2濃度：低密度培養(yǎng)中，CO2對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞分裂有較大的影響，需控制適當(dāng)濃度。當(dāng)前第24頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3.固相化培養(yǎng)技術(shù)：

細(xì)胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊脂、海藻酸鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，但營(yíng)養(yǎng)液可以在基質(zhì)中流動(dòng)。當(dāng)前第25頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（1）固相化培養(yǎng)的特點(diǎn)：A.消除剪切力；B.細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，促進(jìn)次生代謝過(guò)程；C.細(xì)胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積累；D.便于操作，不易污染。E.便于產(chǎn)物收集。當(dāng)前第26頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)當(dāng)前第27頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

第二節(jié)園藝植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

通過(guò)一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細(xì)胞壁，并像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。當(dāng)前第28頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)蝴蝶蘭原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自PlantCellReports，2007，26：719-725）當(dāng)前第29頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)非洲百合原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（Agapanthuspraecox）（圖片引自PlantCell,TissueandOrganCulture，2003，72（1）：63-69）當(dāng)前第30頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)球根鳶尾原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自Euphytica，1999，105:99–102）當(dāng)前第31頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)針葉石竹葉片原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生（圖片引自InVitroCell.Dev.Biol.—Plant2005,41:794–800）當(dāng)前第32頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)仙客來(lái)原生質(zhì)體培養(yǎng)及體胚途徑再生（圖標(biāo)引自PlantCellTissOrganCult,2010,101:171–182）當(dāng)前第33頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)一、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義（1）原生質(zhì)體可以作為體細(xì)胞無(wú)性系變異和突變體篩選的材料；（2）利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取(病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì))；（3）原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交）。（4）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。（5）也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無(wú)性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。當(dāng)前第34頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

自1970年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來(lái)，通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國(guó)首先報(bào)道。原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過(guò)程。當(dāng)前第35頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)(一)原生質(zhì)體的制備：1、材料來(lái)源與預(yù)處理：（1）材料來(lái)源：

可以采用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

當(dāng)前第36頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（2）預(yù)處理：

A.預(yù)質(zhì)壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時(shí)，再于28—34℃保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的；

B.預(yù)培養(yǎng):將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長(zhǎng)5—7個(gè)星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；

E.低溫處理:夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動(dòng)種子應(yīng)于4℃過(guò)夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。當(dāng)前第37頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.制備原生質(zhì)體的酶類(lèi)：高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化，故選擇消化細(xì)胞壁的酶類(lèi)是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。當(dāng)前第38頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當(dāng)前第39頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)常用的酶類(lèi)有：A.纖維素酶（Cellulase

），如OnozukaR—10及RS，國(guó)內(nèi)常用的為EA3—867，其中含少量果膠酶；B.果膠酶（Pectinase），如MacerozymeR-10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過(guò)2％，作用時(shí)間長(zhǎng)有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細(xì)胞為0．05％；C.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D.半纖維素酶（Hemicellulase），如RhozymeHP150，用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;E蝸牛酶（Snailase），是一種混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。當(dāng)前第40頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。酶液pH值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時(shí)，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時(shí)pH5.4-pH5.6為宜，降至4．8以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過(guò)濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。當(dāng)前第41頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3．原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分—步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。當(dāng)前第42頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當(dāng)前第43頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（3）純化需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)(100目一400目)濾除較大雜物后再洗滌純化。

A.離心法:原生質(zhì)體混合物于500—l000rpm離心5min,吸去上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復(fù)洗滌3一4次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌備用；B.飄浮法:離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時(shí)．可用20％蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面．碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化，但產(chǎn)量低，有時(shí)對(duì)原生質(zhì)體造成損傷；C.界面法:利用高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，將原生質(zhì)體混合物置于葡聚糖及PEG混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純度原生質(zhì)體；

D.滴洗法:原生質(zhì)體混合物置于孔徑8um濾器中，用洗液以l--2滴／秒速度自然過(guò)濾洗滌，其過(guò)程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。當(dāng)前第44頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)Brassicaleavesatthestartandend

ofincubationinenzymesolutionLeavesslitintothinstripsandplacedinenzymesolutionWelldigestedleaves當(dāng)前第45頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)PelletcontainsdebrisTubeaftercentrifugationofprotoplastswithsucroseBandofprotoplastsClose-upofbandofprotoplastsfloateduponsucrose當(dāng)前第46頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

4．原生質(zhì)體活力測(cè)定

純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測(cè)定后方可用于培養(yǎng)．測(cè)定方法有；（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：來(lái)源于葉片的原生質(zhì)體，呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來(lái)源于愈傷組織及懸浮細(xì)胞者，胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運(yùn)動(dòng)活躍者活力較高；（2）活體染色法：用0.1％酚番紅或伊文思藍(lán)染色、不著色者為活原生質(zhì)體，染色者為無(wú)活力原生質(zhì)體；（3）熒光染料活休染色法：用雙醋酸熒光素染色，染料可自由透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過(guò)細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。當(dāng)前第47頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)5.影響原生質(zhì)體體產(chǎn)量和活力的因素：（1）材料來(lái)源：選擇幼嫩組織分離原生質(zhì)體，或快速生長(zhǎng)愈傷組織或?qū)?shù)期懸浮細(xì)胞。（2）酶處理：酶的種類(lèi)和濃度，處理時(shí)間，pH等條件。（3）滲透穩(wěn)定劑：酶液、原生質(zhì)體清洗液和原生質(zhì)體培養(yǎng)液均需保持適當(dāng)?shù)臐B透壓。當(dāng)前第48頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：1.培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，1.2%瓊脂,45oC.（2）液體培養(yǎng)：

A.淺層培養(yǎng)法:其過(guò)程是將1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖1—2次，防止粘壁；

B.懸滴培養(yǎng)法:其過(guò)程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為5一10、50—100及100一200ul等，保持一定滴距．每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

C.雙層培養(yǎng)法:先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

D.看護(hù)培養(yǎng)法:在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度(5一lo個(gè)／細(xì)胞／m1)懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。當(dāng)前第49頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)原生質(zhì)體培養(yǎng)常規(guī)方法與包埋球培養(yǎng)（圖片引自PlantCellReports，2007，26：719-725）當(dāng)前第50頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)榆樹(shù)原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)（圖片引自PlantCellTissOrganCult，2006,86:359–366）當(dāng)前第51頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.培養(yǎng)條件：

密度：平板培養(yǎng)103~104個(gè)/ml,液體培養(yǎng)104~105個(gè)/ml溫度：多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照：500lx,18h或2800lx連續(xù)光照多數(shù)要求黑暗或弱光當(dāng)前第52頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3.細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂：l一3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實(shí)。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周?chē)Ｔ?一2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同，常在1％—90％之間。當(dāng)前第53頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當(dāng)前第54頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)4.愈傷組織形成及胚狀體形成原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開(kāi)始分裂，就可能繼續(xù)生長(zhǎng)：A.形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織；愈傷組織通過(guò)器官發(fā)生或體細(xì)胞配途徑形成再生植株。B.形成胚狀體，再產(chǎn)生植株；

隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)3—4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長(zhǎng)。當(dāng)前第55頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

5.植株再生

除少數(shù)植物通過(guò)胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化形成芽及根再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到1—2mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；(2)與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素;(3)在誘導(dǎo)器官分化過(guò)程中，一般采用15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。無(wú)根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長(zhǎng)素，而不含細(xì)胞分裂素，無(wú)根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。當(dāng)前第56頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

第三節(jié)園藝植物原生質(zhì)體融合

在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為植物細(xì)胞融合，或植物體細(xì)胞雜交。但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來(lái)源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用，并可再生細(xì)胞壁，形成完整植株。當(dāng)前第57頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株去掉細(xì)胞壁植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞融合當(dāng)前第58頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)當(dāng)前第59頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)特點(diǎn)：(1)可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；(2)可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣；(3)一次操作可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)以上親本的融合作用(4)可獲得呈現(xiàn)雙親個(gè)體基因型總和的雜種；(5)可形成有性生殖障礙植物的種間雜種；當(dāng)前第60頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)一、細(xì)胞融合技術(shù)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程，有時(shí)無(wú)需任何處理亦產(chǎn)生融合現(xiàn)象，為自發(fā)融合，但融合率極低。異源原生質(zhì)體融合需某種外力作用才能實(shí)現(xiàn)。1.化學(xué)融合（1）鹽類(lèi)融合法：硝酸鹽（如NaNO3）、氯化物（如NaCl等）可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進(jìn)原生質(zhì)體聚集，對(duì)原生質(zhì)體無(wú)損害，可以用于融合，但融合率低；（2）高Ca2＋和高pH值誘導(dǎo)，如煙草葉肉原生質(zhì)體于pH10.5，0.05mol/LCaCl2培養(yǎng)基中，37℃保溫，融合率可達(dá)25％，并可獲得雜種植株；(3)PEG誘導(dǎo)，在高濃度PEG溶液中，原生質(zhì)體發(fā)生聚集作用，經(jīng)稀釋后，50％以上原生質(zhì)體發(fā)生融合作用，且對(duì)多種不同原生質(zhì)體均有效；(4)高Ca2+、高pH值及PEG結(jié)合誘導(dǎo)法，此為方法(2)和(3)相結(jié)合的改良法，高Ca2+和高pH值對(duì)原生質(zhì)體損傷小，但對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體促融作用小于PEG。(5)其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇等融合方法。當(dāng)前第61頁(yè)\共有75頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.物理融合：

包括顯微操作、離心震蕩、激光照射及電融合等，其中電融合應(yīng)用最普遍。進(jìn)行電融合時(shí)，將一定密度的原生質(zhì)體懸液置于一個(gè)融合小室，小室兩端裝有電極，在不均勻的交變電場(chǎng)作用下，原生質(zhì)體細(xì)胞彼此靠近，緊密接觸，在兩個(gè)電極間排列成串珠狀，此時(shí)