生物分離工程技術(shù)第四張細(xì)胞破碎技術(shù)

4生物分離工程技術(shù)第四張細(xì)胞破碎技術(shù)當(dāng)前第1頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)第四講細(xì)胞破碎技術(shù)一、概述

二、常用的細(xì)胞破碎技術(shù)及其應(yīng)用三、細(xì)胞破碎技術(shù)研究的發(fā)展方向

四、思考題當(dāng)前第2頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)一、概述（一）細(xì)胞破碎的意義（二）細(xì)胞壁的成分與結(jié)構(gòu)（三）細(xì)胞破碎過程的檢測當(dāng)前第3頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（一）細(xì)胞破碎的意義目的：細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎(chǔ)。有效的細(xì)胞破碎對分離和純化任何細(xì)胞內(nèi)活性藥物成分都是必要的。細(xì)胞破碎與上游和下游工藝設(shè)計(jì)的關(guān)系上游通過細(xì)胞的生理狀態(tài)對細(xì)胞破碎效果產(chǎn)生影響；而下游則要考慮去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞蛋白質(zhì)的污染等對產(chǎn)品活性的影響。細(xì)胞破碎過程中必須考慮的因素

細(xì)胞壁的堅(jiān)韌程度、目標(biāo)產(chǎn)品的性質(zhì)、破碎的規(guī)模、方法、費(fèi)用等.當(dāng)前第4頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（二）細(xì)胞壁的成分與結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁

主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。霉菌的細(xì)胞壁

大多由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，含有少量蛋白質(zhì)和脂類。酵母和真菌的細(xì)胞壁

主要為葡聚糖為β-1，6葡聚糖，通過β-1，3糖苷鍵與D-葡萄糖第一側(cè)鏈交聯(lián)，也含有甘露糖和幾丁質(zhì)植物細(xì)胞壁：含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等當(dāng)前第5頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)原核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

電鏡下：

（1）革蘭陽性菌細(xì)胞壁較厚，具有20～80nm的肽聚糖層，約占細(xì)胞壁干重的50％。（2）革蘭陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2—3nm，占細(xì)胞壁干重的10％左右。

（3）在肽聚糖層外還有一較厚的外壁層，約8～10nm，主要為脂蛋白、脂多糖和其他脂類，含量為細(xì)胞壁干重的80％。當(dāng)前第6頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)酵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第7頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第8頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（三）細(xì)胞破碎過程的檢測①革蘭氏染色法②次甲基藍(lán)染色法③測定核酸與蛋白質(zhì)含量④離心細(xì)胞破碎液觀察當(dāng)前第9頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)①革蘭氏染色法

用革蘭氏染色劑進(jìn)行染色破壁的酵母呈粉紅色，而未破壁的酵母呈蘭紫色，分別計(jì)數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進(jìn)行鏡檢記數(shù)，計(jì)算破壁率。α---破壁率（100%）C---破壁前的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）C’---破壁后的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）n1---染色后呈紫色細(xì)胞數(shù)n2---染色后呈粉紅色細(xì)胞數(shù)當(dāng)前第10頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)②次甲基藍(lán)染色法

取未經(jīng)滅活的發(fā)酵液0.5ｍＬ,用9ｇ/Ｌ的生理鹽水稀釋100倍后,用次甲基藍(lán)染色5ｍｉｎ,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),計(jì)算出細(xì)胞的存活率。酵母存活率：

=[1-(染色細(xì)胞總數(shù)/酵母細(xì)胞總數(shù))]×100%.當(dāng)前第11頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)

③測定核酸與蛋白質(zhì)含量

分別在260和280ｎｍ波長下,測定發(fā)酵液的光吸收值，用Lorry法測量細(xì)胞破碎后上清中的蛋白質(zhì)含量也可以評估細(xì)胞的破碎程度，判斷細(xì)胞破碎率。核酸提高率：=[(處理后發(fā)酵液的吸光值/未處理發(fā)酵液的吸光值)-1]×100%當(dāng)前第12頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)

④用離心細(xì)胞破碎液觀察

用離心細(xì)胞破碎液觀察沉淀模型的方法來確定細(xì)胞破碎率，完整的細(xì)胞要比細(xì)胞碎片先沉淀下來，并顯示不同的顏色和紋理。對比兩項(xiàng)，可以算出細(xì)胞破碎率。當(dāng)前第13頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)二、常用的細(xì)胞破碎技術(shù)及其應(yīng)用細(xì)胞破碎方式高壓勻漿

高速珠磨

納米磨破碎撞擊破碎

滲透壓沖擊超聲破碎凍融法低溫玻璃化酶溶法---溶菌酶、纖維素酶等機(jī)械法化學(xué)法---化學(xué)滲透

---超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)物理法當(dāng)前第14頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)(八)化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法是使用某些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯)、螯合劑(EDTA)、表面活性劑(SDS、tritonX-100)、變性劑(鹽酸胍、脲)等改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來。化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同試劑對各種微生物細(xì)胞作用的部位和方式有所差異。化學(xué)滲透法有利也有弊當(dāng)前第15頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)EDTAEDTA作為螯合劑，可用于處理革蘭氏陰性菌(如E．coli)，對細(xì)胞的外層膜有破壞作用。革蘭氏陰性菌的外層膜結(jié)構(gòu)通常是靠二價(jià)陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持的，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子將脫落，使外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補(bǔ)，導(dǎo)致該區(qū)域通透性增強(qiáng)。當(dāng)前第16頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)TritonX-100TritonX-100是非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是內(nèi)膜的雙磷脂層。tritonX—100常與其它試劑混合使用。當(dāng)前第17頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)鹽酸胍和脲

鹽酸胍和脲是常用的變性劑。一般認(rèn)為胍能與水中氫鍵作用，削弱了溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能從大腸桿菌膜碎片中溶解蛋白。鹽酸胍不僅能改變細(xì)胞的通透性，而且能溶解不溶性重組蛋白(如包含體)，并在其它試劑的配合下使其二硫鍵斷裂，變性解離成單體，從而釋放出來。除去變性劑和雜蛋白后，在一定條件下恢復(fù)肽鏈內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，再折迭復(fù)性成具有活性的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第18頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)化學(xué)滲透法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①對產(chǎn)物釋出具有一定的選擇性。

例如用0.2mol／L胍處理E.coliC600-1，5h后80％位于胞間質(zhì)的β-內(nèi)酰胺酶釋放出來，而總的蛋白釋放率僅為4％。②細(xì)胞外形完整；碎片少，有利于后分離。③核酸釋出少，漿液黏度低，便于進(jìn)一步提取。缺點(diǎn)：①時(shí)間長，效率低。②化學(xué)試劑具有毒性。③通用性差。當(dāng)前第19頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（一）高壓勻漿破碎法1、高壓勻漿閥及其破碎機(jī)理

2、溫控與能耗3、存在的問題

當(dāng)前第20頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)1、高壓勻漿閥及其破碎機(jī)理

從高壓室(幾十兆帕)壓出的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過閥座D的中心孔道，從D和閥C之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達(dá)每秒幾百米。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)E上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列過程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞的破碎。當(dāng)前第21頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)高壓勻漿破碎的動(dòng)力學(xué)表達(dá)式S—細(xì)胞破碎率；k—破碎速率常數(shù)；p—壓力；N—循環(huán)次數(shù)；S，k，a，b，p等隨細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件變化當(dāng)前第22頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室級高壓均質(zhì)儀

當(dāng)前第23頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)高壓細(xì)胞破碎機(jī)當(dāng)前第24頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)2、溫控與能耗將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對于溫度敏感性物質(zhì)，需低溫操作。機(jī)械破碎的能耗主要包括提供動(dòng)力(如壓力)消耗的能量以及低溫操作耗費(fèi)的能量。如，提高壓力需增加能耗(3.5kW／100MPa)，同時(shí)產(chǎn)生熱量(23.8℃／100MPa)。當(dāng)前第25頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)3、存在的問題高壓勻漿破碎技術(shù)適合細(xì)菌和部分酵母菌細(xì)胞的破碎處理，而不適用于絲狀微生物細(xì)胞的破碎，這是由于絲狀微生物會對破碎器產(chǎn)生堵塞作用。細(xì)胞破碎時(shí)濃度應(yīng)在60％-80％(濕重／體積)，高于這個(gè)濃度時(shí)破碎效果有所降低。當(dāng)前第26頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（二）高速珠磨法

高速珠磨的破碎機(jī)理

溫控、能耗及存在的問題高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣當(dāng)前第27頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)1、高速珠磨的破碎機(jī)理如：株磨式組織研磨器小型株磨器

微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑(通常是直徑<1mm的無鉛玻璃珠)在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走當(dāng)前第28頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞破碎動(dòng)力學(xué)表達(dá)式S—細(xì)胞破碎率；k—破碎速率常數(shù)；t—細(xì)胞破碎時(shí)間，t=V/R，V為細(xì)胞懸浮液體積m3，R為懸浮液流量m3/s。當(dāng)前第29頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)珠磨式組織研磨器

利用微細(xì)玻璃珠，在高速運(yùn)轉(zhuǎn)下的相互碰撞，造成組織細(xì)胞的破裂與分散。適合珍貴樣品液的研磨，例如蛋白質(zhì)、酶及細(xì)胞液等。微細(xì)玻璃珠可回收使用。樣品處理量，含玻璃珠可達(dá)350ml。

樣品量可達(dá)80克

當(dāng)前第30頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)小型珠磨器特點(diǎn)：密閉容器可容納1至1.5ml的組織液或是一些細(xì)胞懸濁液，通過1至3分鐘的劇烈攪拌，能使細(xì)胞徹底的破裂，甚至一些骨頭、微生物的孢子通過玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。玻璃珠適用性：細(xì)菌用0.1mm的玻璃珠，酵母、藻類和組織培養(yǎng)細(xì)胞用0.5mm的玻璃珠，動(dòng)植物的組織用1mm的玻璃珠當(dāng)前第31頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)2、溫控與能耗采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫度控制提高破碎率，需要增加裝珠量、提高轉(zhuǎn)速和延長破碎當(dāng)前第32頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)3、高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣

高壓勻漿法操作參數(shù)少，易于確定，而且樣品損失量少，最少可處理20ml懸浮液；珠磨機(jī)操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)，并且珠子之間的液體損失使一次處理85ml懸浮液最終只能得到50ml左右的漿液。連續(xù)操作時(shí)，珠磨機(jī)兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性，而高壓勻漿器需配備換熱器進(jìn)行級間冷卻；其次珠磨法破碎效率高，當(dāng)前第33頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（三）超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)1、基本原理2、影響因素

3、實(shí)驗(yàn)室連續(xù)破碎池結(jié)構(gòu)示意圖

當(dāng)前第34頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)基本原理

超聲波破碎機(jī)由超聲波發(fā)生器和換能器組成。超聲波發(fā)生器將50Hz220V市電變成20KHz電能供給換能器。換能器隨之作縱向機(jī)械振動(dòng)。振動(dòng)波通過浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應(yīng)，激發(fā)介質(zhì)里的生物微粒劇烈振動(dòng)，引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎?？栈F(xiàn)象：是在強(qiáng)超聲波作用下，氣泡形成、長大和破碎的現(xiàn)象。當(dāng)前第35頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)影響超聲波破碎的因素

超聲波的聲強(qiáng)、頻率、溫度控制能力和破碎時(shí)間。細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度、pH和細(xì)胞種類等對破碎效果也產(chǎn)生影響。發(fā)射針的快速振動(dòng)會產(chǎn)生大量的熱，在使用中必須每間隔幾分鐘關(guān)掉發(fā)生器以消散熱量。超聲波破碎時(shí)細(xì)胞濃度一般在20％左右，高濃度和高黏度都會降低破碎速度。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活，噪聲令人難以忍受，而且大容量裝置的聲能傳遞、散熱均有困難。當(dāng)前第36頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)破碎池結(jié)構(gòu)示意圖

當(dāng)前第37頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（四）膠體磨-納米破碎機(jī)膠體磨的原理膠體磨基本參數(shù)當(dāng)前第38頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)膠體磨原理膠體磨的基本工作原理是剪切,研磨及高速攪拌作用。磨碎依靠兩個(gè)齒形面的相對運(yùn)動(dòng),其中一個(gè)高速旋轉(zhuǎn)另一個(gè)靜止,使通過齒面之間的物料受到極大的剪切力及磨擦力,同時(shí)又在高頻震動(dòng),調(diào)整旋渦等腰三角形復(fù)雜力的作用下使物料有效的分散、浮化、粉碎、均質(zhì)。當(dāng)前第39頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)膠體磨基本參數(shù)

型號L50L65L80L80FL100乳化細(xì)度(um)≥2

≥2≥2≥2調(diào)節(jié)范圍(mm)1-0.01

1-0.011-0.011-1.01產(chǎn)量(T/h)0.01-0.05

0.01-0.050.5-10.5-3電機(jī)功率(KW)1.11.53.04.05.5電壓(V)380

380380380轉(zhuǎn)速(r/min)29002900

29002900磨片直徑(mm)506580100出口直徑(寸)?5/8

?5/8?3/2

?3/2進(jìn)口直徑(寸)?5/4

?5/4

?2?5/2冷卻水管徑(寸)

?1/4

?1/4重量(kg)4050100200150當(dāng)前第40頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（五）撞擊破碎法

細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)(凍結(jié)速度為數(shù)千℃／min)，形成粒徑小于50μm的微粒子。高速載氣(如氮?dú)?，流速約300m／s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。

當(dāng)前第41頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)撞擊破碎的特點(diǎn)細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎程度均勻，可避免細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象。另外，細(xì)胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎，通常處理細(xì)胞懸浮液濃度為10％～20％。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50-500ml，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在10L／h以上。當(dāng)前第42頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（六）滲透壓沖擊破碎法

滲透壓沖擊破碎法是將細(xì)胞放在高滲透壓溶液中(如25％的蔗糖或甘油溶液)，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞收縮，此時(shí)快速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低滲緩沖液中(如水溶液)，由于滲透壓的突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂的細(xì)胞破碎技術(shù)。細(xì)菌、真菌類和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁強(qiáng)度較高，滲透壓沖擊破碎法很少用于此類細(xì)胞的破碎當(dāng)前第43頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)（七）低溫玻璃化破碎技術(shù)低溫玻璃化破碎技術(shù)是在低溫玻璃化保存過程中發(fā)生的低溫?cái)嗔鸦A(chǔ)上提出來