紫外可見光譜分析

紫外可見光譜分析第一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第三章紫外—可見吸收光譜分析(分子)

第一節(jié)概述:

第二節(jié)紫外－可見吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

第三節(jié)紫外－可見分光光度計的基本組成與結(jié)構(gòu)

第四節(jié)紫外－可見分光光度計的性能

第五節(jié)紫外－可見吸收光譜法的應(yīng)用第二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一紫外～可見吸收光譜分析，簡稱UV-VIS。

利用分光光度計測量物質(zhì)對紫外～可見光的吸光度和通過物質(zhì)的紫外～可見吸收光譜來確定物質(zhì)的組成、含量，推斷物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析方法，稱紫外～可見吸收光譜分析，又稱為紫外～可見分光光度法。第一節(jié)概述:第三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

1、靈敏度較高，一般可測定10-6g級的物質(zhì)，摩爾吸光系數(shù)可達104～105數(shù)量級。

2、準確度比較高，相對分析誤差可控制在1％～5％以內(nèi)。

3、方法簡便、操作容易、分析速度較快。

4、應(yīng)用廣泛，在無機化合物分析、有機化合物的鑒定和結(jié)構(gòu)分析、同分異構(gòu)體的鑒別、配合物的組成和穩(wěn)定常數(shù)的測定等方面都有應(yīng)用。

5、缺點：許多有機化合物在紫外可見光區(qū)沒有吸收光譜或光譜較為簡單，無法通過光譜了解其結(jié)構(gòu)。紫外－可見吸收光譜分析一、特點：第四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

紫外區(qū)：為石英紫外區(qū)，是指可以通過石英(SiO2)、且不為氧所吸收的200～420nm譜區(qū)；

可見光區(qū)：波長范圍約為420～760nm。二、紫外—可見吸收光譜分析譜區(qū)：普通紫外可見分光光度計（UV-VIS）的波長范圍為：200～800nm，光子的能量范圍是6.2～1.55eV。紫外－可見吸收光譜分析第五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)紫外－可見吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、能級躍遷與分子光譜信息一、分子外層電子的分子軌道與能級第六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一原子形成分子時，原子中兩個能量相近的外層電子之間組成化學(xué)鍵。

原子外層電子最多可有8個電子，分布在四個原子軌道上：一個S軌道，電子云的分布呈球形；三個P軌道，電子云的分布呈互相垂直的啞鈴形(Px、Py、Pz)。分子軌道與能級一、分子外層電子的分子軌道與能級第七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

原子通過化學(xué)鍵組成分子后，形成分子軌道的兩個原子的電子軌道的可能有：S-S、S-Px、Px-Px、Py-Py,、Pz-Pz

。前三種軌道電子云形狀對于鍵軸具有圓柱對稱性，稱為σ分子軌道；后兩種對于通過鍵軸的平面具有反對稱性，稱為π分子軌道。

因此分子軌道可以分為四種，即σ成鍵與反鍵軌道，π成鍵與反鍵軌道，它們分別用σ,σ*,π,π*表示。分子軌道與能級第八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

有的原子在組成分子時，其外層還有沒參與形成鍵的孤對電子，被束縛在原來的原子核周圍，這個嵌在分子內(nèi)的原子軌道保持原來的能量狀態(tài)，稱之為非鍵軌道，常用n表示。

分子軌道與能級第九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一五種分子軌道所對應(yīng)的能級示意能量π*反鍵軌道σ*反鍵軌道n非成鍵軌道π成鍵軌道σ成鍵軌道高低分子軌道與能級第十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

分子中外層電子的能級結(jié)構(gòu)由五種分子軌道所對應(yīng)的能級組成，能量由低到高排列次序為σ<π<n<π*<σ*。電子傾向于優(yōu)先排在能量較低的成鍵軌道上。

基態(tài)分子的外層電子主要是σ、π、n軌道的電子，這些軌道通常是排滿的；分子的空軌道是π*、σ*軌道。

一般有機分子中常同時包含幾種分子軌道，例如在甲醛分子H2C=O中，C-H鍵是σ鍵，C=O基團中的雙鍵分別為σ鍵與π鍵；氧原子上還有n鍵分子軌道。分子軌道與能級第十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一二、能級躍遷與分子光譜信息（一）、分子中軌道躍遷與光譜特點

1、σ→σ*躍遷：主要為有機分子中的C—C鍵與C—H鍵電子(單鍵)。躍遷的能量間距較大，產(chǎn)生躍遷需要的激發(fā)光波長在真空紫外區(qū)，約150nm左右，普通的紫外可見光譜分析不能利用。

可利用飽和烴類化合物的這一特性，做紫外可見光吸收光譜分析的溶劑，如正己烷、正庚烷等。第十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

2、π→π*躍遷：主要是有機分子中的C=C，C=O，C≡C等雙鍵、三鍵電子。躍遷的能量間距約6電子伏特左右，產(chǎn)生這類躍遷需要吸收光子的波長在真空紫外區(qū)與石英紫外區(qū)之間，約200nm左右，可被普通的紫外可見光譜分析利用。產(chǎn)生這類躍遷的幾率較高，其摩爾吸光系數(shù)約104。有共軛體系的大π鍵與反鍵之間的能量差降低，使吸收峰波長向長波方向移動，可在200-700nm的紫外可見光區(qū)。分子軌道與能級第十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

3、n→σ*躍遷：主要是含有O、N、P等雜原子的有機分子。這些雜原子中的孤對電子在非成鍵分子軌道n上，n與σ*分子軌道的能量間距也約6電子伏特，因此產(chǎn)生這種躍遷需要吸收的光子與π→π*躍遷相似，但發(fā)生這類躍遷的幾率較低，其摩爾吸光系數(shù)約102~103

。分子軌道與能級第十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

4、n→π*躍遷：主要是既含有C=C雙鍵，又含有C＝O、C=S、N=O、N=N等雜原子的有機分子，由于n與π*這兩種分子軌道的能量間距較小，因此，產(chǎn)生這種躍遷需要吸收的光子在石英紫外區(qū)，其波長范圍較寬，能被普通的紫外可見光譜分析所利用。這類躍遷的幾率更低，其摩爾吸光系數(shù)約101~102。

分子軌道與能級第十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

1、生色團：含有不飽和鍵，能吸收紫外可見光產(chǎn)生π→π*或n→π*躍遷的基團稱為生色團或發(fā)色團。如：C=C、C≡C、C=O、C=N、N=N、—COOH等。

2、助色團：含有未成鍵n電子，本身不產(chǎn)生吸收峰、但與發(fā)色團相連，能使發(fā)色團吸收峰向長波方向移動，吸收強度增加的雜原子基團稱為助色團，如：－NH2，－OH，－OR，－SR，－X等。

3、吸收帶：在紫外可見光光譜中，吸收峰的波帶位置稱為吸收帶。

分子軌道與能級（二）、生色團、助色團和吸收帶第十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

①R吸收帶

②K吸收帶

③B吸收帶

④E吸收帶分子軌道與能級吸收帶通常劃分為如下四種：3、吸收帶：在紫外可見光光譜中，吸收峰的波帶位置稱為吸收帶。第十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

①R吸收帶：由n→π*

躍遷產(chǎn)生。吸收強度較弱k<102，吸收峰位于200～400nm。

②K吸收帶：由共軛雙鍵中π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶。吸收強度大k>104；所需的能量大，在217～280nm。K吸收帶的波長位置及吸收強度與共軛體系數(shù)目、位置、取代基的種類有關(guān)。吸收波長隨共軛體系的加長而向長波方向移動，吸收強度也隨之增加?？捎糜谂袛嗷衔锏墓曹椊Y(jié)構(gòu)。吸收帶第十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

③B吸收帶：由芳香族化合物的π→π*躍遷而產(chǎn)生的精細結(jié)構(gòu)吸收。吸收峰在230～270nm之間，k≈102。當(dāng)苯環(huán)上有取代基且與苯環(huán)共軛，或在極性溶劑中測定時，這些精細結(jié)構(gòu)會簡化或消失。

④E吸收帶：由芳香族化合物的π→π*躍遷所產(chǎn)生，是芳香族化合物的特征吸收，可分為E1帶和E2帶。E1帶出現(xiàn)在185nm處、強吸收k>104；E2帶出現(xiàn)在204nm，為較強吸收k>103。

當(dāng)苯環(huán)上有發(fā)色團且與苯環(huán)共軛時，E帶與K帶合并向長波方向移動，B吸收帶的精細結(jié)構(gòu)簡化，吸收強度增加、向長波方向移動。吸收帶第十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一紫外－可見吸收光譜主要取決于分子中電子軌道的能級躍遷，但分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部環(huán)境也會對其產(chǎn)生影響。（三）、影響紫外－可見吸收光譜的因素1、共軛效應(yīng)2、助色效應(yīng)3、超共軛效應(yīng)4、溶劑的影響影響因素：第二十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一吸收光譜影響因素

1、共軛效應(yīng)：使共軛體系形成大π鍵，可使各能級間的能量差減小，躍遷也變的容易。因此共軛效應(yīng)使吸收波長向長波方向移動，吸收強度也隨之加強。隨著共軛體系的加長，吸收峰的波長和吸收強度會呈現(xiàn)規(guī)律性的改變。

2、助色效應(yīng)：使助色團的n電子于發(fā)色團的π電子共軛，也可使吸收峰的波長向長波方向移動，吸收強度也隨之增加。第二十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

3、超共軛效應(yīng)：由烷基的σ鍵與共軛體系的π鍵共軛而引起，其效應(yīng)也可使吸收峰向長波方向移動、吸收強度增加，但其作用遠小于共軛效應(yīng)。

4、溶劑的影響：溶劑的極性強弱能影響物質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)，影響其紫外可見吸收光譜的吸收峰波長、吸收強度和形狀。

吸收光譜影響因素第二十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

n→π*躍遷的吸收峰向短波方向移動，稱短移或紫移效應(yīng)。

π→π*躍遷的吸收峰向長波方向移動，稱為長移或紅移效應(yīng)。溶劑的極性增強：吸收光譜影響因素第二十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一例：異亞丙基丙酮的溶劑效應(yīng)極性增強溶劑正己烷氯仿甲醇水π→π*230nm238nm237nm243nm向長波移動波長增加n→π*329nm315nm309nm305nm向短波移動波長縮短吸收光譜影響因素:溶劑第二十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)結(jié)束第二十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)

紫外－可見分光光度計基本組成與結(jié)構(gòu)一、儀器的基本組成二、紫外可見分光光度計整機的光路結(jié)構(gòu)第二十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一一、儀器的基本組成由光源、單色器(分光系統(tǒng))、吸收池、檢測器和顯示器等五大部分組成。紫外－可見分光光度計紫外－可見分光光度計的測定波長范圍最大在200～1000nm。光源單色器吸收池檢測器顯示器第二十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一光源是提供激發(fā)所需入射光的裝置。

光源的數(shù)量特征，要求光源有足夠高和穩(wěn)定的強度。光源的不穩(wěn)定性會疊加到定性信息中，影響測量的準確度與精確度。

光源的性質(zhì)特征(光譜特征):每種光源所發(fā)的光具有一定的波長范圍；不同波長成分光(λ)的相對強度fs(λ)也不同。

紫外－可見分光光度計1、光源第二十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一常用光源：鎢燈、氫燈、氘燈、氙燈

(1)、鎢燈：可見光區(qū)光源。白熾鎢燈的燈絲溫度約2850K，工作波長范圍約為350～2500nm，所發(fā)出的光大部分在近紅外區(qū)。為了提高其在可見區(qū)輻射的相對強度，須提高燈絲的溫度，為此常在燈泡內(nèi)充入鹵素氣體，制成鹵素?zé)?，如碘鎢燈，溴鎢燈等。紫外－可見分光光度計第二十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一是低壓氫和氘的氣體放電燈，能在160～360nm間發(fā)出波長連續(xù)的紫外光。在空氣中，用石英作燈管的氫燈或氘燈，由于受石英與空氣透過特性的影響，工作波長范圍約為190～360nm(普通玻璃不能通過紫外線，只能通過可見光)。與氫燈相比，氘燈的能量輸出和波長范圍均顯著的提高。(2)、氫燈和氘燈，(3)、氙燈

在紫外區(qū)和可見區(qū)都可以發(fā)出強度高、波長連續(xù)的光，是高檔儀器采用的光源。紫外－可見分光光度計第三十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一2.單色器（分光系統(tǒng)）：

單色器是提供將光源輻射的復(fù)合光分成單色光的光學(xué)裝置。

單色器的功能：通過色散器件，將光源產(chǎn)生的包含多種波長成分的、波長連續(xù)的復(fù)色光，在空間上分開，呈按一定波長順序排列的單色光，然后取出所需波長的單色光用于分析。紫外－可見分光光度計第三十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

入射狹縫：只許光源分一束光進入。

準光鏡：將光源產(chǎn)生的光轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫泄馐蛊湔丈湓谏⒃系娜肷浣蔷嗟?。色散元件：為棱鏡或光柵，將復(fù)合光色散成按一定波長順序排列的單色光。成像物鏡：將色散原件產(chǎn)生的單色平行光，在其焦平面的不同位置聚焦，成為出射狹縫對應(yīng)波長的單色光。出射狹縫：使分析所需波長的單色光通過。紫外－可見分光光度計(1)單色器的組成:第三十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一棱鏡單色器的結(jié)構(gòu)原理示意光源入射狹縫準光鏡棱鏡成像物鏡出射狹縫光電管第三十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

單色器中入射狹縫越窄，則光譜帶上任意一點的波長成分越純，光譜的質(zhì)量就越高；出射狹縫越小，則產(chǎn)生單色光的帶寬小、單色性好、但能量小，影響儀器的信噪比。

通常入射狹縫和出射狹縫進行同步調(diào)節(jié)，保持兩者的寬度相同，這種情況下單色光的能量輸出與狹縫的寬度的平方成正比。紫外－可見分光光度計狹縫大小的影響第三十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一①棱鏡：棱鏡材料對不同波長光的折射率不同，波長短光的折射率大，波長長的光折射率小。平行的復(fù)合光經(jīng)色散后，就按波長順序被分解為不同波長的“單色光”，得到按波長順序展開的光譜。有玻璃棱鏡(可見光)和石英棱鏡(紫外波段)。紫外－可見分光光度計（2）、色散元件:

棱鏡或光柵第三十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一②光柵：利用多狹縫干涉和單狹縫衍射的聯(lián)合作用，將復(fù)合光色散為“單色光”；多狹縫干涉決定譜線的位置，單狹縫衍射決定譜線的強度分布。有凹面光柵和平面光柵。

色散作用：用光柵公式表示d(sinα+sinθ)=nλ，式中：α、θ分別為入射角和衍射角，整數(shù)n為光譜級數(shù)，波長λ。在入射角一定的情況下，衍射角隨波長而不同而變化，將復(fù)合光色散為單色光。

（2）、色散元件:紫外－可見分光光度計第三十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一（3）、單色器的性能指標

包括：單色光的單色性、波長分辨率和單色光的強度等指標評價。

單色性是指單色光波長成分的純度，用光譜帶寬表示，簡稱帶寬。指單色光光譜中1/2峰高處的波長寬度，稱為半高寬或半寬。

波長分辨率：光譜儀分辯譜線的能力，是光譜儀極為重要的性能指標。

有絕對分辨率、相對分辨率和實際分辨率、理論極限分辨率等。

紫外－可見分光光度計第三十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一絕對分辨率：指最低實際能分開的兩條譜線之間的絕對距離，也稱為分辨波長。紫外－可見分光光度計單色器的波長分辨率絕對分辨率越小，光譜儀分辨譜線的能力越大。第三十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一3、吸收池

即比色皿，根據(jù)測定波長的范圍，用光學(xué)玻璃或石英加工而成。有不同大小光徑的系列。紫外－可見分光光度計

4、檢測器分光光度計中檢測信號的器件稱為檢測器。光譜儀器中信號的傳輸主要是光強度特征的傳送，受檢測器影響很大。檢測器的類型有：

單通道檢測器和多通道檢測器。第三十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一單通道檢測器：檢測器位于單色器的出射狹縫后面，只能對一種波長成分的光進行檢測。波長掃描時，檢測器逐個檢測各個單色光波長單元的強度，因此，掃描一個樣品的光譜要有足夠長的時間。多通道檢測器：是多個單通道檢測器的集合，能同時檢測空間不同位置光的強度。有多通道光譜儀和二級管陣列檢測器。紫外－可見分光光度計①檢測器的類型

常用的檢測器是把光信號轉(zhuǎn)變成電信號的光電檢測器。光電檢測器：有光電池、光電管、光電倍增管、硅二極管。第四十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

②、光電池又稱光生伏打電池；有硒光電池和硅光電池。將硒或硅沉積在鐵或銅的金屬基板上，其表面再復(fù)蓋一層金、銀或其它金屬的透明金屬層，即構(gòu)成了光電池。當(dāng)光照射在半導(dǎo)體硒或硅上時，半導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生自由電子和空穴，自由電子向透明的金屬薄膜層移動(向集電極運動)，為負極；空穴則移向基板，為正極。將產(chǎn)生的自由電子通過外電路與空穴復(fù)合即可產(chǎn)生電流。紫外－可見分光光度計光電檢測器第四十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一光電池的特性當(dāng)外電路的電阻不大時，光電流與照射的光強具有線性關(guān)系，一般可達10-100μΑ。

硒光電池，價格便宜，但靈敏度低、長時間爆光異“疲勞”、且較易受水蒸氣和化學(xué)氣體得作用而失效。

硅光電池，價格較高，不易“疲勞”，但在短波區(qū)的響應(yīng)較差。第四十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

又稱真空光電二極管。由一個陰極和一個陽極構(gòu)成，裝在抽成真空的玻璃或石英管內(nèi)。陰極為一金屬的半圓筒，內(nèi)涂堿金屬及其它材料組成的光敏物質(zhì)，陽極為金屬鎳環(huán)或鎳片。

當(dāng)光照射到陰極上的光敏物質(zhì)上時，光敏物質(zhì)發(fā)射光電子，光電子在兩極之間施加的正電壓的作用下加速流向陽極，經(jīng)陽極收集產(chǎn)生光電流。光電流在負載電阻兩端產(chǎn)生一個電位降，經(jīng)放大即可進行測量。將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。紫外－可見分光光度計③、光電管第四十三頁，共八十二頁，編輯?023年，星期一加上了多級電子倍增電極的光電管。在陰極和陽極之間，加有約1000V的直流電壓，當(dāng)光子撞擊陰極時發(fā)射的光電子，在電場的作用下加速撞擊第一倍增極，撞擊出更多的二次電子。依次類推，在陽極上最后收集到的電子數(shù)將是陰極發(fā)出電子數(shù)的105～108倍。光電倍增管的線性范圍較寬，并可通過倍增極的負反饋使輸出信號穩(wěn)定，通過調(diào)節(jié)外加電壓的大小可調(diào)節(jié)光電倍增管的輸出電流大小。因此，多用來作為中、高檔分光光度計的檢測器。紫外－可見分光光度計④、光電倍增管第四十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一光電倍增管工作原理示意圖K光敏陰極；1～4打拿極；A陽極；R電阻；C1～C5電容

第四十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

它由一塊有反向偏置p～n結(jié)的硅片構(gòu)成。由于反向偏置，其導(dǎo)電性幾乎為零。在光照射時，由于電子和空穴的增加，硅片的導(dǎo)電性增加。其導(dǎo)電性與光照呈線性關(guān)系。

硅二極管的最大優(yōu)點是體積很小，在1mm2的面積上最多可設(shè)置超過15000個的硅二極管，特別適合加工成二級管陣列檢測器。紫外－可見分光光度計⑤、硅二極管第四十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一顯示器的類型因儀器的檔次不同而有較大差異，常見的有：指針表頭式，數(shù)值管表頭式，液晶表頭式，計算機配套顯示器等。紫外－可見分光光度計5、顯示器第四十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一按光路結(jié)構(gòu)，常見紫外分光光度計可分為下列幾種類型：單光束、雙光束、雙波長以及光電二極管陣列分光光度計。紫外－可見分光光度計二、紫外可見分光光度計儀器類型第四十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

分析光經(jīng)過的路線只有一條。單色器產(chǎn)生的用于分析的一束單色光，輪流通過參比溶液和樣品溶液來進行測定。

這種分光光度計結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜，主要用于定量分析。使用時，如在不同的波長范圍內(nèi)、用不同的吸收池，則每換一次波長都必須用參比溶液校正，操作麻煩，不適于作定性分析。紫外－可見分光光度計1、單光束分光光度計單色器比色池顯示器檢測器第四十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一2、雙光束分光光度計

雙光束分光光度計的光路設(shè)計與單光束相似，將單色器產(chǎn)生的單色光被斬光器一分為二，一束通過參比溶液、另一束通過樣品溶液，然后由檢測系統(tǒng)測量得到樣品的吸光度。紫外－可見分光光度計單色器參比池樣品池檢測器顯示器光源斬光器第五十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

工作時，隨著波長掃描不同波長的單色光依次投向快速旋轉(zhuǎn)的斬光器，斬光器的反射鏡面、透光面與吸光面交替進入光路；反射面進入光路，成為參比光束；通過參比樣后，經(jīng)反射鏡由光電倍增管檢測，產(chǎn)生參比光信號I0；透光面進入光路時，成為樣品光束，通過待測樣品后，由光電倍增管檢測，產(chǎn)生分析光信號I；分光光度計通過對I與I0的相比，得到不同波長的透過率T。當(dāng)吸光面進入光路時，檢測器的輸出為零，以便檢查或控制零點。紫外－可見分光光度計雙光束光度計工作原理第五十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

雙波長分光光度計是用兩個不同波長(λ1和λ2)的單色光交替通過樣品溶液(不需使用參比溶液)后到達檢測系統(tǒng)，得到樣品溶液在兩波長處的吸光度的差值Δ?。溅ˇ?－Αλ2。只要波長合適就可扣除背景的吸光度。適于高濃度、多組分、混濁液等試樣。最適于測定存在相互干擾組分的混合試樣，不僅操作簡單，精確度也較高。紫外－可見分光光度計3、雙波長分光光度計單色器1單色器2樣品池檢測器光源斬光器第五十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一它是一種高檔的用光電二極管陣列作為多通道檢測器，由微型計算機控制的單光束紫外可見分光光度計，具有快速掃描吸收光譜的特點。紫外－可見分光光度計4、多通道光電二極管陣列分光光度計第五十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一從光源發(fā)射的復(fù)合光，通過樣品池后經(jīng)全息光柵色散，色散后的單色光由二極管陣列中的二極管接受，二極管與電容耦合；受光照射時電容放電，電容器上的帶電量與照射到二極管上的總光量成正比。一個光電二極管陣列可容納400個以上的二極管，若覆蓋200-800nm波長范圍，光譜分辨率在1～2nm，可滿足紫外～可見吸收光譜分析的需要。（已經(jīng)應(yīng)用在高級的液相色譜上）。紫外－可見分光光度計光電二極管陣列測定原理第五十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)結(jié)束第五十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)紫外～可見分光光度計的性能二、儀器分析條件的設(shè)定一、分光光度計的結(jié)構(gòu)性能及其對分析的影響第五十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一由于樣品的光學(xué)特征與測試目的不同，對測試結(jié)果的準確度、精確度與檢測限的要求也不同。應(yīng)根據(jù)分析的要求，選用適當(dāng)性能的分光光度計。分光光度計的性能決定于其結(jié)構(gòu)，也與儀器實際使用狀態(tài)與測試參數(shù)有關(guān)。表示分光光度計分析測試性能的參數(shù)有：儀器中傳送信息的保真度、對信息采集的選擇性以及儀器的測試范圍、速度與靈敏度等。一、分光光度計的結(jié)構(gòu)性能及其對分析的影響第五十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一儀器性能主要決定因素對分析影響波長范圍光學(xué)系統(tǒng)：光源、單色器、檢測器、比色皿影響能實現(xiàn)分析的項目范圍波長精確度光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析精確度波長準確度光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析的準確度發(fā)射光強度與光源類型有關(guān)分析的檢測限單色光帶寬狹縫寬度與單色器線色散率分析的準確度雜散光強度光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，器件表面的缺陷與旋轉(zhuǎn)部件對光的散射分析的檢測限（一）光學(xué)系統(tǒng)對光度計性能的影響第五十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一儀器性能主要決定因素對分析影響準確度檢測器、放大器、信號處理與顯示器的非線性準確度信噪比光源、放大器、檢測器產(chǎn)生的噪聲及環(huán)境噪聲準確度與精度分析速度儀器的響應(yīng)速度、整機的結(jié)構(gòu)分析效率，準確度與精確度（二）整機對光度計性能的影響第五十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

波長的準確度是指儀器所指示的波長值和單色器實際輸出單色光的波長值之間相符合的程度。用波長誤差來表示。

波長準確度是分光光度計能夠正確測定樣品光譜的前提，對分析測量有很大的影響。定性分析，波長準確度直接影響光譜吸收峰的位置。定量分析，波長準確度影響分析所得的數(shù)值大小。

在測量波長附近，樣品吸光系數(shù)K隨波長變化越快，波長誤差對測量的影響越大。

1.波長準確度及其對分析測定的影響第六十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

單色光帶寬決定了儀器的分辨率。對分析影響的大小與待測樣品光譜特征及所用方法有關(guān)。

如葉綠素在663nm吸收峰的半寬約為20nm左右，按Arnon公式絕對測量法，測定某葉片提取液中葉綠素a、b的濃度比(a/b應(yīng)當(dāng)在4左右)。當(dāng)帶寬分別為：2、4、5、10、20nm時，測定的a/b值為：4.1、4.0、3.8、1.8、1.3。

由此可以看出，在定性、定量分析中，單色光的帶寬應(yīng)為樣品光譜吸收峰寬的1/5～1/10。帶寬過大時，吸收光譜峰高度變小，峰寬變大，靈敏度降低。2、單色光帶寬對分析測量的影響第六十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

雜散光影響分光光度計測量的本底值，影響測定的檢測限和準確度。

高吸光度測量時，雜散光引起的相對誤差比低吸光度時要大的多，因此盡量避免在高吸光度條件下測量。3、雜散光及其對分析測定的影響第六十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一二、儀器分析條件的設(shè)定為了得到正確的結(jié)果，在選用合適的分光光度計基礎(chǔ)上，還要選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件：1.分析波長的選擇2.控制適當(dāng)?shù)臉悠肺舛确秶?.選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤旱诹?，共八十二頁，編輯?023年，星期一實際應(yīng)用時，須依據(jù)樣品的光譜特征和分析需要去選定分析波長與帶寬。

一般分析用單色光應(yīng)選擇被測物質(zhì)溶液的最大吸收波長，這樣吸光度值大、靈敏度較高，受分析波長誤差的影響較小。

如有背景干擾時，則可選靈敏度稍低，但能避免干擾的波長為作用光。單色作用光帶寬大體相當(dāng)于樣品光譜吸收峰寬1/5～1/10。

1.分析波長的選擇

分析條件的設(shè)定第六十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一為了減小測量結(jié)果的相對誤差，被測試液的吸光度應(yīng)控制在0.2～0.7范圍內(nèi)。可通過：改變試樣的稱量、改變?nèi)芤旱南♂尪龋x擇適當(dāng)光程的比色皿等控制溶液的吸光度值大小。2.控制適當(dāng)?shù)臉悠肺舛确秶?/p>

參比溶液應(yīng)包括除待測成分以外的全部背景成分，以消除由于樣品、比色皿池壁及溶劑等背景成分對作用光的發(fā)射和吸收帶來的誤差。3.選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤悍治鰲l件的設(shè)定第六十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

1、溶劑空白：當(dāng)顯色劑及制備試液所用的其他試劑均為無色，被測試液中又無有色離子存在時，可用蒸餾水等溶劑作參比溶液。

2、試劑空白：為防止試劑中含有待測成分的干擾物質(zhì)，用試劑空白。

3、試液空白：被測試液存在其他有色離子時，應(yīng)采用不加顯色劑的被測試液作為參比溶液。

4、不顯色(退色)空白：如果顯色劑和試劑均有顏色時，則可按試液測定的方法，取一份試液加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，以此作為參比溶液，消除一些共存組分的干擾。分析條件的設(shè)定參比溶液的類型第六十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一第五節(jié)紫外～可見吸收光譜法的應(yīng)用一、定性分析二、定量分析三、定量分析結(jié)果的評價第六十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

進行定性分析時，通常是根據(jù)吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目以及最大吸收波長的位置和相應(yīng)的摩爾吸收系數(shù)等進行定性鑒定。

一般采用比較光譜法，在相同的測定條件下，比較待測物與已知標準物的吸收光譜曲線，如果它們的吸收光譜曲線完全等同(λmax及相應(yīng)的κ值均相同)，則可以認為是同一種物質(zhì)。

因為紫外可見光吸收光譜包含的信息量較少，在定性分析中受到一定限制。一、定性分析第六十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一定量分析是紫外可見分光光度計最經(jīng)常使用的功能之一。既可用于常量分析、也可用于微量分析，還可用于多組分混合物的分析。

定量分析的理論依據(jù)是朗伯－比耳定律，即：物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度呈線性關(guān)系。

二、定量分析第六十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

在紫外～可見光區(qū)有吸收的物質(zhì)，可直接測定，測定的靈敏度受樣品摩爾吸光系數(shù)的限制。

用來使被測物質(zhì)顯色、生成有色化合物的試劑稱為顯色劑。對顯色劑的要求：靈敏度高(與待測物的反應(yīng)產(chǎn)物有足夠大的摩爾吸光系數(shù))、穩(wěn)定性好、選擇性好(只與待測物或其他少數(shù)化合物起顯色反應(yīng))。

顯色劑是通過與被測物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)或生成二元或多元絡(luò)合物而顯色。（一）、單組分物質(zhì)的定量分析定量分析方法1.直接測定法：第七十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

利用間接的方法測定待測物質(zhì)。

如蛋白質(zhì)測定的染料結(jié)合法：利用酸性橙等某些偶氮染料可與蛋白質(zhì)分子中堿性氨基酸發(fā)生等當(dāng)量的反應(yīng)而沉淀，使染料濃度降低；通過測定染料濃度的變化，間接測定蛋白質(zhì)中堿性氨基酸含量和蛋白質(zhì)總含量。定量分析方法2、間接測定法：（一）、單組分物質(zhì)的定量分析第七十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

根據(jù)比耳定律，只要知道樣品中待測組分的摩爾吸光系數(shù)k，就可通過測得樣品的吸光度A，由比耳定律公式A=kbc算出其濃度。

如用Arnon公式測定葉綠素a、b的含量就屬于此方法。

公式計算法屬于絕對測量，因此分析測定吸光度A的條件應(yīng)當(dāng)與公式要求的條件一致，儀器的性能如波長精度、單色器帶寬、雜散光等對測量的準確度有直接影響。3、計算法：定量分析方法（一）、單組分物質(zhì)的定量分析第七十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

為了減少測量條件對計算法的影響，可用已知濃度Cs的溶液作為標準溶液，在同樣測量條件下(同一臺儀器、同一波長與光程L等)與待測物濃度Cx同時測量其標準液吸光度As與待測樣品Ax，根據(jù)公式：Cx＝Cs·(Ax/As)求出待測組分濃度。

應(yīng)注意標準溶液的濃度Cs與樣品溶液的濃度Cx應(yīng)較為接近。定量分析方法4、比較法：（一）、單組分物質(zhì)的定量分析第七十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一標準曲線法和工作曲線法是用數(shù)學(xué)方程或曲線的形式，建立待測組分的濃度與吸光度間的關(guān)系。是計算法的一種，可以降低測量條件的差異給測定帶來的誤差。定量分析方法5、標準曲線法和工作曲線法：（一）、單組分物質(zhì)的定量分析第七十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期一

配制一系列不同濃度的被測成分的標準溶液，然后在一定測量條件下，分別測出它們的吸光度A，建立