基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

生命科學(xué)第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。生命科學(xué)生命科學(xué)第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)外切核酸酶第六節(jié)單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)RNA酶生命科學(xué)本章重點掌握的內(nèi)容限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。II型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項及產(chǎn)生星星活性的原因、影響酶活性的因素。DNA聚合酶的種類及性質(zhì)其它常用工具酶的功能及其用途。生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機制

限制/修飾系統(tǒng)

(R-M,Restriction-modificationsystem)生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phageλ(K)

人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

限制(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。

限制作用:實際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機制。

生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。

修飾作用:宿主細(xì)胞通過甲基化作用達(dá)到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

1968Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ

1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ

1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象

寄主控制的限制與修飾的作用

一是保護(hù)自身的DNA不受限制；

二是破壞外源DNA使之迅速降解。

基因工程中，應(yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體。

生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性內(nèi)切酶的類型

限制性內(nèi)切核酸酶（限制性酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識別序列切割位點雙功能（具甲基化）異源三聚體ATPMg2+SAM距識別序列1kb處隨機性切割單一功能同源二聚體Mg2+

4-6bp回文序列識別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化）異源二聚體ATPMg2+

距識別序列下游24-26bp處隨機性切割基因工程中使用注：SAM為S－腺苷甲硫氨酸生命科學(xué)第一節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶1.I型限制性內(nèi)切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。如EcoB和EcoK。（1）識別位點序列未甲基化修飾的特異序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點

在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈。

（3）作用機理

需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

Recognizesite

cut

1-1.5kb

生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2.II類限制性內(nèi)切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。分離的第一個酶是HindⅡ

（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA的來源無關(guān)。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAAB

NB’A’

或生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點

識別位點處。

切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端生命科學(xué)AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶3.III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA(識別位點下游24-26bp)，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+。EcoP1:AGACC

EcoP15:CAGCAG

在基因工程操作中用途不大。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識別序列切割位點多功能（具甲基化）異源三聚體ATPMg2+SAM距識別序列1kb處隨機性切割單一功能同源二聚體Mg2+

4-6bp回文序列識別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化）異源二聚體ATPMg2+

距識別序列下游24-26bp處隨機性切割核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶三、限制性內(nèi)切酶的命名

1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：

1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。

大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；

流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.

用一個右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。

3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。

4.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，

修飾酶前面要帶上M（Modification）(現(xiàn)已省略)。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶三、限制性內(nèi)切酶的命名

EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（一）識別序列識別順序的堿基數(shù)一般為4-6bp，少數(shù)識別更長，多數(shù)識別位點具有旋轉(zhuǎn)對稱性（回文結(jié)構(gòu)），少數(shù)的識別位點在切割位點之外，具旋轉(zhuǎn)對稱性

4bp

HpaⅠ

CCGG

HaeⅢ

GGCC

5bp

AvaⅡ

GGWCC

EcoRⅡ

CCWGG

6bp

BamHⅠ

GGATTC

SmaⅠ

CCCGGG

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNNNGGC

12bp

BstXⅠ CCANNNNNNTGC

N=A,T,G,C生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（二）切割方式

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3‘位酯鍵產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5’-P和3’-OH，產(chǎn)生3種不同的切口。

生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶1.5’突出的末端EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’EcoRI37℃5‘…G--C--T--G--OHP--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—POH--G--C--T--C…5’退火4--7℃5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2.3’突出的末端生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C

…5’PstI37℃5‘…C--T--G--C--A--OHP--G

…3’3‘…G--POH--A--C--G--T--C

…5’退火4--7℃5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C

…5’生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶粘性末端的意義

①連接便利

i）不同的DNA雙鏈：

只要粘性末端堿基互補就可以連接。

這比連接兩個平齊末端容易的多。

生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：

通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。

②

末端標(biāo)記

凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。

凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③

補平成平齊末端

粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶3.平頭末端生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶PvuII等產(chǎn)生的平頭末端

5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C…5’PvuII37℃5‘…G--C--T--C--A--G--OHP--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--POH--G--A--C--C--T--C…5’生命科學(xué)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶四、

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（二）切割方式

同裂酶（isoschizomers）：指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生不同或相同的末端。

同尾酶（isocaudamer）：指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大(相容性末端)。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶同尾酶舉例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、

BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

1U

核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時，使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用U表示。

大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/L

DTT1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h（DTT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)0-50mM低鹽酶100

mM中鹽酶150

mM高鹽酶Buffer生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

在滅菌的1.5ml離心管中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng):

20μl體積反應(yīng)體系如下：

DNA0.2-1μg

10×酶切buffer2.0μl

限制性內(nèi)切酶

1-2U（單位）

加ddH2O至

20μl

多種酶消化時若緩沖液條件相同，可同時加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

酶切反應(yīng)的終止

EDTA（終濃度10mmol/L)或SDS[終濃度0.1%(W/V)]65oC溫育

20min

酚/氯仿抽提，乙醇沉淀

酶解結(jié)果鑒定

瓊脂糖電泳生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

完全消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。

局部消化：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。

通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件

酶切的注意事項:

1.購買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。

進(jìn)行酶切消化時，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，

再從

-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時都應(yīng)更換一個無菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

2.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。

3.通常延長時間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時可用。

4.注意星號酶切活力。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（一）酶的純度

（二）DNA樣品的純度

DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（三）DNA樣品的甲基化程度

采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。

生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（四）酶切反應(yīng)的溫度與時間

多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37℃，如SmaI為25℃或30℃，SfiI為50℃

。反應(yīng)溫度過度或過低都會影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活。酶解時間可通過加大酶量而縮短，反之酶量較少時，可通過延長酶解時間以達(dá)到完全酶解DNA的目的。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（五）DNA的分子構(gòu)型

某些酶切割超螺旋質(zhì)粒DNA時，酶量比切割線性DNA時高出多倍，可高達(dá)20倍。酶最適溫度oC

酶最適溫度oC

酶最適溫度oC

ApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（六）限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液

高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的“星活性”（staractivity）現(xiàn)象。

EcoRI*代表EcoRI的星號活力。

星活性的特點:限制酶識別序列特異性降低

例如：EcoRI（高pH值或低鹽離子強度）

5’GAATTC3’變成5’NAATTN3’，另有一種情況是對AATT中的A、T分辨不嚴(yán)格商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件

1)反應(yīng)體系中甘油含量過高（>5%，V/V），應(yīng)使用能完全酶切DNA的最小酶量避免這種情況的發(fā)生；

2)限制酶用量過大（>100U/ugDNA）；

3)低離子濃度（<50mmol/ml）；

4)高pH（PH8.0）

5)含有有機溶劑（如二甲基亞砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）；

Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價陽離子存在。

6)不同的限制酶出現(xiàn)的星號活力的閾值也不一樣，常易發(fā)生星號活力的酶有：EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、HinfI等。

生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶

抑制星號活性的方法

1)盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。

2)盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。

3)將離子濃度提高到100-150mM（若酶活性不受離子

強度影響）。

4)將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。

5)二價離子用Mg2+。生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用：重組DNA前的切割

構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究生命科學(xué)第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶本節(jié)重點掌握的內(nèi)容

1、限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、星號活性。

2、II型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項及產(chǎn)生星活性的原因、影響酶活性的因素。生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶剪刀—限制性內(nèi)切酶針線、膠水—連接酶生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶一、概念與機理

DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶一、概念與機理

DNA連接酶只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。

注意：缺口（或稱切口）和裂口的區(qū)別?。。。?！注：關(guān)于“Gap”與“Nick”的概念。

1.Gap裂口：即DNA裂口，是指雙鏈DNA分子上的某一條鏈?zhǔn)ヒ粋€或數(shù)個核苷酸時所出現(xiàn)的DNA單鏈斷裂。GapinDNAistheabsenceofoneormorenucleotidesinonestrandofduplex.

2.Nick缺口：即雙鏈DNA分子的單鏈斷裂，即在相鄰的2個核苷酸分子之間，失去了(移走了)一個磷酸二酯鏈。NickinduplexDNAistheabsenceofaphosphodiesterbondbetweentwoadjacentnucleotidesononestrand.生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶對不同DNA分子的連接作用生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶二、DNA連接酶的種類（一）T4噬菌體DNA連接酶

特點：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

用途：

1)粘性末端的連接

2)平頭末端的相連

抑制劑:PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca2+>0.1mM生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶二、DNA連接酶的種類(二）大腸桿菌DNA連接酶連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子(三）熱穩(wěn)定DNA連接酶以NAD為輔助因子，優(yōu)先作用于切口連接酶使用注意事項

1)DNA連接酶不能催化兩單鏈DNA分子連接；

2)只能連接雙鏈DNA分子的單鏈切口(nick)；

3)不能連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致的缺口（gap）。生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶的部分性質(zhì)連接酶底物輔助因子巰基試劑粘性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體大腸桿菌DNA連接酶可行可行不行不行NAD+Mg2+不需要T4DNA連接酶可行可行可行可行ATPMg2+

需DTT噬熱菌DNA連接酶可行不行不行不行NAD+Mg2+

需要生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶DNA連接酶應(yīng)用圖解（一）分子間的連接

（二）分子內(nèi)的連接生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶三、DNA連接酶的反應(yīng)體系

四、影響連接反應(yīng)的因素

1.插入片段與載體的濃度比例：2-10:1增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象

2.反應(yīng)溫度：一般4~16℃

3.ATP濃度

4.連接酶濃度

10×T4DNALigaseBuffer 1μlpMD18-T（30ng/μl）1μl已純化的PCR產(chǎn)物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnits

ddH2O 至10μl生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補充)1.同聚物加尾法

生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補充)2.銜接物連接法

生命科學(xué)第二節(jié)

DNA連接酶平末端DNA片段的連接(補充)3.DNA接頭（adaptor）連接法

問：銜接物和DNA接頭有什么區(qū)別？？？銜接物（linker）是一種人工合成的雙鏈DNA短片段，其上具有一個或數(shù)個在將與其連接的載體DNA上不存在的限制酶識別位點，可按平齊末端連接法給平齊末端片段加上相同識別位點的銜接物，再用在銜接物中具有識別位點的合適限制酶切割，用常規(guī)方法連接的方法，提高平齊末端間的連接作用效率。接頭（adaptor）是一種具有粘性末端的短核昔酸雙鏈，它與平齊末端連接后，不用經(jīng)過切割即可與載體相連。生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶

3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性聚合速率

持續(xù)能力

大腸桿菌DNA聚合酶

低

有

中

低

Klenowfragment

低

無

中

低

T4DNA聚合酶

高

無

中

低

T7DNA聚合酶

高

無

快

高

化學(xué)修飾T7DNA聚合酶

低

無

快

高

遺傳修飾T7DNA聚合酶

無

無

快

高

逆轉(zhuǎn)錄酶

無

無

低

中

TaqDNA聚合酶

無

有

快

高

DNA聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，將脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分為：依賴于DNA的DNA聚合酶和依賴于RNA的DNA聚合酶。生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I

1957年，美國的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′2.5’→3’外切酶活性3.3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的三種活性生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I用途：

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）

2）補齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA

4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（一）基本性質(zhì)大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。

Klenow片段仍擁有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。

生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（二）用途

1.3’端補平：補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。

2.DNA3’末端標(biāo)記:在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。5’klenow

klenow

5’

生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶二、Klenow片段

（二）用途

3.cDNA第二鏈的合成

mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow

5’3’3’

5’

5’3’

引物

生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶三、T4噬菌體DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解單鏈更快）

。

在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位

生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶三、T4噬菌體DNA聚合酶（二）用途生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶四、T7噬菌體DNA聚合酶與測序酶

（一）T7噬菌體DNA聚合酶從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個亞基組成，已知DNA聚合酶中持續(xù)結(jié)合能力最強的一個。

（二）T7噬菌體DNA測序酶通過對T7DNA聚合酶進(jìn)行化學(xué)修飾，去除3’-5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、TaqDNA聚合酶

來源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種。

結(jié)構(gòu)：單亞基MW=94000d。

特點：熱穩(wěn)定性，70℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的40%。

活性：聚合最適溫度為75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性。用途：

1.PCR反應(yīng)。

2.測序，高溫下進(jìn)行DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。

來源商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)(42℃)。來自能表達(dá)Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的E.coli(37℃)。

結(jié)構(gòu)和活性：酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000

++++M-MLV84，000++生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

用途：

(1)5’→3’聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子；

(2)RNA酶H活性：對RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板的步驟。

(3)用于３’凹陷末端的標(biāo)記，雜交探針的制備和DNA序列測定。生命科學(xué)第三節(jié)

DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶五、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

RNaseH活性生命科學(xué)第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶來源及特點：

簡稱末端轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’→3’方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。

它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA。用途：

1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’末端。

2.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：

生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點。

3.用于在平頭DNA上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。生命科學(xué)第四節(jié)DNA修飾酶生命科學(xué)末端轉(zhuǎn)移酶功能圖解第四節(jié)DNA修飾酶3‘突出末端生命科學(xué)二、T4噬菌體多核苷酸激酶來源從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。功能

催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。

不論5’-OH端突出與否。

用途：DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶第四節(jié)DNA修飾酶生命科學(xué)三、堿性磷酸酶

1）堿性磷酸酶種類

細(xì)菌性堿性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase，BAP），從大腸桿菌中分離出來。具有抗熱性。

小牛腸堿性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase，CIAP），從小牛腸中純化出來。加熱68℃可完全失活。

2）堿性磷酸酶的特性

催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

3’HO-

-P

5’

3’HO-

-OH

5’3’HO-

-OH

堿性磷酸酶

5’P-

-OH

3’5’

第四節(jié)DNA修飾酶生命科學(xué)第四節(jié)DNA修飾酶生命科學(xué)3)堿性磷酸酶的功能

防止線性化的載體份子自我連接

其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會被修復(fù)。第四節(jié)DNA修飾酶生命科學(xué)第五節(jié)

外切酶核酸（自學(xué)）

核酸外切酶是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。一、作用于單鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）；大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）二、作用于雙鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）；噬菌體核酸外切酶（

exo）；T7噬菌體基因6核酸外切酶三、既可作用于單鏈又可作用于雙鏈的核酸外切酶

如：Bal31核酸酶

生命科學(xué)DNA外切酶切割方式識別位點單鏈大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’3’5’-OH大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’3’5’5’-P3’-OH雙鏈核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’3’-OH噬菌體核酸外切酶（

exo）5’3’5’-PT7噬菌體基因6核酸外切酶5’3’5’-P5’-OH單、雙鏈Bal31核酸酶5’3’3’5’3’-OH不同核酸外切酶的特性比較第五節(jié)

外切酶核酸（自學(xué)）生命科學(xué)第五節(jié)

外切酶核酸（自學(xué)）生命科學(xué)第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶（自學(xué)）

一、S1核酸酶

來源：來源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）

功能：是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶。注意：

對雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對不敏感。

酶量大可完全消化雙鏈，中量，可在切口或小缺口處切割雙鏈

用途：

(1)測定核酸分子的雜交程度；

(2)去除DNA片段中突出的單鏈尾巴；

(3)打開cDNA合成時形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。生命科學(xué)一、S1核酸酶第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶生命科學(xué)一、S1核酸酶第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶生命科學(xué)一、S1核酸酶第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶生命科學(xué)第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶一、S1核酸酶S1的用途：合成CDNA時切除單鏈環(huán)生命科學(xué)二、脫氧核糖核酸酶I來源于牛胰臟，分子質(zhì)量為31ku，是一種糖蛋白。用途：

1.與大腸桿菌DNA聚合酶I一起參加切口平移

2.制作DNA文庫

3.使用DNaseI足跡法測定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的精確結(jié)合位點

4.去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的模板DNA第六節(jié)

單鏈內(nèi)切核酸酶生命科學(xué)第七節(jié)

RNA酶（自學(xué)）一、核糖核酸酶A來源于牛胰臟，是一種內(nèi)切核糖核酸酶?？商禺惖毓鬜NA上嘧啶殘基的3‘端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。反應(yīng)終產(chǎn)物是嘧啶3’磷酸及末端帶嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。用途：（1）從DNA-RNA或RNA-RNA雜合體中去除未雜合的RNA區(qū)（2）確定DNA或RNA中單堿基突變的位置（3）RNA檢測（4）降解DNA制備物中的RNA分子生命科學(xué)

二、核糖核酸酶H核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA雜合體的RNA部分的核內(nèi)降解，產(chǎn)生不同鏈長帶3‘羥基和5’磷酸末端的寡核糖核酸。第七節(jié)

RNA酶

用途：

在cDNA克隆，合成第二鏈之前去除RNA。生命科學(xué)小結(jié)

酶切位點的確定lineDNAW=N+1c