第七章生物信息學與生物芯片技術詳解

第七章生物信息學與生物芯片技術詳解演示文稿1當前第1頁\共有44頁\編于星期五\21點優(yōu)選第七章生物信息學與生物芯片技術2當前第2頁\共有44頁\編于星期五\21點生物芯片技術是20世紀90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。3當前第3頁\共有44頁\編于星期五\21點

1995年秋天，在斯坦福大學做博士后的MarkSchena(M.謝納）等人在Science雜志上發(fā)表論文，第一次成功地應用了基因芯片技術對擬南芥的基因表達進行了分析。標志著基因芯片進入了廣泛應用的新階段。MarkSchena,DariShalon,RonaldW.Davis,andPatrickO.Brown.QuantitativeMonitoringofGeneExpressionPatternswithaComplementaryDNAMicroarray.Science,

1995:467-470.4當前第4頁\共有44頁\編于星期五\21點生物芯片:是將生物分子(寡聚核苷酸、cDNA、基因組DNA、多肽、抗原、抗體等)固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點陣。生物芯片技術是生命科學研究中繼基因克隆技術、基因自動測序技術、PCR技術后的又一次革命性技術突破。5當前第5頁\共有44頁\編于星期五\21點生物芯片基因芯片蛋白質(zhì)芯片生物芯片的特點：1）高度集成2）微型化3）自動化4）快速6當前第6頁\共有44頁\編于星期五\21點§7.1基因芯片原理與應用7當前第7頁\共有44頁\編于星期五\21點一、基因芯片基本原理基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息。基因芯片把大量已知序列探針集成在同一個基片上，經(jīng)過標記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交,便可根據(jù)堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。8當前第8頁\共有44頁\編于星期五\21點DNA微陣列（microarray）9當前第9頁\共有44頁\編于星期五\21點10當前第10頁\共有44頁\編于星期五\21點Affymetrix公司（昂飛）由美國著名科學家斯蒂文?弗爾多博士(StephenFodor)在1992年創(chuàng)辦,總部位于美國加利福尼亞州硅谷。公司于1996年在美國納斯達克(NASDAQ)上市。公司在加州首府Sacramento、Emeryville、波士頓、英國倫敦、日本東京、新加坡都設有分部。昂飛是生物芯片產(chǎn)業(yè)的先驅(qū)，公司長期與美國國立衛(wèi)生研究院、斯坦福大學、麻省理工、哈佛、耶魯、加州大學伯克利等世界知名院校和研究所合作,在生物芯片行業(yè)中始終處于國際領先地位。美國昂飛公司11當前第11頁\共有44頁\編于星期五\21點12當前第12頁\共有44頁\編于星期五\21點博奧生物中國最好的芯片公司13當前第13頁\共有44頁\編于星期五\21點mRNA表達譜芯片服務內(nèi)容：39個物種14當前第14頁\共有44頁\編于星期五\21點上海伯豪生物

15當前第15頁\共有44頁\編于星期五\21點（一）基因芯片設計提出基因芯片要解決的問題，確定研究目標。根據(jù)所選擇的基因序列，設計探針陣列，確定每個探針以及探針在芯片上的排列。二、基因芯片工作基本步驟

16當前第16頁\共有44頁\編于星期五\21點根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長的DNA探針（100mer）芯片這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點樣方法將探針固定在芯片上，主要用于mRNA的表達分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長度為25mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于mRNA的表達監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。17當前第17頁\共有44頁\編于星期五\21點根據(jù)探針標記方法，基因芯片也可分為兩類1）同位素標記探針

32P、33P2）非同位素標記探針生物素、地高辛18當前第18頁\共有44頁\編于星期五\21點一是在片合成法在片合成法是基于組合化學的合成原理。在片合成法制備DNA芯片的關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和固相合成化學技術的精巧結(jié)合。另一種方法是點樣法

首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭或微噴頭,分別把不同的探針溶液，逐點分配在固相基底表面上的不同位點,并通過物理或化學的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應位點。（二）基因芯片的制備（主要有兩種基本方法）19當前第19頁\共有44頁\編于星期五\21點（三）樣品制備及芯片雜交根據(jù)基因芯片的檢測目的不同,可以把樣品制備方法分為：1）用于表達譜測量的mRNA樣品制備2）用于多態(tài)性(或突變)研究的基因樣品的制備20當前第20頁\共有44頁\編于星期五\21點雜交：檢測過程平行化，可以同時檢測成百上千的基因序列，而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及待檢測樣品均大為減少，雜交時間明顯縮短，一般的分子雜交過程可在30分鐘內(nèi)完成。常規(guī)：1）雜交時間長4-24h2）樣品處理數(shù)量少（1-幾個）21當前第21頁\共有44頁\編于星期五\21點（四）雜交信號檢測對于用熒光素標記經(jīng)擴增（也可用其他放大技術）的序列或樣品，與芯片上的探針進行雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。圖像的采集用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、激光掃描儀、半導體傳感器等進行。22當前第22頁\共有44頁\編于星期五\21點三、生物信息學在基因芯片中的應用生物信息學在基因芯片中的應用主要體現(xiàn)在三個方面:確定芯片檢測目標芯片設計實驗數(shù)據(jù)管理與分析23當前第23頁\共有44頁\編于星期五\21點（一）藥物篩選和新藥開發(fā)由于所有藥物（或獸藥）都是直接或間接地通過修飾、改變?nèi)祟悾ɑ蛳嚓P動物）基因的表達及表達產(chǎn)物的功能而生效，而芯片技術具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達的能力，在藥物篩選方面具有巨大的優(yōu)勢。用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動物試驗甚至臨床，縮短藥物篩選所用時間，提高效率，降低風險。四、基因芯片的應用24當前第24頁\共有44頁\編于星期五\21點（二）疾病診斷基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通量檢測技術，應用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種疾病。采用基因芯片技術，疾病的早期診斷率將大大提高，而誤診率會大大降低，同時有利于醫(yī)生綜合地了解各個系統(tǒng)的疾病狀況。25當前第25頁\共有44頁\編于星期五\21點（三）環(huán)境保護在環(huán)境保護上，基因芯片也廣泛的用途，一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。（四）司法如果建立全國甚至全世界的DNA指紋庫，可直接在犯罪現(xiàn)場對疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進行分析，并與DNA指紋庫系統(tǒng)進行比較，以快速、準確地破案。目前，科學家正著手于將生物芯片技術應用于親子鑒定中，應用生物芯片后，鑒定精度將大幅提高。26當前第26頁\共有44頁\編于星期五\21點基因芯片技術可以用來篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關基因，也可以用于基因掃描及基因文庫作圖、商品檢驗檢疫等領域。目前該類市場尚待開發(fā)。（五）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)27當前第27頁\共有44頁\編于星期五\21點（六）研究領域一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA1測定未知序列28當前第28頁\共有44頁\編于星期五\21點2DNA序列突變檢測分析有兩種方法可以進行已知突變點的分析:一種方法是對于目標序列上已知的突變點，以該點為中心，從目標序列選取一個片段，作為設計探針的參考序列。根據(jù)參考序列，分別設計四個高度特異的探針，這四個探針除中心位置外均相同并與參考序列互補。另一種方法是對于目標序列上已知的突變點，分別設計四組探針，其中每一組探針分別檢測一種核苷酸替換。同一組中的各個探針長度相同，相互之間交疊，并且每個探針均覆蓋對應的突變點。29當前第29頁\共有44頁\編于星期五\21點30當前第30頁\共有44頁\編于星期五\21點3SNP分析同一物種的不同個體基因組約有99.9％相同，正是0.1％的不同才體現(xiàn)了個體的差異或多樣性。單核苷酸多態(tài)性（SNP)：是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最小一種在群體中的頻率不小于1％。人-3％0.1％序列變化—1％---改變蛋白質(zhì)功能—900個基因產(chǎn)物不同。與生物進化歷程、種族關系、疾病發(fā)生相關。31當前第31頁\共有44頁\編于星期五\21點4、基因表達分析基因表達是以基因的DNA為模板進行mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯合成的過程，各種基因的表達存在差異，一種組織中不同基因表達水平的差異可達1萬倍。功能基因研究的一種重要的方法就是采用高通量基因表達檢測技術，全面分析基因的表達水平，了解基因的功能。32當前第32頁\共有44頁\編于星期五\21點33當前第33頁\共有44頁\編于星期五\21點5、尋找新基因在缺乏任何序列信息的條件下，基因芯片也可用于基因發(fā)現(xiàn)。如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子就是通過基因芯片技術發(fā)現(xiàn)的。目前，大量涌現(xiàn)的人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的序列資源，數(shù)據(jù)庫中ESTs代表了人類基因，因此ESTs微陣列可在缺乏其它序列信息的條件下用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達檢測，從而加快人類基因組功能分析的進程。

34當前第34頁\共有44頁\編于星期五\21點§7.2蛋白質(zhì)芯片原理與應用35當前第35頁\共有44頁\編于星期五\21點蛋白質(zhì)芯片的提出DNA芯片的成功證明了生物芯片是可行的

DNA芯片對醫(yī)學與生物學研究產(chǎn)生了巨大影響

DNA芯片成為研究活體基因組的強有力工具DNA芯片不能作為蛋白質(zhì)檢測的直接依據(jù)

mRNA與蛋白質(zhì)表達水平不直接相關蛋白質(zhì)組計劃需要一種新的蛋白質(zhì)分析技術36當前第36頁\共有44頁\編于星期五\21點盡管還存在許多問題,2000年秋天,Schreiber小組展示了他們可以制造高密度蛋白質(zhì)芯片并且保持蛋白質(zhì)成鍵能力的技術。

37當前第37頁\共有44頁\編于星期五\21點蛋白芯片技術的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片；然后，用標記了特定熒光抗體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結(jié)合的成分洗去；再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關系，由此達到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。一、蛋白質(zhì)芯片基本原理蛋白質(zhì)固定（探針）雜交掃描成像或進行質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)功能鑒定38當前第38頁\共有44頁\編于星期五\21點39當前第39頁\共有44頁\編于星期五\21點1）保持蛋白質(zhì)的活性。2）保證蛋白質(zhì)正確定位。3）與現(xiàn)存的mRNA芯片研究工具要相兼容。4）缺乏與PCR等價的蛋白質(zhì)擴增技術，因而對低豐度蛋白質(zhì)的檢測是蛋白質(zhì)芯片技術的極大挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)芯片要解決的問題：40當前第40頁\共有44頁\編于星期五\21點蛋白質(zhì)活性保持在制備芯片過程中,為了保證被固定在載體上的蛋白質(zhì)依然保持天然的構(gòu)象和生物學活性,他們在蛋白質(zhì)點樣的磷酸緩沖液（PBS)中加入40%的甘油,以防止因液體的蒸發(fā)而造成的蛋白質(zhì)變性。41當前第41頁\共有44頁\編于星期五\21點彈性蛋白模擬物亮氨酸鏈蛋白質(zhì)固定化學表面型蛋白質(zhì)芯片和生物表面型蛋白質(zhì)芯片?；瘜W表面芯片又可分為疏水型、親水型、弱陽離子、強陰離子、金屬離子螯合、特異結(jié)合等，以適用檢測不同情況下蛋白表達。生物表面芯片人又可分為抗原-抗體、受體-配體、DNA－蛋白質(zhì)、酶等芯片。42當前第42頁\共有44頁\編于星期五\21點二、蛋白質(zhì)