第二章分子克隆的工具酶

第二章分子克隆的工具酶第一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一切割位點可為獲得DNA的物理圖的特殊的標記利用限制性內切酶切割產(chǎn)生特殊DNA片段的能力使得純化那些DNA片段成為可能獲得的限制性DNA片段可作為DNA操作中的基本介質第二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一任何物種都有排除異物保護自身的防御機制 免疫系統(tǒng) 細菌的限制與修飾系統(tǒng)限制性內切酶修飾酶第三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)限制性內切酶Restrictionendonuclease第四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一一、限制與修飾Restrictionandmodification50年代初，發(fā)現(xiàn)hostcontrolledspecificity噬菌體具有代表性和普遍性其在不同宿主中的轉染頻率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時受到限制的現(xiàn)象。第五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一E.coliKE.coliBE.coliCKBC第六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一E.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411第七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結果甲基化：AN6甲基-腺膘呤

C5’甲基-胞嘧啶第八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.限制酶的發(fā)現(xiàn)60年代，限制內切酶和限制酶的概念1968年首次從E.coliK中分離限制性內切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的識別位點但沒有特定的切割位點切割位點遠離識別位點1000bp以上第九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1970年美國約翰·霍布金斯大學H.Smith偶然發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA細胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA

即HindII酶第十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYRPy表示嘧啶，Pu表示嘌呤第十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一5’...GAATTC...3’3’…CTTAAG...5’EcoRI第十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.限制酶的命名宿主屬名第一字母、種名頭兩個字母菌株或型號序號羅馬字HindIIEcoRI

第十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一例如：HindⅢ

Haemophilusinfluenzae（流感嗜血桿菌），ｄ：表示菌系為ｄ型血清型；

Ⅲ：表示分離到的第三個限制酶。Eco

RI—Escherichiacoli

RI

EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質粒上Hin

dⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSac

I(II)—Streptomycesachromogenes

I(Ⅱ)第十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第Ⅰ類酶（切割部位無特異性）：

如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時需ATP、Mg++等輔助因子第Ⅱ類酶（切割部位有特異性）：

如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時需Mg++存在4、限制性內切酶的分類：III類識別位點嚴格專一（不是回文序列）：切點不專一，往往不在識別位點內部。

NEB；Invitrogen公司；promega普洛麥格；TakaRa.第十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一二、限制酶的識別序列

2、識別特定堿基順序：2、1回文對稱序列（palindrome，從兩個方向閱讀其序列相同的序列）。1、限制酶識別序列長度4，5，6個堿基對。4堿基酶識別位點在DNA分子中的頻率6堿基酶稀有切割限制酶第十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一R=AorGY=CorTM=AorCK=GorTS=CorGW=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT第十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

3、Ⅱ型限制性核酸內切酶的切割方式

切點大多數(shù)在識別順序之內限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結構是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

BbvcI第十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一三、限制酶產(chǎn)生的末端種類

1.粘性末端１）３’-端突起，２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸第十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

2.平末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

在對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈

HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC

第二十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.非對稱突出端①來自非對稱識別序列

CCTCAGCBbvCIGGAGTCG第二十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

②簡并序列

AccI

GT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC第二十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

③間隔序列

DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG第二十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一4.同裂酶

1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

第二十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一①同序同切這些酶識別序列和切割位置都相同

HindIIHincII

GTY/RAC

HpaIIHapII

C/CGG

MobISau3AI

/GATC第二十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②同序異切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC識別的序列是相同的，但它們的切割位點不同第二十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識別和切割位點為G↓AATTC，ApoⅠ識別和切割位點為R↓AATTY，后者可識別前者的序列。第二十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一④其它

SalI

G/TCGAC

AccI

GT/MKAC

HincII

GTY/RAC第二十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

許多不同的限制酶來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進行粘端連接。5、同尾酶（isocaudamer）：GATC4個核苷酸組成的粘性末端平端同裂酶第二十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一四、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

雙酶切PCR產(chǎn)物第三十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTCC>90>90

第三十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一PstI

GCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)14

>90>90

CTGCAG(N)2000第三十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1、保護堿基

限制性內切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩(wěn)定的結合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護堿基。PCR引物設計時，為保護5’端外加的內切酶識別位點，使酶切完全而添加.第三十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

比如設計引物5'端導入酶切位點的時候,一般導入3–4個;導入的堿基,最好是A/G/C/T比較平均,并能部分平衡整個引物的GC%和Tm;G/C為主,可以使引物5'形成所謂GCClamp(有的軟件,認為這樣好).別的就沒什么了.加幾個和加哪幾個的問題/techinfo/re/restrdigpcrii.htm第三十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

載體的酶切位點也會碰到，相臨的2個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切割。第三十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第三十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第三十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第三十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstI第四十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIXhoI:

1EcoRI100%PstI:1EcoRI88%第四十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一五、位點偏愛(sitepreferences)單位酶:在建議使用的緩沖液及溫度下，在20l反應液中反應1小時，使1gDNA完全消化所需的酶量DNA第四十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

某些限制酶對同一介質中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。第四十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一*1975EcoRI切割

phage(Lambda)中的5個位點，并不是隨機的，靠近右端的位點，比分子中間的位點切割快10倍。1.現(xiàn)象第四十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一*

有4個SacII位點三個在中央一個在右臂（Right-terminus）

at40,386

中央三個快50倍第四十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一NEB檢測了許多限制酶，有許多酶的差異在10倍的范圍上，但有許多酶有較大的差異,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG第五十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(1)pBR322含4個NarI位點1單位酶1hr(標準條件)將兩個位點完全切割但是另外兩個位點50單位,16小時不能完全切割完全第五十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(2)NaeI在pBR322也有4個位點，其中兩個易切割，有一個有點慢,第四個慢50倍。在

DNA上NarI和NaeI各都有一個位點，但是過量的酶只能完成部分酶切。第五十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.原因(1)

在切割DNA之前需要同時與兩個識別位點相作用第五十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一plasmidPlasmid/SalIPlasmid/EagI第五十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一六、酶切反應條件任何一個提供商都會標明其產(chǎn)品的最佳作用條件第五十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(一)緩沖液1.常規(guī)緩沖液pH,Mg++,DTT,BSA(10X)Mg2+的作用是提供二價的陽離子。巰基試劑對于保持某些核酸內切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護其免于失活。第五十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一①pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl,乙酸

Tris-HCL的作用在于，使反應混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內。②離子強度：NaCl高中低100mM50mM0第五十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③Mg++10mMMgCl2,MgAc④DTT(dithiothreitol,二硫蘇糖醇)1mM⑤100g/mlBSA少數(shù)需要第五十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

不同酶具有不同Buffer

各公司設立幾種常用BufferNEBuffer1NEBuffer2NEBuffer3NEBuffer4BufferABufferBBufferHBufferLRoche第五十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

對DNA進行雙酶切時，如何選擇緩沖液是相當重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA可純化或不純化）。第六十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.通用緩沖體系

Phamacia法瑪西亞

One-Phor-Allbufferplus,OPA+第六十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.注意事項a.取少量酶(方法or稀釋)b.最后加酶、盡快操作c.減少反應體積d.反應時間的延長e.分裝（對于多個反應）第六十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(二)反應溫度大多數(shù)為37℃一部分為50-65℃少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時活性多數(shù)10-50%TaqI(65℃)10%,ApoI(50℃)50%第六十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(三)反應時間

1hrormore許多酶延長其反應時間可減少酶的用量16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)第六十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一(四)反應終止EDTA終10mMEDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應2.加熱

37℃酶65℃20minotherwise80℃20min第六十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一不失活在80℃20min的酶37℃：Bg1IIHpaIPvuII65℃：Tth111ITspRI50℃：Bc1I第六十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.其它

DNA純化(苯酚,試劑盒)第六十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一七、星星活性(staractivity)

非特異性切割在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性1.概念第六十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一實際上星星活性是限制內切酶的一般性質，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI第六十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.酶的特異性變化方式與酶的種類和所應用的條件有關最普遍的活性變化1個堿基的變化識別位點外層堿基的隨意性以及單鏈缺口第七十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.引起星星活性的因素①高濃度甘油（>5%）②酶過量（>100U/g）③低離子強度（<25mM）④高pH(>pH8.0)第七十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一⑤有機溶劑PMSD(二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane⑥用其它二價陽離子代替Mg++Mn++，Cu++，Co++,Zn++第七十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一不同的酶對上述條件的敏感性不一樣PstI比EcoRI對高pH更敏感但后者對甘油濃度更敏感星星活性在絕大多數(shù)情況下，是可控制的第七十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一4.抑制星星活性的條件（措施）①減少酶的用量，避免過量酶切,減少甘油濃度②保證反應體系中無有機溶濟或乙醇③提高離子強度到100～150mM(如果不會抑制的話)④降低反應pH至pH7.0⑤使用Mg++作為二價陽離子第七十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.外因外因是可預見和控制的，如反應條件、底物的純度（是否有雜質、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積的選擇以及反應時間的長短等等。

九、影響活性的因素第七十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.“內因”①位點偏愛性

②甲基化③底物的構象構象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA。

PaeRTⅠ與XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5'端為CT則

PaeRTⅠ不能切割。第七十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一十、酶切位點的引入（酶切水平）第七十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.產(chǎn)生的5’突出端補平后連接EcoRIGAATTCCTTAAG第七十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstI第七十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstI第八十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI第八十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI第八十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA第八十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA第八十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA

AceIATTAAT

XmaIGAANNNNTTC

第八十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.同尾末端的連接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)

AlwI(GGATC4/5)第八十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.平端連接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)

MobI(GATC)第八十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一十一、酶切位點在基因組中分布的不均一性GC%酶切位點出現(xiàn)的機率BamHIGGATCCEcoRIGAATTC第八十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一在基因組中，堿基對的排列是非均勻的因此盡管GC含量相同的酶切位點，在基因組中出現(xiàn)的機率是不一樣的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb第八十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一·細菌基因組在大多數(shù)富含A+T的細菌中，CCG和CGG的排列是最少見的，所以含有這兩種序列的識別序列出現(xiàn)的機率就非常少·酵母基因組G+C%為38%，因此在重復序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的識別序列就特別少第九十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一哺乳動物細胞核基因組的G+C為41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位點在哺乳動物細胞就相當稀少。但是在哺乳動物細胞中，大多數(shù)CG序列是甲基化的第九十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)甲基化酶

MethylaseMethylation methyltransferase第九十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一一、甲基化酶的種類在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多數(shù)都有三個位點特異性的DNA甲基化酶第九十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基第九十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一PvuIIBamHIBclIBglIIXhoII

MboISau3AI

識別位點中含GATC序列

ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)

MboII(1/16)HphI(1/16)部分識別序列含GATC序列4個ClaI位點(ATCGATN)中有一個該序列第九十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一有些限制酶對Dam甲基化敏感不能切割相應的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等第九十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一一般哺乳動物DNA不會在A-N6上甲基化當需要在敏感位點上完全切割DNA時，必須從dam-

E.coli中提取DNA第九十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.Dcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基第九十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一EcoRII/BstNI

CCA(T)GG二者識別序列相同，但切點不同EcoRII受dcm甲基化作用影響B(tài)stNI可避免這一影響第九十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一受影響酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等不受影響酶有：KpnI

GGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等第一百頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一二、甲基化對限制酶切的影響1.修飾酶切位點①HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAACM.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI處理DNA后，GTCGAC將不受HincII切割第一百零一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②BamHIGGATCC

M.MspIm5CCGG如果BamHI前面為CC或后面為GG，那么M.MspI處理的DNA抵抗BamHI的切割第一百零二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③構建DNA文庫時用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因組DNA用M.EcoRI甲基化酶處理，然后加上合成的EcoRI接頭當再用EcoRI來切割時只有接頭上的位點可被切割第一百零三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.產(chǎn)生新酶切位點TCGATCGAAGCTAGCT

TaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*

*AGCT*AGCTDpnI第一百零四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)DNA聚合酶DNApolymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相輔的活性第一百零五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百零六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

真核細胞有4種DNApoly：也許是復合物，位于細胞核內，有催化細胞增生的作用。：小分子蛋白質（4.4kDa）曾從小牛胸腺出提出，與細胞增生無關。：100kDa，利用RNA為模板的效率比利用DNA為模板的效率高。其它：線粒體DNA聚合酶、催化線粒體DNA的合成。第一百零七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一原核細胞三種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關I．單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長II與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關III在細胞中存在的數(shù)目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶一、大腸桿菌DNA聚合酶IEcoliDNApolymeraseI第一百零八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.活性單鏈多肽(109kDa)

三種活性①5’→3’DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（帶3‘OH基）或5’突出DsDNAMg2+dNTPDNApolyI第一百零九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②5’→3’外切核酸酶活性底物:dsDNAorDNA:RNA雜交體活性：從5’端降解dsDNA，也降解

RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性)Mg2+

DNApolyI+dNTP第一百一十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③3’→5’外切酶活性底物：3’-OHdsDNAorssDNA活性：從3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封閉。Mg2+

DNApolyI+dNTPMg2+

DNApolyI+dNTPProofreading第一百一十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一反應平衡過量dNTP平端第一百一十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.用途①切口平移法標記DNANicktranslation（所有DNApoly中只有此有此活性）第一百一十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一Mg2+,低限量DNaseIdNTPDNApolyI產(chǎn)生切口切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移若有放射性dNTP,則可標記成探針第一百一十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②用于cDNA克隆中的第二鏈即單純的DNA聚合活性但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反轉錄酶第一百一十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③末端標記（交換或置換反應）Mg2+,DNApolyI[-P32]dATPA*TT4DNApolyT7DNApoly更好第一百一十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一二、Klenow酶E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment在蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解,從全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影響，或基因工程而得76kDa第一百一十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段Klenow聚合酶或Klenow大片段酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ全酶

大片段Klenow

小片段具有5′→3′的聚合活性和3′→5′核酸外切酶活性，5′→3′的核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶第一百一十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.活性共兩種,同DNApolyI2.作用①補平3’凹端，注意要用dNTP②抹平3’凸端，注意必須加足量dNTPT4和T7具更強3’--5’外切活性。③末端標記

A．置換反應同前,同樣被T4poly代替

B．補平3’--凹端的過程進行標記第一百一十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百二十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百二十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一④cDNA克隆中合成第二鏈⑤隨機引物標記⑥DNA測序（Sanger雙脫氧鏈末端終止法）被T7取代，Taq等PCR酶。⑦PCR反應被Taq等取代⑧在體外誘變中，用于從單鏈模板合成dsDNA僅利用DNA合成活性第一百二十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一三、T4噬菌體DNA聚合酶T4DNApolymerase來源于T4phage感染的E.coli

114kDa第一百二十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.活性由噬菌體基因編碼的，具有兩種酶催活性，即5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。與Klenow酶相似，但3’—5’外切活性強200倍

第一百二十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.用途①補平或標記3’

凹端必須有高濃度dNTP（末端標記）②置換反應必須有高濃度dNTP(一種)末端標記第一百二十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一③標記DNA片段即利用外切活性產(chǎn)生了3’凹端再補平（用標記的dNTP）第一百二十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百二十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一T4DNA聚合酶和取代合成法標記DNA片段第一百二十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一四、T7噬菌體DNA聚合酶T7DNApolymerase來源于T7phage感染的E.coli為兩種緊密結合的蛋白質復合體(基因5蛋白和宿主的硫氧還蛋白)第一百二十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一T7DNApoly為持續(xù)合成能力最強的一個平均長度要大得多,在測序時具有優(yōu)勢活性/功能與T4DNApoly、Klenow類似但3’→5’外切活性為Klenow的1000倍用途:A.替代T4的功能B.長模板的引物延伸第一百三十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一修飾的T7DNApolymerase99%3’—5’外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于測序反應（測序酶）SequenaseUSBBiochemical第一百三十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.特點：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴增，經(jīng)25次循環(huán)后才進入酶的反應穩(wěn)定期，一個DNA分子因而可被擴增4×106倍

DNA擴增技術又稱為聚合酶鏈式反應，它包括以下三個步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→

引物延伸(75℃)

五.TaqDNA聚合酶耐熱DNA聚合酶第一百三十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一六、反轉錄酶Reversetranscriptase依賴于RNA的DNA聚合酶1．種類來自AMV禽成髓細胞瘤病毒Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒5’→3’合成DNA無3’→5’外切活性第一百三十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百三十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一①AMV

二鏈多肽(62kDa/94kDa)具5’→3’DNA聚合活性具很強的RNA酶H活性(降解與DNA雜交的RNA)在反應開始時,引物和mRNA模板雜交體可成為RNaseH的底物,此時模板的降解和cDNA的合成相競爭第一百三十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一反應終止時，RNaseH可在正在增長的

DNA鏈近3’端切割模板趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量并限制其長度但在42℃(雞的正常體溫),能有效發(fā)揮DNA合成作用，能有效地拷貝較復雜的mRNA

早期提純過程中易被內切酶污染,cDNA不超過1kb,現(xiàn)已解決第一百三十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit是用于從TotalRNA或mRNA高保真合成cDNA的2StepRT-PCR試劑盒。反轉錄反應使用了TaKaRa獨自開發(fā)的反轉錄酶PrimeScriptRTase，該酶是一種新型的RNaseH-型反轉錄酶，無RNaseH活性，不會分解模板RNA，能夠有效合成長鏈的1st-strandcDNA。本反轉錄酶具有極強的延伸能力，即使對有復雜二級結構的RNA，在42℃條件下也能得到良好的反應效果，無需進行高溫反轉錄反應，因為高溫的反轉錄反應會導致RNA的降解。PCR反應選用兼具高保真和高效擴增性能的PrimeSTARHSDNAPolymerase，可以很好地應用于cDNA克隆等對保真性要求高的實驗。使用本試劑盒擴增得到的PCR產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，可克隆于平滑末端的載體中。

第一百三十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②M-MuLV

M-MLV逆轉錄酶是一種依賴于RNA和DNA的DNA聚合酶。它可以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜合鏈為模板，以RNA或DNA為引物啟動DNA合成。該酶帶有針對RNA-DNA雜合鏈中RNA的RNaseH活性。本產(chǎn)品來源于帶有編碼莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉錄酶的pol基因片段的E.coli菌株。單肽84kDaRNaseH活性弱利于合成較長cDNA第一百三十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2．用途①cDNA克隆②測轉錄起始點（引物延伸法）③5’突出DNA的補平④測序反應(當用DNApolyI,Klenow或測序酶不理想時)⑤其它RT-PCRRNA二級結構第一百三十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一3.活性①5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNAorDNA模板及帶3’OH的RNA或DNA引物②RNaseH活性RNaseH-突變第一百四十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一4.注意事項

①無3’→5’外切校正作用，在高dNTP和Mn2+時，每500個bases會有一個誤摻入。②為防止新合成的DNA提前終止，需高濃度dNTP。③單鏈拷貝，也可雙鏈合成（自身序列為引物，但效率低）,50g/ml放線菌毒D，抑制第二鏈合成。第一百四十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一七、末端轉移酶來源于小牛胸腺,存在于前淋巴細胞及分化早期的類淋巴樣細胞內的一種不尋常的DNApoly在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端T,C→首選Co2+A,G→首選Mg2+Terminaltransferase第一百四十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.底物DNA,可短至3個核苷酸,3’突出低離子強度時,平端或3’凹出端DNA亦可但效率低2.用途①在3’端加同聚尾，cDNA或載體，用于克隆，或標記②末端標記ddNTP(標記的)第一百四十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一37℃15min隨時間的延長尾亦長。3.同尾的長度第一百四十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)RNA聚合酶RNApolymerase來源于噬菌體感染宿主后所產(chǎn)生第一百四十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一SP6噬菌體聚合酶來源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株T3或T7噬菌體聚合酶來源于感染的大腸桿菌第一百四十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一1.活性這些RNA聚合酶實際上為轉錄過程中RNA合成的酶，識別DNA中特異的啟動子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。與DNA聚合酶不同，無需引物，但識別特異性位點第一百四十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.用途①體外：將這些RNA聚合酶特異性的啟動子安裝在載體,如pGEM-3Z載體(2.74kb,p13)中，用于體外轉錄（合成）與外源DNA同源的RNA，從而用作雜交探針，體外翻譯系統(tǒng)中的mRNA，體外剪接反應的底物第一百四十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第一百四十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一②體內：用于表達外源基因A.Ecoli先構建宿主菌，將T7polyRNA基因置于lacUV5啟動子之下，插入到噬菌體中，感染E.coli建立穩(wěn)定的溶原菌EcoliBL21(DE3)：lacUV5啟動子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于染色體的BL21處。第一百五十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一若將T7噬菌體啟動子控制的目的基因經(jīng)質粒載體導入該宿主菌中在IPTG(異丙基硫代--D-半乳糖苷)誘導啟動外源基因的表達另一種方法是，先導入重組質粒，再用（帶T7RNApoly）感染，激活目的基因的表達第一百五十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一B．酵母菌酵母啟動子+T7RNApolyin穩(wěn)定載體T7啟動+外源基因in另一載體第一百五十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第五節(jié)連結酶(Ligase)將兩段核酸連接起來的酶1.T4DNAligase

68kDaT4噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生催化DNA5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二脂鍵。這種反應需要供給能量，大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。第一百五十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3’羥基形成3’，5’－磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第一百五十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

底物：DNAorRNA(效率低)

粘端，切口，平端

影響因素：

PEG（低濃度）10%

單價陽離子（150-200mMNaCl）

提高平端連接速率第一百五十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

Weiss單位在37℃下20min催化1nmol32p從焦磷酸根置換到[,-32P]ATP所需的酶量。

NEB單位(NewEnglandBiolabs)20l,16℃,30min,300g/ml(0.12M5’末端)/HindIII連接50%所需的酶量第一百五十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一/HindIII(7個切點)23.1(kb)9.46.64.42.32.0564(bp)125

48502bp第一百五十七頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

1Weiss=67粘端連接單位

(NEB單位)

(Molecularcloning寫為60NEBunit)

1NEB單位=0.015Weiss單位第一百五十八頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

條件

16℃～4hr4℃overnight

需ATP5min連接T4DNAligaseRoomtemperature(BoehringerMeinnham公司)第一百五十九頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一平頭雙鏈DNA片段的連接操作

從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢的多。提高平頭末端連接效率的方法包括：①加大連接酶用量(10倍大于粘性末端的連接)。②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會。③加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用。④加入單價陽離子(NaCl),最終濃度150-200mmol/L。第一百六十頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一2.E.coliDNA

連接酶與T4DNAligase相似,但需煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)參與平端連接效率低，用于置換合成法作cDNA克?。ú粚NA連接到DNA,不連接RNA）第一百六十一頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一第六節(jié)核酸酶(nuclease)一、BAL31核酸酶

來源于AlteromonasespejianaBAL3主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個內切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴Ca++EGTA可抑制活性第一百六十二頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一

連續(xù)去除3‘端單核苷酸后形成的單鏈DNA，可被內切核酸活性降解用途：從兩頭縮短DNA(用于缺失突變等），活性發(fā)揮均勻，活性與酶濃度成線性關系確定DNA二級結構DNA限制酶切圖注：可能有單鏈突出，可用DNApoly補平，單鏈突出的長度與酶濃度有關，如：2-5u/ml,平均有5個bases單鏈，10-20%保持平端第一百六十三頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一二、Sl核酸酶來源于米曲霉(Aspergillusoryzae)降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡核苷酸對dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感酶量大可完全消化雙鏈，中量，可在切口或小缺口處切割雙鏈作用：用于分析DNA:RNA雜交體的結構去掉突出的單鏈尾，以產(chǎn)生平端打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)第一百六十四頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一三、綠豆核酸酶MungBeanNuclease

來源于綠豆芽與Slnuclease相似但比Sl更溫和在大切口上才切割可使DNA突出端變成平端第一百六十五頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一CCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCATGGGGTACCHindIIIMBNCCATGGGGTACCNcoI第一百六十六頁，共一百七十八頁，編輯于2023年，星期一四、核糖核酸酶ARNaseA（來源于牛胰）內切核酸酶可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端

形成

帶嘧啶3’磷酸的單核苷酸或末端帶嘧啶3’磷酸的寡核苷酸用途：除去DNA樣品中的RNA

除去DNA:RNA中未雜交的RNA區(qū)確定雜交體DNA的RNA中單突變的位置可能污染其它酶（如D