第7章動物細(xì)胞工程

內(nèi)容介紹一般概述相關(guān)概念細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備與操作要點（滅菌、營養(yǎng)、保存）動物細(xì)胞培養(yǎng)方法動物細(xì)胞工程應(yīng)用1當(dāng)前第1頁\共有107頁\編于星期五\21點第一節(jié)概述

動物細(xì)胞工程是以動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為主要手段，對動物細(xì)胞在離體條件下的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能進行研究，在此基礎(chǔ)上，采用工程技術(shù)手段對細(xì)胞的遺傳或生理特性進行改造，以獲得有價值的細(xì)胞產(chǎn)物、器官或個體的生物技術(shù)。2當(dāng)前第2頁\共有107頁\編于星期五\21點動物細(xì)胞工程主要包括：動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞雜交（融合）技術(shù)胚胎培養(yǎng)細(xì)胞核移植干細(xì)胞培養(yǎng)等。3當(dāng)前第3頁\共有107頁\編于星期五\21點一、體外培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展

19世紀(jì)后期，胚胎學(xué)的發(fā)展極為迅速，人們在研究胚胎學(xué)時，將一些活的組織放在體外進行觀察，從而拉開了培養(yǎng)技術(shù)的序幕。4當(dāng)前第4頁\共有107頁\編于星期五\21點1.早期組織培養(yǎng)1859年，法國解剖學(xué)家Vulpain將蛙尾組織在水中培養(yǎng)，觀察到了生長與分化現(xiàn)象。1885年，德國人Roux用溫生理鹽水在體外培養(yǎng)雞胚組織并使之存活了數(shù)天，被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的萌芽。他首次提出了組織培養(yǎng)的概念。1897年，Loeb首次在含有血凝塊的試管中培養(yǎng)兔的甲狀腺、卵巢、腎臟等，發(fā)現(xiàn)這些器官在3天內(nèi)仍保持正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。他的工作被認(rèn)為是器官培養(yǎng)的最早嘗試。5當(dāng)前第5頁\共有107頁\編于星期五\21點2.基本培養(yǎng)技術(shù)的建立1907年，實驗胚胎學(xué)家Harrison（哈里森）為了研究神經(jīng)突起的起源問題而進行了一項著名的實驗：在無菌條件下將蛙胚神經(jīng)組織接種在蛙的淋巴液中，放在一快蓋玻片上，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)并密封在一張凹玻片上，因而創(chuàng)建了蓋片懸滴培養(yǎng)法。

Harrison采用該方法將神經(jīng)組織培養(yǎng)了數(shù)周，并觀察到神經(jīng)突起的生長。這項工作標(biāo)志著體外培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立。

6當(dāng)前第6頁\共有107頁\編于星期五\21點1912年，外科醫(yī)生Carrel（卡勒爾）將外科手術(shù)的無菌操作觀念帶入體外培養(yǎng)技術(shù)，并連續(xù)培養(yǎng)雞胚心肌組織長達(dá)數(shù)年。無菌觀念已經(jīng)成為體外培養(yǎng)的最重要理念。

Carrel的第二個重要貢獻(xiàn)是將組織包埋技術(shù)、營養(yǎng)供應(yīng)和細(xì)胞傳代技術(shù)引入體外培養(yǎng)實驗，使Harrison的蓋片懸滴培養(yǎng)法更加完善。1923年，Carrel又設(shè)計出卡氏瓶培養(yǎng)法，進一步擴大了組織的培養(yǎng)空間，卡氏瓶已成為體外培養(yǎng)的重要器皿。7當(dāng)前第7頁\共有107頁\編于星期五\21點1925年，Maximow又把Harrison的懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng),因而極大地方便了培養(yǎng)液的更換，大大降低了污染的機會。雙蓋片培養(yǎng)在體外培養(yǎng)的歷史上發(fā)揮了重要作用，至今仍有不少學(xué)者采用這種方法。1926年，Strangewags設(shè)計了試管培養(yǎng)法，并改良了器官培養(yǎng)的營養(yǎng)供應(yīng)方式，開始以血漿和胚胎提取液混合物代替單純的血凝塊。8當(dāng)前第8頁\共有107頁\編于星期五\21點1933年，GoGey創(chuàng)立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法，并以此建立了許多細(xì)胞系。如來源于人的腫瘤組織的Hela細(xì)胞系。1949年，Polge等人發(fā)現(xiàn)甘油能夠用于保護低溫下儲藏的細(xì)胞。同年，Hanks等提出了Hanks平衡鹽溶液。9當(dāng)前第9頁\共有107頁\編于星期五\21點3.體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1950年，JFMorgan等人提出了199培養(yǎng)基。1951年P(guān)omerat設(shè)計出灌流小室，實現(xiàn)了培養(yǎng)液的不斷更新；1954年，Earle等建立了懸浮培養(yǎng)法。10當(dāng)前第10頁\共有107頁\編于星期五\21點1957年，Dulbecco采用胰蛋白酶消化法分離細(xì)胞，創(chuàng)造了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，以后的學(xué)者采用該方法建立了許多細(xì)胞系（cellline）。1959年，Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)冷凍保護劑——二甲基亞砜（DMSO）1960年，Baski觀察到兩種不同細(xì)胞混合培養(yǎng)所產(chǎn)生的細(xì)胞自發(fā)融合現(xiàn)象。11當(dāng)前第11頁\共有107頁\編于星期五\21點二、動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生長特性12當(dāng)前第12頁\共有107頁\編于星期五\21點

除單細(xì)胞原生動物外，細(xì)胞培養(yǎng)過程具有以下特性；

細(xì)胞生長緩慢，分裂周期長，一般12-48小時，而且易受環(huán)境因素的影響；如CHO（中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞）12.5小時，人胚肺成纖維細(xì)胞21小時；易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素；動物細(xì)胞較微生物大得多，無細(xì)胞壁，機械強度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；培養(yǎng)過程需氧量少，對攪拌攪拌或剪切力敏感；1.動物細(xì)胞培養(yǎng)特性13當(dāng)前第13頁\共有107頁\編于星期五\21點

在培養(yǎng)中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、功能全能性及接觸抑制性（有接觸抑制現(xiàn)象，即細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面生長到一定程度，相互緊密接觸時，細(xì)胞停止生長）：

對環(huán)境因素非常敏感。培養(yǎng)器皿的特性、培養(yǎng)液的溫度、pH值、溶氧濃度、營養(yǎng)成分及含量等均影響到細(xì)胞生長與分裂原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。14當(dāng)前第14頁\共有107頁\編于星期五\21點2、體外培養(yǎng)細(xì)胞生長方式

在活體內(nèi)，細(xì)胞的形態(tài)與其功能密切相關(guān)。如肌細(xì)胞呈纖維狀，便于收縮；神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出許多分支，便于形成網(wǎng)絡(luò)；紅細(xì)胞呈圓盤狀，便于氣體交換；上皮細(xì)胞呈不規(guī)則狀，便于覆蓋在器官表面相互擠壓。15當(dāng)前第15頁\共有107頁\編于星期五\21點在離體條件下，細(xì)胞一般表現(xiàn)為三種形態(tài)：（1）貼壁依賴型（anchorage-dependent)細(xì)胞；（2）非貼壁依賴型（anchorage-independent)細(xì)胞：也稱為懸浮型細(xì)胞，包括來源于血液的細(xì)胞和許多腫瘤細(xì)胞。（3）兼性貼壁細(xì)胞：主要是一些細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞。16當(dāng)前第16頁\共有107頁\編于星期五\21點貼壁依賴型細(xì)胞包括：（P87）1）成纖維細(xì)胞：細(xì)胞貼壁后呈梭形，細(xì)胞中央有圓形的核，胞質(zhì)向外伸出2-3個長短不一的突起，生長時細(xì)胞群呈放射狀。成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨胳細(xì)胞均具有這種特點；2）上皮型細(xì)胞：細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則三角形或柳葉形，細(xì)胞中央有圓形的核，生長時細(xì)胞緊密連接，長成單層片狀。如皮膚表皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等等均具有這種特點；3）游走型細(xì)胞：如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,分散生長，位置不固定，外形不規(guī)則等；4）多形型細(xì)胞：不常見，形態(tài)不規(guī)則，如神經(jīng)組織細(xì)胞。當(dāng)前第17頁\共有107頁\編于星期五\21點貼壁生長細(xì)胞的生長過程：游離期：細(xì)胞變圓吸附期：因細(xì)胞不同而有差異潛伏期：細(xì)胞不分裂繁殖期：細(xì)胞分裂增值停止、退化期：營養(yǎng)耗盡，產(chǎn)物積累，細(xì)胞停止分裂并開始退化18當(dāng)前第18頁\共有107頁\編于星期五\21點細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時游離期：吸附期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。

底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等19當(dāng)前第19頁\共有107頁\編于星期五\21點

血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）為何會貼壁？20當(dāng)前第20頁\共有107頁\編于星期五\21點細(xì)胞貼壁的過程：21當(dāng)前第21頁\共有107頁\編于星期五\21點對數(shù)生長繁殖期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，呈對數(shù)生長狀態(tài)，活力最佳，最適合進行實驗研究。潛伏期此時細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。22當(dāng)前第22頁\共有107頁\編于星期五\21點對數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contactinhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）23當(dāng)前第23頁\共有107頁\編于星期五\21點停止期（平臺期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性。退化期：代謝產(chǎn)物積累，PH下降，細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡。24當(dāng)前第24頁\共有107頁\編于星期五\21點25當(dāng)前第25頁\共有107頁\編于星期五\21點容易更換培養(yǎng)基；可采用灌注培養(yǎng)；方便產(chǎn)物表達(dá)；方便調(diào)節(jié)培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例；易于觀察等。細(xì)胞貼壁生長優(yōu)點（P104）:26當(dāng)前第26頁\共有107頁\編于星期五\21點3、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖1）、潛伏期（Latentphase）2）、指數(shù)生長期（Logarthmicgrowthphase）3）、停滯期（Stagnatephase）4）、死亡期27當(dāng)前第27頁\共有107頁\編于星期五\21點胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％，用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用胰蛋白酶消化液28當(dāng)前第28頁\共有107頁\編于星期五\21點第二節(jié)常見概念29當(dāng)前第29頁\共有107頁\編于星期五\21點一、原代培養(yǎng)與傳（繼）代培養(yǎng)1、原代培養(yǎng)（primaryculture):將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。30當(dāng)前第30頁\共有107頁\編于星期五\21點2、傳（繼）代培養(yǎng)（secondaryculture,passage,split):細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長。隨著細(xì)胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)。31當(dāng)前第31頁\共有107頁\編于星期五\21點小細(xì)節(jié)問題

當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。

當(dāng)前第32頁\共有107頁\編于星期五\21點二、細(xì)胞株與細(xì)胞系1、細(xì)胞株（cellstrain):原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了，細(xì)胞的生長就會出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。細(xì)胞株細(xì)胞的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變。33當(dāng)前第33頁\共有107頁\編于星期五\21點2、細(xì)胞系(cellline)：當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機”，不能再傳下去。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。34當(dāng)前第34頁\共有107頁\編于星期五\21點三、有限細(xì)胞系與無限細(xì)胞系1、有限細(xì)胞系（finitecellline）：指在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞只能在有限的時間存活，最后細(xì)胞逐漸死亡。有限細(xì)胞系的存活時間與細(xì)胞來源（年齡、物種）有關(guān)，一般幼齡動物的存活時間比較長。例如來源于胚胎的成纖維細(xì)胞可以培養(yǎng)50代，而取自成年動物的成纖維細(xì)胞一般不超過30代；雞胚成纖維細(xì)胞可以培養(yǎng)30代，而小鼠的則只能培養(yǎng)10代。研究表明細(xì)胞系的壽命與端粒和端粒酶有關(guān)。35當(dāng)前第35頁\共有107頁\編于星期五\21點2、無限細(xì)胞系(infinitecellline)：也稱為永久細(xì)胞系，理論上可以無限傳代，但實際上，每次傳代后細(xì)胞有一定變化（例如，發(fā)生染色體丟失），多次傳代后必須對細(xì)胞再次進行篩選和純化處理。36當(dāng)前第36頁\共有107頁\編于星期五\21點第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)37當(dāng)前第37頁\共有107頁\編于星期五\21點一、細(xì)胞體外生長的要求環(huán)境要求營養(yǎng)要求38當(dāng)前第38頁\共有107頁\編于星期五\21點1、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求溫度pH值氣體滲透壓思考：主要考慮哪些環(huán)境因素？39當(dāng)前第39頁\共有107頁\編于星期五\21點1）、溫度：不同來源的細(xì)胞，其培養(yǎng)的最適溫度不同。例如，昆蟲及魚類細(xì)胞25-28度，哺乳動物細(xì)胞一般為37度；細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強。

溫度除直接影響細(xì)胞生長外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。40當(dāng)前第40頁\共有107頁\編于星期五\21點CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。41當(dāng)前第41頁\共有107頁\編于星期五\21點2）、pH值：動物細(xì)胞培養(yǎng)最適pH值為，低于6.8或高于7.6均對細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；一般原代培養(yǎng)的細(xì)胞對pH值要求嚴(yán)格，細(xì)胞系對一定范圍的pH值改變有抵抗力。酚紅是常用的指示劑，用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。42當(dāng)前第42頁\共有107頁\編于星期五\21點3）、氣體：細(xì)胞在培養(yǎng)初期對溶氧要求較少，但在快速增殖（對數(shù)增長期或指數(shù)增長期）要求有較多的溶氧。4）、滲透壓：培養(yǎng)液的滲透壓一般保持在與體液相同的水平，對細(xì)胞較為適宜。例如，生理鹽水或平衡鹽溶液。43當(dāng)前第43頁\共有107頁\編于星期五\21點2、細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求動物細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液。分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。44當(dāng)前第44頁\共有107頁\編于星期五\21點1）、天然培養(yǎng)基：來自動物的體液或組織液，早期廣泛采用。例如：血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）等；優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，符合細(xì)胞生長的要求；缺點：成分不確定，來源復(fù)雜、有限，不能做到標(biāo)準(zhǔn)化，易發(fā)生支原體污染。45當(dāng)前第45頁\共有107頁\編于星期五\21點2）、合成培養(yǎng)基：根據(jù)動物的體液成份和細(xì)胞生長的需要，由各種營養(yǎng)物質(zhì)組合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。優(yōu)點：能夠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低；缺點：不能完全滿足細(xì)胞生長與增殖的需要。因此，在培養(yǎng)時，一般在培養(yǎng)液中加入一定量（10-15%）的血清，為細(xì)胞提供促貼壁因子或促生長因子。46當(dāng)前第46頁\共有107頁\編于星期五\21點人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清等）。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；⑤各種生長因子；⑥轉(zhuǎn)移蛋白；⑦其它不明成分。47當(dāng)前第47頁\共有107頁\編于星期五\21點一般說來．含2~5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清．血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞．48當(dāng)前第48頁\共有107頁\編于星期五\21點無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。49當(dāng)前第49頁\共有107頁\編于星期五\21點血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌50當(dāng)前第50頁\共有107頁\編于星期五\21點完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定淋可霉素：主要用于抑制支原體培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長51當(dāng)前第51頁\共有107頁\編于星期五\21點例：培養(yǎng)基的配制PMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌。調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度為10％）52當(dāng)前第52頁\共有107頁\編于星期五\21點3、細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。1、懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2、半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3、貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。53當(dāng)前第53頁\共有107頁\編于星期五\21點二、細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備實驗室的布局儀器設(shè)備的準(zhǔn)備實驗用品的準(zhǔn)備54當(dāng)前第54頁\共有107頁\編于星期五\21點超凈工作臺；細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：如CO2培養(yǎng)箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板等；其它：純水設(shè)備，干燥、消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備，冰箱等。1、儀器設(shè)備的準(zhǔn)備當(dāng)前第55頁\共有107頁\編于星期五\21點2)、血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實驗，如進行藥物和受體及營養(yǎng)等方面的研究時，需要使用無血清培養(yǎng)基。1)、培養(yǎng)液:

目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。2、實驗營養(yǎng)用品的準(zhǔn)備當(dāng)前第56頁\共有107頁\編于星期五\21點血清種類及來源：(1)胎牛血清(2)犢牛血清：犢牛出生后，不給吮乳，盡早由頸動脈無菌放血。(3)牛、馬、羊血清：通常由頸靜脈采取，或屠宰時由頸動脈放血采取。(4)其它血清：如兔血清和雞血清等，

57當(dāng)前第57頁\共有107頁\編于星期五\21點3)、平衡鹽溶液(BSS):

主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hank’s等。4)、抗生素:

常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。當(dāng)前第58頁\共有107頁\編于星期五\21點Hanks液

(1)原液甲：

NaCl160gKCl8gMgSO4·7H202gMgCl2·6H202g加水至800mlCaCl22.8g加水至100ml

將上述兩種溶液混合后，加水至1000m1，并加2m1氯仿作為防腐劑，保存于0～4℃冰箱內(nèi)。59當(dāng)前第59頁\共有107頁\編于星期五\21點(2)原液乙：

Na2HPO4·12H2O3.04gKH2PO：1.20g

葡萄糖20.0g

加水至1000ml，加2ml氯仿防腐，保存于0—4℃冰箱內(nèi)。按下述比例配成Hanks液：原液甲1份原液乙1份水18份

10磅15分鐘滅菌后，置0—4℃冰箱內(nèi)備用。使用時于100mlHanks液內(nèi)加入3.5％NaHCO3液，將pH調(diào)至。60當(dāng)前第60頁\共有107頁\編于星期五\21點5）、細(xì)胞消化液：能水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，起解離、分散細(xì)胞的作用。消化液種類：胰蛋白酶溶液：常用0.125％和0.25％EDTA溶液：非酶性解離，常用0.02％61當(dāng)前第61頁\共有107頁\編于星期五\21點6）、培養(yǎng)基pH調(diào)整液HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31；HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的。NaHCO3溶液，調(diào)整pH用。62當(dāng)前第62頁\共有107頁\編于星期五\21點6)、其它添加成分：有機補充物：如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子：如生長因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子：如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進行添加。63當(dāng)前第63頁\共有107頁\編于星期五\21點

解離常指組織、細(xì)胞的解離，在無菌情況下采取動物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺或無菌室內(nèi)進行解離處理。常用酶和鰲合劑進行解離作用。三、細(xì)胞的解離當(dāng)前第64頁\共有107頁\編于星期五\21點解離細(xì)胞的方法1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時間較短，主要缺點是破損細(xì)胞。2）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3）機械解離細(xì)胞法：比酶法所需時間短，但細(xì)胞存活率較低。4）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差當(dāng)前第65頁\共有107頁\編于星期五\21點第三節(jié)、細(xì)胞的培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)法(hanging-dropculture)蓋玻片培養(yǎng)法(coverslipculture)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法(flaskculture)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法(rotatetubeculture)培養(yǎng)板培養(yǎng)法(plateculture)灌流小室培養(yǎng)法(perfusedchamberculture)一、體外培養(yǎng)的基本方法66當(dāng)前第66頁\共有107頁\編于星期五\21點1、懸滴培養(yǎng)法將組織塊接種在一張包被有生長基質(zhì)的蓋玻片上，翻轉(zhuǎn)蓋玻片并置于凹玻片上，用熔蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。懸滴培養(yǎng)法包括單蓋片培養(yǎng)法與雙蓋片培養(yǎng)法優(yōu)點：便于觀察，培養(yǎng)液用量少；缺點：操作繁雜，空間小，培養(yǎng)環(huán)境難控制。Levi-Montalcini（1956）采用雙蓋片懸滴培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)生長因子并榮獲Nobel獎。67當(dāng)前第67頁\共有107頁\編于星期五\21點2、蓋玻片培養(yǎng)法以蓋玻片為生長表面，將組織塊接種蓋玻片上，然后一起放入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。優(yōu)點：便于觀察和染色處理；缺點：表面積小，僅適合短時間培養(yǎng)。68當(dāng)前第68頁\共有107頁\編于星期五\21點3、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法將組織塊或細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。玻璃培養(yǎng)瓶與塑料培養(yǎng)瓶（卡氏瓶）培養(yǎng)瓶的規(guī)格：底面積（25、100cm2）膠塞封口與螺口瓶（帶通氣膜）優(yōu)點：極大地減少了污染機會，培養(yǎng)空間大，換液方便，便于觀察；缺點：成本較高。69當(dāng)前第69頁\共有107頁\編于星期五\21點4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法將組織細(xì)胞接種在培養(yǎng)管內(nèi)，置于可旋轉(zhuǎn)的支架（旋轉(zhuǎn)鼓）上，邊旋轉(zhuǎn)邊培養(yǎng)。優(yōu)點：培養(yǎng)液均一性好，有利于細(xì)胞生長與物質(zhì)交換；缺點：培養(yǎng)管的球面不利于觀察。70當(dāng)前第70頁\共有107頁\編于星期五\21點5、培養(yǎng)板培養(yǎng)法將組織細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。是現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)中最常用的方法。培養(yǎng)板規(guī)格：2孔、4孔、6孔、24孔、48孔、96孔等；優(yōu)點：可進行微量培養(yǎng)、使培養(yǎng)容積標(biāo)準(zhǔn)化、可進行組間比較；缺點：成本較高。71當(dāng)前第71頁\共有107頁\編于星期五\21點6、灌流小室培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在一個由上、下兩張蓋玻片和一個用金屬圈密封圍成的小室內(nèi)，然后將整個小室保持在恒溫下，使細(xì)胞在蓋玻片上生長。在小室的側(cè)壁分別有液體流入和排出的開口，新鮮培養(yǎng)液不斷地灌注進小室，舊的培養(yǎng)液則不斷流出小室。優(yōu)點：能保持培養(yǎng)液的不斷更新，有利于細(xì)胞生長與物質(zhì)交換，有利于獲得高濃度的產(chǎn)物；缺點：操作繁瑣、難度較高。72當(dāng)前第72頁\共有107頁\編于星期五\21點73當(dāng)前第73頁\共有107頁\編于星期五\21點二、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞培養(yǎng)中，幼齡組織優(yōu)于老齡組織，分化程度低的優(yōu)于分化程度高的，但均從原代培養(yǎng)開始。原代培養(yǎng)方法：

組織塊培養(yǎng)法和組織消化培養(yǎng)

A組織塊培養(yǎng)法：采取動物的組織或器官，剪碎組織，平衡鹽溶液(BSS)沖洗，低速離心，然后洗滌接入培養(yǎng)瓶。74當(dāng)前第74頁\共有107頁\編于星期五\21點B組織消化培養(yǎng)：75當(dāng)前第75頁\共有107頁\編于星期五\21點原代細(xì)胞培養(yǎng)：雞胚原代細(xì)胞：在無菌條件下采取9－10日齡雞胚↓除去頭(或僅除去喙和眼)、爪和內(nèi)臟，并剪成塊↓用Hanks液等充分沖洗↓剪將其剪成lmm大小的碎塊↓加入Hanks液或其他洗液，充分沖洗↓約4倍量的0.25％胰酶，并調(diào)整pH至7.6－7.8↓37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次↓吸棄上層胰酶溶液↓用洗液輕洗2次后↓吸管充分吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液↓準(zhǔn)備細(xì)胞計數(shù)↓單層細(xì)胞培養(yǎng)76當(dāng)前第76頁\共有107頁\編于星期五\21點傳代培養(yǎng)技術(shù)傳代操作過程：吸出舊培養(yǎng)液；加入酶解液，消化至細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)回縮為止；吸出消化液，用洗液洗；加入培養(yǎng)液，吸管輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液；重新接種培養(yǎng)。77當(dāng)前第77頁\共有107頁\編于星期五\21點三、現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)與生物反應(yīng)器78當(dāng)前第78頁\共有107頁\編于星期五\21點1、單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單層細(xì)胞培養(yǎng)主要針對大多數(shù)動物細(xì)胞需要附著于帶正電荷的固體或半固體表面的特性，適用于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及一些細(xì)胞系的培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁過程79當(dāng)前第79頁\共有107頁\編于星期五\21點單層細(xì)胞培養(yǎng)也稱為貼壁培養(yǎng)（attachmentculture)，這類細(xì)胞被稱為錨著依賴性細(xì)胞(anchorage-dependentcell)。貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液、容易采用灌注培養(yǎng)以提高細(xì)胞密度、采用生長基質(zhì)方便。貼壁培養(yǎng)的缺點：占表面積大，放大困難；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長；難以達(dá)到培養(yǎng)環(huán)境均一化。貼壁培養(yǎng)的表面特性：帶正電荷、有高度表面活性、親水性。主要材料有玻璃、塑料（聚苯乙烯）、金屬（不銹鋼、鈦）、天然高分子材料（如葡聚糖）等。80當(dāng)前第80頁\共有107頁\編于星期五\21點2、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)（suspensionculture)是指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長的培養(yǎng)方式。適用于一些來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞以及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上建立起來的，但由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不能耐受劇烈攪拌和通氣時產(chǎn)生的剪切力，因而又與經(jīng)典的發(fā)酵不同。81當(dāng)前第81頁\共有107頁\編于星期五\21點3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)固定化細(xì)胞培養(yǎng)（immobilizationculture)是指采用吸附（固體吸附劑）、共價貼附（與固相載體結(jié)合）、共價交連（用試劑處理形成細(xì)胞絮結(jié)）、包埋（將細(xì)胞包埋在多孔材料內(nèi)）等方法將細(xì)胞固定在支持物上，或形成細(xì)胞絮結(jié)，或?qū)⒓?xì)胞嵌入微囊或高分子聚合物的網(wǎng)絡(luò)中進行培養(yǎng)。該方法對貼壁依賴性細(xì)胞與非貼壁依賴性細(xì)胞均適用。

82當(dāng)前第82頁\共有107頁\編于星期五\21點4、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnique)是指在動物細(xì)胞生物反應(yīng)器中大量地培養(yǎng)動物細(xì)胞以獲得生物制品的技術(shù)。主要包括：微載體（microcarrier)培養(yǎng)技術(shù)中空纖維(hollowfiber)培養(yǎng)技術(shù)微囊化(micro-encapsulation)技術(shù)

83當(dāng)前第83頁\共有107頁\編于星期五\21點（1）微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體是指直徑在60-250μm的微珠、能夠適用于貼壁細(xì)胞生長，細(xì)胞貼壁于微載體上，微載體(和細(xì)胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長成單層。優(yōu)點：是表面積與體積比大、可攪拌、便于顯微觀察、占用空間小、易放大；具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點；缺點：是培養(yǎng)液用量大。玻璃微珠84當(dāng)前第84頁\共有107頁\編于星期五\21點微載體的主要特性微載體的大?。和ǔＶ睆皆?00-200微米之間。微載體的密度：在慢速（40-50rpm)攪拌下，一般為1.03-1.05g/cm3微載體的表面電荷：表面電荷密度應(yīng)適中，太低不利于細(xì)胞貼附；太高則有細(xì)胞毒性。85當(dāng)前第85頁\共有107頁\編于星期五\21點微載體的種類以交連葡聚糖為基質(zhì)的微載體：DEAE-交連葡聚糖微載體、cytodex2微載體、dormacell微載體、cytodex3微載體等。以塑料為基質(zhì)的微載體：聚苯乙烯微載體、聚苯烯酰胺微載體。明膠(gelatin)微載體以玻璃為基質(zhì)的微載體以纖維素為基質(zhì)的微載體（DE-52、DE-53）液膜微載體（形成聚賴氨酸微液珠）大孔微載體（載體內(nèi)部有大孔互相連通）86當(dāng)前第86頁\共有107頁\編于星期五\21點（2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù)中空纖維培養(yǎng)技術(shù)由Knazek于1972年研制成功。空心纖維的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物質(zhì)。纖維壁為半透膜。數(shù)百或數(shù)千條纖維捆成一束并集中開口，培養(yǎng)液從管腔流過，細(xì)胞貼附在纖維外壁生長。87當(dāng)前第87頁\共有107頁\編于星期五\21點（3）微囊化技術(shù)微囊化培養(yǎng)由Lim等于1981年提出，其原理是采用一層親水性的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊內(nèi)，因而降低了培養(yǎng)液對細(xì)胞的剪切力，培養(yǎng)密度高。目前采用最多的是多聚賴氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通過氯化鈣成囊，再用檸檬酸液化。缺點：成囊技術(shù)較難，成功率約50%。88當(dāng)前第88頁\共有107頁\編于星期五\21點（4）動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器（Bioreactor)氣升式生物反應(yīng)器；攪拌式生物反應(yīng)器；中空纖維管式生物反應(yīng)器；流化床式生物反應(yīng)器；固定床式生物反應(yīng)器。

氣升式生物反應(yīng)器89當(dāng)前第89頁\共有107頁\編于星期五\21點流化床式生物反應(yīng)器90當(dāng)前第90頁\共有107頁\編于星期五\21點第四節(jié)、培養(yǎng)細(xì)胞的污染問題及檢測

細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。當(dāng)前第91頁\共有107頁\編于星期五\21點一、細(xì)胞污染的種類和判定

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：1、培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。2、培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。3、光鏡觀察到菌絲和顆粒。4、細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。當(dāng)前第92頁\共有107頁\編于星期五\21點二、污染物的檢測

1、細(xì)菌和真菌污染的檢測：

1）涂片染色鏡檢；

2）接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養(yǎng)肉湯適于檢測真菌。檢測到陽性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具。當(dāng)前第93頁\共有107頁\編于星期五\21點2、支原體檢測:

支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。94當(dāng)前第94頁\共有107頁\編于星期五\21點支原體檢測方法和處理

1）熒光技術(shù)檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交：

檢測完畢后，所有實驗用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。當(dāng)前第95頁\共有107頁\編于星期五\21點5）污染支原體后的處理：

抗生素處理：如加入泰樂菌素等。

共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。

重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含