GBS核酸檢測(cè)課件

GBS核酸檢測(cè)1aGBS概述2aGBS概述

B族鏈球菌(GroupBStreptococcus,GBS)學(xué)名無(wú)乳鏈球菌，革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，正常寄居于陰道和直腸，屬于條件致病菌。在20世紀(jì)70年代，GBS已被證實(shí)為圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一，在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中占有不可忽視的地位。3a什么是圍產(chǎn)期……國(guó)外研究表明，不同地區(qū)、不同種族的妊娠晚期婦女GBS帶菌率約為6.5％～36.0％，國(guó)內(nèi)報(bào)道的妊娠婦女GBS帶菌率為3.5%～32.4％，新生兒體表帶菌率與母體帶菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量異常、多次妊娠以及性生活活躍的婦女中帶菌率較高。人群GBS帶菌率是指懷孕28周到產(chǎn)后一周這一分娩前后的重要時(shí)期圍產(chǎn)期保健是指產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)和產(chǎn)后的一段時(shí)間內(nèi)，對(duì)母親、胎兒和新生兒進(jìn)行一系列的保健工作，使母親健康和胎兒、新生兒的成長(zhǎng)發(fā)育得到很好的保護(hù)。4aGBS對(duì)孕婦的影響GBS感染是胎膜早破的重要發(fā)病因素GBS對(duì)絨毛膜有較強(qiáng)吸附能力和穿透能力，接種2小時(shí)內(nèi)即可吸附于母體組織，繼而侵入絨毛膜，通過(guò)炎癥細(xì)胞的吞噬作用及細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白水解酶的直接侵襲，使胎膜局部張力減低，從而導(dǎo)致胎膜早破。GBS生殖道感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要因素

GBS引起泌尿生殖道感染時(shí)，會(huì)引起磷脂酶A2和前列腺素及細(xì)胞因子的釋放，刺激子宮收縮導(dǎo)致早產(chǎn)。GBS是造成產(chǎn)褥感染的主要致病菌之一產(chǎn)褥感染是指分娩時(shí)及產(chǎn)褥期生殖道受病原體感染，引起局部和全身的炎性應(yīng)化。產(chǎn)褥感染發(fā)病率為1%～7.2%，是產(chǎn)婦死亡的原因之一。5aGBS對(duì)新生兒的影響GBS感染是新生兒感染的主要原因早發(fā)型感染多見(jiàn)于出生后1周內(nèi)。母嬰垂直傳播是其主要傳播途徑。主要臨床表現(xiàn)為敗血癥（80%）、肺炎（7%）、腦膜炎（6%）；若治療不及時(shí)，可引發(fā)遠(yuǎn)期后遺癥，如智力發(fā)育遲緩、視覺(jué)聽(tīng)覺(jué)喪失等。晚發(fā)型感染多發(fā)生于出生1周后。主要為水平傳播：可能與院內(nèi)感染或家庭接觸有關(guān)。常呈隱匿性發(fā)病，其特征表現(xiàn)為腦膜炎；1/3的晚發(fā)型疾病出現(xiàn)腦膜炎，故這些生存下來(lái)的新生兒中更易發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。6aGBS的傳播與感染感染GBS產(chǎn)婦

未傳染給新生兒30~60%傳染給新生兒40%~70%無(wú)癥狀97%早發(fā)性疾病：敗血癥，肺炎或腦膜炎1%~3%5%會(huì)導(dǎo)致死亡7a國(guó)內(nèi)外GBS篩查現(xiàn)狀美國(guó)疾病控制中心(CDC)制定了《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》該指南已經(jīng)獲得以下認(rèn)可：美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)院美國(guó)兒科學(xué)會(huì)美國(guó)護(hù)士助產(chǎn)士協(xié)會(huì)美國(guó)家庭醫(yī)生協(xié)會(huì)美國(guó)微生物學(xué)會(huì)美國(guó)流行病學(xué)會(huì)美國(guó)藥理學(xué)會(huì)在我國(guó)，2011年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組在《孕前和孕期保健指南(第1版)》中已將B族鏈球菌篩查作為一個(gè)備查項(xiàng)目。8a《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》指出對(duì)所有孕婦于妊娠35～37周進(jìn)行GBS篩查，結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行預(yù)防性治療以下情況應(yīng)進(jìn)行預(yù)防性治療：本次妊娠有GBS菌尿上次新生兒GBS感染史在妊娠37周之前分娩

破膜時(shí)間超過(guò)18小時(shí)

分娩體溫超過(guò)38.0度9aGBS的篩查與預(yù)防陽(yáng)性(+)或產(chǎn)時(shí)高危因素：早產(chǎn)，產(chǎn)時(shí)發(fā)熱≥38℃，胎膜早破≥18小時(shí)不需要抗生素預(yù)防孕35-37周取陰道和直腸拭子作GBS檢測(cè)陽(yáng)性(+)抗生素預(yù)防未檢測(cè)陰性(－)臨產(chǎn)后GBS檢測(cè)陰性(－)且無(wú)產(chǎn)時(shí)高危因素抗生素預(yù)防10a預(yù)防GBS疾病的抗生素使用方案舉例:《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》指出：

GBS陽(yáng)性患者應(yīng)用抗生素進(jìn)行預(yù)防性治療Boyer在1989年研究中指出，產(chǎn)時(shí)氨芐青霉素使用超過(guò)1小時(shí)就可以使得新生兒感染從28%減少到4%。LIN在2001年的研究中表明，與無(wú)產(chǎn)時(shí)應(yīng)用抗生素相比，抗生素預(yù)防超過(guò)2小時(shí)的有效率是89%，不足2小時(shí)的有效率為71%。挑戰(zhàn)：我媽媽會(huì)進(jìn)行IAP治療嗎？11a有無(wú)青霉素過(guò)敏否是青霉素G，首次劑量500萬(wàn)單位（靜脈注射）然后每4小時(shí)250?300萬(wàn)單位，直至分娩或者氨芐青霉素，首次劑量2g（靜脈注射），然后每4個(gè)小時(shí)1g，直到分娩病人在接受青霉素或頭孢菌素時(shí)有無(wú)出現(xiàn)下列任一癥狀？過(guò)敏癥、血管性水腫、呼吸窘迫、蕁麻疹否是頭孢唑啉，首次劑量2G，然后每8個(gè)小時(shí)1g，直到分娩紅霉素和克林霉素治療是否有效否是萬(wàn)古霉素每12小時(shí)1g（靜脈注射）直至分娩克林霉素每8小時(shí)900mg（靜脈注射）直至分娩《圍產(chǎn)期GBS預(yù)防指南》12aGBS檢測(cè)方法比較13aPCR介紹14a聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段；可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。

什么是PCR……

PCR原理PCR一般由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端→5′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

15aPCR原理變性，退火，延伸一次循環(huán)二次循環(huán)三次循環(huán)16aPCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系中的主要試劑有：

17aPCR擴(kuò)增儀PCR溫度循環(huán)至關(guān)重要，PCR擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確?，F(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷(xiāo)售PCR擴(kuò)增儀。國(guó)外廠家：Bio-Rad，ABI,Roche……

國(guó)內(nèi)廠家：杭州朗基，杭州博日……18aPCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)：引物與模板DNA特異正確結(jié)合，堿基配對(duì)原則，TaqDNA聚合酶忠實(shí)性擴(kuò)增靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=10-6）水平簡(jiǎn)便快速：一般在1～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)模板純度要求低：不需要分離病毒/細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板

19a1.每擴(kuò)增一條DNA鏈，就切斷一個(gè)探針2.每切斷一個(gè)探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位熒光信號(hào)3.熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)模板進(jìn)行分析的方法。

20aGBS核酸檢測(cè)產(chǎn)品21a熒光PCR檢測(cè)B族鏈球菌（GBS）

22aB族鏈球菌(GBS)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?23aTaqman探針實(shí)時(shí)PCR技術(shù)選擇B族鏈球菌基因組特異且無(wú)高頻SNP位點(diǎn)的序列區(qū)域cAMP因子，設(shè)計(jì)特異性引物和探針內(nèi)參照系統(tǒng)排除PCR反應(yīng)過(guò)程中可能的假陰性結(jié)果UNG酶避免擴(kuò)增污染物造成的假陽(yáng)性適用儀器：RocheLightCycler480，ABI7500，BioerLine-GeneK等多色熒光PCR儀產(chǎn)品特點(diǎn)24a規(guī)格：20人份/盒有效期：－18℃以下避光保存6個(gè)月試劑：DNA提取液、GBSPCR反應(yīng)液、GBS陽(yáng)性對(duì)照品，空白對(duì)照品標(biāo)本類(lèi)型：生殖道/直腸等部位帶上皮細(xì)胞的分泌物標(biāo)本試劑盒介紹25a

溶血樣本、保婦康栓、皮炎平對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響，應(yīng)盡量避免這些樣本的檢測(cè)。

其他常見(jiàn)干擾物質(zhì)（粘液和膿液）以及常用藥物（青霉素G、阿奇霉素、強(qiáng)力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、潔爾陰洗液、黃硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊、肛泰軟膏、開(kāi)塞露）均無(wú)明顯影響。待測(cè)樣本在2-8℃保存不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)；-18℃以下保存不超過(guò)4天。標(biāo)本要求標(biāo)本保存26a檢測(cè)流程（＜2h）35min5min1h10minPCR擴(kuò)增結(jié)果分析分裝GBSPCR反應(yīng)液加DNA模板PCR反應(yīng)體系配制PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析DNA提取

標(biāo)本GBS陽(yáng)性對(duì)照品空白對(duì)照品27aDNA提取1mL標(biāo)本沉淀+1mL生理鹽水沉淀+50μLDNA提取液99-100℃加熱10min取上清至1.5mL離心管中保存13,000rpm10min13,000rpm5min13,000rpm10min標(biāo)本，GBS陽(yáng)性對(duì)照品，空白對(duì)照品均需要提取DNA。28aPCR體系配制

40μL體系：35μLPCR反應(yīng)液+5μLDNA模板PCR擴(kuò)增程序：50℃2min95℃5min（95℃15s60℃35s）45cycles實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程FAM通道HEX通道29aFAM通道檢測(cè)結(jié)果：分析樣本，空白對(duì)照品：Ct值不顯示；陽(yáng)性對(duì)照品：Ct<30.00；HEX通道檢測(cè)結(jié)果：

分析內(nèi)參照基因，Ct≤35.00

陰性：樣品的FAM通道無(wú)Ct值顯示,HEX通道Ct≤35.00

陽(yáng)性：

樣品的FAM通道Ct≤38.00，HEX通道Ct≤35.00備注：若樣品的FAM通道38.00<Ct≤45.00，建議重新檢測(cè)該樣本，

若重檢結(jié)果仍為38.00<Ct≤45.00或Ct≤38.00，判定為陽(yáng)性；

若Ct不顯示且HEX通道Ct≤35.00，判定為陰性。結(jié)果有效性判定結(jié)果分析以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足30a產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)一靈敏度高：采用PCR方法檢測(cè)DNA，試劑與國(guó)際領(lǐng)先試劑性能相同特異性強(qiáng)：不與臨床常見(jiàn)其它各類(lèi)病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)穩(wěn)定性好：樣本DNA提取質(zhì)量高，陽(yáng)性對(duì)照品、空白對(duì)照品內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線高度吻合，試劑穩(wěn)定無(wú)污染：全封閉PCR體系，避免實(shí)驗(yàn)室其它PCR產(chǎn)物污染

易操作：操作簡(jiǎn)便，采用預(yù)制PCR反應(yīng)液，無(wú)需額外加入內(nèi)參照基因、酶等

速度