細(xì)胞凋亡及其調(diào)控演示文稿

細(xì)胞凋亡及其調(diào)控演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞凋亡的特征及意義細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制檢測(cè)凋亡的常用方法和技術(shù)細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞凋亡與疾病Biochemistry&MolecularBiology

Cell當(dāng)前第2頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞凋亡（aopotosis，aGreekwordthatmeans

“droppingoff”or“fallingoff”)是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過(guò)程，其發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控細(xì)胞凋亡對(duì)多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)發(fā)育和正常生命活動(dòng)至關(guān)重要，與許多疾病的發(fā)生也相關(guān)

當(dāng)前第3頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2002年10月7日英國(guó)人悉尼·布雷諾爾、美國(guó)人羅伯特·霍維茨和英國(guó)人約翰·蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者（圖片來(lái)自）當(dāng)前第4頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)§4.1細(xì)胞凋亡的特征及意義一、細(xì)胞凋亡的基本特征1、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)單個(gè)凋亡細(xì)胞與周?chē)?xì)胞分離以胞漿空泡開(kāi)始，與細(xì)胞膜融合，導(dǎo)致膜發(fā)泡。隨后空泡自細(xì)胞內(nèi)排出，引起水分喪失、細(xì)胞容積減少、細(xì)胞固縮染色質(zhì)濃縮或重新分布于核膜下呈圓形或半月形最后細(xì)胞器也超濃縮，細(xì)胞核解體，細(xì)胞膜下陷，包裹著核碎片和細(xì)胞器形成凋亡小體凋亡小體最終被周?chē)?xì)胞吞噬當(dāng)前第5頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Cellstructurechangesduringapoptosis.Thetoppanelshowsanormalcell.Thelowerpanelshowsanapoptosingcell;arrowsindicatecondensednuclearfragments.當(dāng)前第6頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)檢測(cè)凋亡的常用形態(tài)學(xué)方法在實(shí)際研究中，為了對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行嚴(yán)格、合理的評(píng)價(jià)，往往采用多種方法，聯(lián)合應(yīng)用。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)(1)普通光鏡、熒光顯微鏡觀察分別對(duì)細(xì)胞核、質(zhì)染色，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目缺點(diǎn)：常受主觀因素干擾，重復(fù)性較差ab當(dāng)前第7頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)(2)電子顯微鏡觀察

凋亡細(xì)胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)的丟失，染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮necrosisapoptosis當(dāng)前第8頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)凋亡細(xì)胞的生物化學(xué)特點(diǎn)（1）非隨機(jī)性DNA降解：細(xì)胞凋亡過(guò)程中，核酸內(nèi)切酶活化，基因組DNA被降解產(chǎn)生寡核小體片段，大小相當(dāng)于核小體（180~200bp）的倍數(shù)（2）細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻：正常細(xì)胞的膜磷脂分布不對(duì)稱(chēng)，氨基類(lèi)磷脂如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺多分布在膜內(nèi)側(cè)。（3）正常的能量代謝（4）胞漿蛋白交聯(lián)：凋亡細(xì)胞的mRNA和蛋白合成減少，誘導(dǎo)組織谷氨酰胺酶表達(dá)，在胞膜下形成殼狀結(jié)構(gòu)，使凋亡小體穩(wěn)定當(dāng)前第9頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3、凋亡細(xì)胞的結(jié)局在細(xì)胞凋亡末期，破碎的核片段由一層包被，形成凋亡小體，被鄰近細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞清除，不會(huì)導(dǎo)致周?chē)M織損傷和炎癥反應(yīng)。壞死（necrosis）因溶酶體水解酶的釋放而導(dǎo)致鄰近組織的損傷和炎癥反應(yīng)當(dāng)前第10頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)NECROSISAPOPTOSIS當(dāng)前第11頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第12頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義1、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育(1)胚胎發(fā)育中特定種類(lèi)細(xì)胞在完成其使命后通過(guò)凋亡而淘汰，代之以新的細(xì)胞類(lèi)型指、趾、關(guān)節(jié)腔的形成，人、蝌蚪尾巴的消失(2)成年個(gè)體中，通過(guò)細(xì)胞凋亡清除衰老細(xì)胞并代之以新生的細(xì)胞，從而維持特定組織器官的細(xì)胞類(lèi)型和數(shù)量的穩(wěn)定皮膚和粘膜等細(xì)胞的更新（1.維持細(xì)胞總數(shù)和機(jī)體生活力2.調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量3.參與形態(tài)建成）當(dāng)前第13頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞凋亡在鴨和雞的腳的形態(tài)發(fā)生中的作用

當(dāng)前第14頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞凋亡在非洲爪蟾發(fā)育過(guò)程中尾巴消失中的作用溶酶體中

cathe-pasin酶的濃度當(dāng)前第15頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、淋巴細(xì)胞的成熟和維持免疫系統(tǒng)的功能在淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化中，自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的清除一些免疫活性細(xì)胞可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)殺傷靶細(xì)胞防止過(guò)高的免疫應(yīng)答（受抗原刺激活化的T淋巴細(xì)胞自身可以通過(guò)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程而凋亡3、細(xì)胞凋亡與DNA和組織損傷、修復(fù)有密切聯(lián)系細(xì)胞損傷嚴(yán)重，無(wú)法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞通過(guò)凋亡清除；組織損傷后由肉芽組織轉(zhuǎn)變?yōu)轳：圻^(guò)程當(dāng)前第16頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)4、細(xì)胞凋亡與衰老密切相關(guān)隨著年齡的增長(zhǎng)，許多類(lèi)型細(xì)胞失去凋亡能力，可能是導(dǎo)致衰老和器官功能普遍下降的原因胸腺和淋巴細(xì)胞可能也喪失觸發(fā)凋亡信號(hào)途徑的能力5、細(xì)胞凋亡可能與多種疾病的發(fā)生有直接聯(lián)系腫瘤，神經(jīng)退行性疾病當(dāng)前第17頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

§4.2MechanismsofapoptosisApoptosisistriggeredbyavarietyofpathways當(dāng)前第18頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)OverviewoftheevolutionarilyconservedapoptotispathwayinC.elegansandvertebrates.當(dāng)前第19頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Regulators促進(jìn)或抑制凋亡，CED-9和Bcl-2在營(yíng)養(yǎng)因子存在的情況下抑制細(xì)胞凋亡.Adapters作用于調(diào)控蛋白和效應(yīng)蛋白;在營(yíng)養(yǎng)因子存在的情況下促進(jìn)效應(yīng)蛋白的激活.蛋白酶caspases（胱天蛋白酶）是胞內(nèi)一種重要的效應(yīng)蛋白;其活化可導(dǎo)致胞內(nèi)底物的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.當(dāng)前第20頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)一、caspase與細(xì)胞凋亡1、caspase的種類(lèi)與性質(zhì)胱天蛋白酶caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）,活性位點(diǎn)含有QACXG（X=R，Q，C）保守氨基酸序列。這類(lèi)酶都以無(wú)活性的酶原形式合成并存儲(chǔ)在細(xì)胞中。N-端為一個(gè)序列、長(zhǎng)度特異的原結(jié)構(gòu)域，是caspase的活性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其后是一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基序列。當(dāng)前第21頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Caspase被活化時(shí)，在原結(jié)構(gòu)域C-端及大、小亞基間保守序列的Asp位點(diǎn)被切割，游離的大、小亞基結(jié)合成異二聚體，其活性中心由兩個(gè)亞基的部分氨基酸序列共同構(gòu)成。

caspase異二聚體可進(jìn)一步二聚化，形成活性更強(qiáng)的四聚體。

Caspaseactivationrequiresdimerizationandtwocleavages.當(dāng)前第22頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)迄今共發(fā)現(xiàn)14種caspase，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的同源性分3個(gè)亞家族：Caspase-1亞家族：caspase-1，4，5，11，12，13，14。它們的活化與炎癥因子的合成有關(guān)，多數(shù)情況下不是細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)分子。Caspase-2亞家族：caspase-2Caspase-3亞家族：caspase-3，6，7，8，9，10。它們都直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程當(dāng)前第23頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

根據(jù)caspase前體分子(procaspase)的N-端原結(jié)構(gòu)域,以及它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的作用不同，caspase-3亞家族也可以分兩類(lèi)：具有”long-prodomain”的起始分子initiators，如caspase-8,9,10等。可以通過(guò)這種long-prodomain與胞膜上的受體和接頭蛋白構(gòu)成的caspase激活復(fù)合物結(jié)合，結(jié)果使caspase起始分子發(fā)生聚集，并通過(guò)分子間切割而活化，繼而切割活化下游的caspase分子。當(dāng)前第24頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)具有“short-prodomain”的效應(yīng)分子，如caspase-3,6,7。它們不能相互聚集，只能作為上游caspase的底物，活化后作用于胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)或酶類(lèi)，促使細(xì)胞凋亡。

(p517,表21-2）當(dāng)前第25頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)caspase對(duì)底物的酶切作用是高度特異的，至少可識(shí)別包括Asp在內(nèi)的4個(gè)氨基酸殘基并切割A(yù)sp后的肽鍵，該作用同時(shí)受底物空間結(jié)構(gòu)的影響。不同的caspase對(duì)其底物的氨基酸序列親和力不同，與其功能相適應(yīng)。

N--Asp–X–X-X--C

疏水多樣化可變，Glu最佳當(dāng)前第26頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Fourcaspasepathwaysinvolvedinapoptosis

Adaptedfrom“CytokineBulletin”當(dāng)前第27頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Celltype-specificeffectorofapoptosis-inducingagentsoncaspase-9orcaspase-3deficientmice當(dāng)前第28頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、caspase的活化在不同的細(xì)胞凋亡因素刺激下，caspase在細(xì)胞內(nèi)可以通過(guò)多種不同的途徑被活化，然后切割并激活下游的caspase分子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（1）由死亡受體介導(dǎo)的“誘導(dǎo)接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后緊密結(jié)合的caspase-8分子之間可以發(fā)生切割，釋放p18和p10至胞漿，并裝配成活性蛋白酶。這種起始活性蛋白酶將進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)蛋白酶caspase-3,-6,-7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。當(dāng)前第29頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（2）caspase-9的活化通常需要線粒體的參與。Caspase-9在線粒體釋放的細(xì)胞色素C和dATP存在下，通過(guò)與Apaf-1的CARD(caspaserecruitmentdomain)

結(jié)合成一個(gè)復(fù)合體而得以活化，然后再去激活下游分子，包括caspase-3以及可能隨后被激活的caspase-2,-6,-8,-10,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cytc和dATP與Apaf-1結(jié)合并誘導(dǎo)后者構(gòu)象變化，更易聚集caspase-9當(dāng)前第30頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)效應(yīng)caspase,如caspase-3,-6,-7,主要通過(guò)上游caspase的切割而活化。切割后游離的大、小亞基裝配成活化caspase。caspase活化后的功能?當(dāng)前第31頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3、活化的效應(yīng)caspase誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制細(xì)胞內(nèi)有上百種caspase的底物蛋白，如聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）；DNA依賴(lài)的蛋白激酶；IkB-α；蛋白激酶C、δ和θ；Rb蛋白；Ras-GTPase活化蛋白；MEKK1；Akt-1和Fak等對(duì)于其中一些底物的認(rèn)識(shí)提示，caspase可能通過(guò)以下幾種機(jī)制參與凋亡當(dāng)前第32頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（1）滅活細(xì)胞凋亡抑制蛋白如caspase對(duì)ICAD/DFF45的剪切CAD(caspase活化的DNA酶）是一種導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)性

DNA降解的特定核酸酶。非凋亡期，CAD和ICAD（inhobitorofCAD）結(jié)合形成無(wú)活性復(fù)合物細(xì)胞凋亡時(shí)，caspase剪切ICAD使其失活，CAD從而游離并進(jìn)入細(xì)胞核，降解DNA。DFF：HeLa細(xì)胞中分離的DNA片段化因子，ICAD同源分子當(dāng)前第33頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（2）剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白如caspase對(duì)核板的降解作用核板是襯托于核內(nèi)膜表面的堅(jiān)固結(jié)構(gòu)，與染色質(zhì)的組織密切相關(guān)。它由核纖層蛋白的頭尾多聚體組成。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白，導(dǎo)致核板塌陷和染色質(zhì)濃縮。Caspase剪切的還有肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ak和核分裂相關(guān)蛋白等。當(dāng)前第34頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（3）剪切核效應(yīng)蛋白Caspase可能作用于DNA修復(fù)、mRNA拼接和DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，使其活性喪失或失調(diào)。聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)；細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，PARP被剪切，導(dǎo)致其氨基端的兩個(gè)結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化結(jié)構(gòu)域分離，進(jìn)而喪失其正常功能。當(dāng)前第35頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)4、caspase活化的抑制劑細(xì)胞內(nèi)存在一些caspase的抑制蛋白，防止caspase的非特異性活化。一些病毒蛋白或人工小肽也可以抑制caspase（1）IAP(inhibotorsofproteins)家族可以通過(guò)與死亡受體復(fù)合物上的TRAF結(jié)合而阻止細(xì)胞凋亡（2）一些caspase的底物如IL-1β以及一些人工小肽，是caspase的抑制劑當(dāng)前第36頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（3）一些能阻斷l(xiāng)ong-prodomain相互作用的物質(zhì)如sentrin能特異性結(jié)合Fas，卻不能結(jié)合FADD，從而阻斷了caspase-8的活化（4）絲氨酸蛋白酶抑制劑如昆蟲(chóng)病毒蛋白p35,牛痘病毒蛋白CrmA等，都能抑制caspase的活性（5）FLIPs家族在病毒中發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制劑，結(jié)構(gòu)域中含有DED，與FADD或caspase-8競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用當(dāng)前第37頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)5、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其它酶類(lèi)核酸內(nèi)切酶:多數(shù)作為caspase的底物而被活化并發(fā)揮作用，在核小體連接處切割染色體蛋白激酶：一些與caspase相互作用影響細(xì)胞凋亡的蛋白激酶，如PKC，DNA-PKcs（DNA-依賴(lài)性蛋白激酶，一種哺乳動(dòng)物絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與損傷DNA的修復(fù)、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整性，可被caspase-3催化而滅活）當(dāng)前第38頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)總之，caspase是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，其活化是不同凋亡途徑中共同的下游事件?；罨腸aspase通過(guò)切斷與周?chē)?xì)胞的聯(lián)絡(luò)、重組細(xì)胞估價(jià)、阻止DNA復(fù)制和修復(fù)、破壞DNA和核結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)凋亡小體的形成等，在細(xì)胞凋亡中起重要作用。當(dāng)前第39頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)KeyConcepts靶細(xì)胞表面的Fas受體與作用細(xì)胞質(zhì)膜表面的FasL（配體）相互結(jié)合，從而被激活.Fas和TNF（腫瘤壞死因子）受體相關(guān),FasL類(lèi)似TNF.Fas與FasL結(jié)合后聚集成為三聚體結(jié)構(gòu).Fas受體胞漿區(qū)結(jié)構(gòu)域即“死亡受體”，作用是與其它蛋白質(zhì)相互作用。二、死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡當(dāng)前第40頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)1、死亡受體的結(jié)構(gòu)細(xì)胞表面有一類(lèi)能結(jié)合細(xì)胞間凋亡刺激分子，并將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)引起凋亡的受體，稱(chēng)“死亡受體”(deathreceptor,DR)。屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。當(dāng)前第41頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)TopologystructureofDR當(dāng)前第42頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)TNFR結(jié)構(gòu)上包括：一個(gè)由1-6個(gè)富含Cys結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的保守的胞外區(qū)，一個(gè)60–80個(gè)氨基酸組成的“死亡結(jié)構(gòu)域”(deathdomain,DD)的胞內(nèi)區(qū)Fas/FasL信號(hào)途徑中，還含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（deatheffectordomain,DED)。該結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于起始caspase分子中。當(dāng)前第43頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、死亡受體介導(dǎo)凋亡的途徑通常FasL分子以同三聚體形式和3個(gè)

Fas分子交聯(lián)，導(dǎo)致Fas的死亡結(jié)構(gòu)域

DD成簇，并以DD為中介結(jié)合FADD，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。隨后，F(xiàn)ADD通過(guò)其DED結(jié)構(gòu)域和caspase-8的DED相互作用，導(dǎo)致caspase-8形成寡聚體，并驅(qū)使其自身活化活化的caspase-8進(jìn)一步活化效應(yīng)caspase,如caspase-3等，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)前第44頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)TNF與其受體TNFR結(jié)合后，（1）能夠活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1，誘導(dǎo)促炎癥和免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)（2）通過(guò)與FasL

相同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡當(dāng)前第45頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)通過(guò)對(duì)小鼠突變基因lpr的研究證實(shí)了這一凋亡信號(hào)通路.該基因是Fas的隱性突變,導(dǎo)致胸腺淋巴細(xì)胞增生,引起B(yǎng)細(xì)胞、T細(xì)胞免疫失衡.另一具有類(lèi)似作用的突變是gld(產(chǎn)生淋巴肉瘤疾病，lymphoproliferativedisease).證明該基因編碼FasL.當(dāng)前第46頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)TherelatedpropertiesofthesetwolocisuggestthatthisapoptoticpathwayistriggeredbyaninteractionbetweentheFasLligand(gldproduct)andFas(lprproduct).該通路對(duì)淋巴細(xì)胞的成熟至關(guān)重要當(dāng)前第47頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)MitochondriaandBcl-2familiesareinvolvedinFas-inducedapoptosis當(dāng)前第48頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)三、線粒體與細(xì)胞凋亡（Apoptosisinvolvesmitochondrialevents）Changesinmitochondriaoccurduringapoptosis(andalsoduringotherformsofcelldeath).Thesearetypicallydetectedbychangesinpermeability(線粒體通透性）.Thebreakthroughinunderstandingtheroleofmitochondriawasthediscoverythatcytochromecisreleasedintothecytosol（細(xì)胞色素c釋放）當(dāng)前第49頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)1、細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體跨膜電位的變化線粒體內(nèi)膜通透性小，存在一些載體蛋白和質(zhì)子泵，能有效地將線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵入外室，形成內(nèi)負(fù)外正的線粒體跨膜電位。幾乎所有誘導(dǎo)劑引起各種細(xì)胞凋亡時(shí)都伴隨有線粒體跨膜電位的下降，并且這種變化發(fā)生在凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變之前。線粒體跨膜電位的部分維持依賴(lài)于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）。當(dāng)前第50頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)生理?xiàng)l件下，MPT呈周期性開(kāi)放，使線粒體外室的質(zhì)子進(jìn)入基質(zhì)，從而防止質(zhì)子在外室的過(guò)度蓄積。MPT的持續(xù)開(kāi)放或關(guān)閉則分別誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡。幾乎所有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素都可以造成MPT的破壞，如GSH耗竭劑、caspase-1等。MPT的持續(xù)開(kāi)放將產(chǎn)生致死性后果，如跨膜電位和呼吸鏈脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生、基質(zhì)Ca2+外流和線粒體膜間蛋白的釋放等。這些因素進(jìn)一步導(dǎo)致MPT的開(kāi)放和跨膜電位的破壞當(dāng)前第51頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Mitochondrialdamageaffairs當(dāng)前第52頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)分子Themitochondrionplaysacentralroleinapoptosisbyreleasingcytochromec.ThisisactivatedbyBID.ItisinactivatedbyBcl-2.CytochromecbindstoApaf-1and(pro)-Caspase-9toformtheapoptosome.當(dāng)前第53頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)在Bax過(guò)表達(dá)、UV照射、氧化劑、神經(jīng)酰胺等因素的作用下，線粒體MPT開(kāi)放，外膜破壞并釋放CytC等凋亡相關(guān)分子，是介導(dǎo)線粒體凋亡途徑中的重要效應(yīng)分子。caspase-9(andothercaspases)的蛋白水解酶活性可被IAP家族抑制.線粒體可釋放IAP蛋白家族的拮抗分子.當(dāng)前第54頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（1）CytC：被釋放至胞質(zhì)的CytC在ATP或dATP的輔助下可特異性結(jié)合胞漿接頭蛋白Apaf-1并促進(jìn)Apaf-1寡聚化，Apaf-1借其N(xiāo)-端CARD直接募集多個(gè)

caspase-9分子，形成“apotosome”,變構(gòu)并活化

caspase-9.當(dāng)前第55頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)活化的caspase-9再激活下游分子，包括caspase-3及可能隨后被激活的caspase-2,-6,-8,-10。當(dāng)前第56頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)CytC還是線粒體呼吸鏈的重要組成成分，CytC的耗竭可能導(dǎo)致呼吸鏈中電子傳遞的破壞使ATP生成受阻和ROS產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。CytC釋放誘導(dǎo)凋亡還是壞死取決于細(xì)胞類(lèi)型：CytC充足的細(xì)胞，仍然有足夠的CytC維持電子轉(zhuǎn)運(yùn)，氧消耗和ATP聲稱(chēng)2保持正常水平——凋亡反之，在含有大量caspase抑制劑的細(xì)胞，CytC的釋放不能誘導(dǎo)caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡，MPT的破壞則誘導(dǎo)壞死當(dāng)前第57頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)AntiapoptoticsignallingbythePI3-kinase/Aktkinasepathway當(dāng)前第58頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)(2)Smac(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase)線粒體釋放的caspase活化蛋白，MW25kD，N-端具有線粒體定位信號(hào)。Smac從線粒體釋放后，與caspase活性抑制蛋白IAPs家族分子結(jié)合，從而解除IAPs對(duì)caspase的抑制。Smac在p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起重要的促進(jìn)作用，而B(niǎo)cl-2、Bax則分別通過(guò)抑制和促進(jìn)Smac的釋放對(duì)細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。當(dāng)前第59頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（3）凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducingfactor,AIF）1996年發(fā)現(xiàn)，存在廣譜caspase抑制劑是，鼠肝細(xì)胞線粒體膜間隙組分仍有促凋亡活性，分離鑒定出AIF。AIF可直接進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致染色體濃縮、斷裂，作用不依賴(lài)于caspase。（4）EndoG（endonucleaseG）MW30kD,是一種可以切斷DNA的caspase非依賴(lài)性核酸酶，進(jìn)化上保守，在細(xì)胞凋亡中可導(dǎo)致DNA斷裂和染色質(zhì)濃縮。當(dāng)前第60頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)四、Therearemultipleapoptosispathways（一）細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑以p53為中心的核凋亡通路及其轉(zhuǎn)換機(jī)制在細(xì)胞凋亡的誘發(fā)中具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞面臨DNA損傷、紡錘絲斷裂、癌基因異常激活、缺氧等不利因素時(shí)，在上游信號(hào)分子的作用下，p53表達(dá)上調(diào)，一方面通過(guò)與p16,p21以及Rb等相互作用引起細(xì)胞周期阻滯，另一方面通過(guò)促進(jìn)bax,fas等基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第61頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第62頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（二）粒酶(Granzyme)B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制之一是誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這種凋亡的作用主要是由它們分泌的粒酶B實(shí)現(xiàn)的。1、粒酶B（GrB）的基本結(jié)構(gòu)與功能粒酶是CTL和NK細(xì)胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱(chēng)。以酶原形式合成，接受胞內(nèi)外信號(hào)刺激后被激活。人類(lèi)有5種：GrA、GrB、GrH、GrM和類(lèi)胰蛋白酶-2粒酶的重要功能是參與顆粒介導(dǎo)的殺傷過(guò)程，酶切靶細(xì)胞內(nèi)多種底物蛋白，有效啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第63頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Propertiesofgranzymesinhumansandrodents

GranzymeSpeciesActivityPredictedcleavageMr(kD)Cellularexpression

AMo,H,RtTryptaseLysine,arginine65*CTLs,NKcells,γδTcellsandthymocytesB Mo,H,RtAsp-aseAsp>Glu 32 CTLs,NKcells,γδTcellsandthymocytesC Mo,Rt UnknownAsporSer27CTLs D Mouse UnknownHydrophobic35-50CTLs E Mouse UnknownHydrophobic 35-45CTLs F Mo,Rt UnknownHydrophobic 35-50 CTLs G Mouse UnknownHydrophobic 30 CTLs H Human ChymasePhen>Tyr32 CTLsandNKcells J Rat UnknownUnknown 30 Unknown M Mo,H,RtMet-aseMet>Leu 30 NKcells JATrapani,GenomeBiology2001,2(12):reviews3014.1–3014.7當(dāng)前第64頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)GrB活性中心由3個(gè)氨基酸組成：His44，Asp88，Ser183，其中Ser是發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵殘基。GrB與其它幾種粒酶及穿孔素(perforin,PFN)等一起貯存于CTL的殺傷性顆粒中。其N(xiāo)-端帶有一個(gè)酸性二肽，必須經(jīng)顆粒中的二肽?；拿?加工除去，才能產(chǎn)生活性GrB。GrB活性受?chē)?yán)格調(diào)控。（酶原形式，環(huán)境pH）。當(dāng)前第65頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞的途徑當(dāng)CTL識(shí)別靶細(xì)胞時(shí)，殺傷性顆粒迅速移向與靶細(xì)胞接觸的位置----極化現(xiàn)象。發(fā)生脫顆粒，使其中的GrB等釋放，接著進(jìn)入靶細(xì)胞。進(jìn)入途徑有：PFN孔道模型：PFN在中性pH和Ca2+參與下，12-18個(gè)PFN形成直徑15~18nm的多聚復(fù)合體孔道，將GrB運(yùn)輸入胞。當(dāng)前第66頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)GrB內(nèi)吞模型：GrB是通過(guò)靶細(xì)胞膜表面受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用，進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)吞小體中。陽(yáng)離子非依賴(lài)型6-磷酸甘露糖受體是GrB的死亡受體。PFN的主要功能是促使GrB從內(nèi)吞小體中釋放，進(jìn)一步定位到細(xì)胞核與細(xì)胞漿，特異切割底物。當(dāng)前第67頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3、粒酶B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑（1）caspase依賴(lài)的死亡通路GrB可以切割激活多種caspase前體。此外，GrB還可以直接切割caspase下游底物，如PARP,DFF45,Bid等，進(jìn)一步放大caspase的作用。當(dāng)前第68頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（2）GrB介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑GrB高效切割Bid，產(chǎn)生截短型Bid轉(zhuǎn)位至線粒體，并募集Bax嵌入線粒體膜，誘導(dǎo)線粒體釋放CytC、Smac/Diablo等多種促凋亡分子。GrB誘導(dǎo)線粒體開(kāi)啟膜通透性孔道PTP和破壞跨膜電位，直接損傷線粒體功能。GrB還能使線粒體去極化，直接引起細(xì)胞死亡。這一過(guò)程需要胞內(nèi)因子參與。當(dāng)前第69頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（3）GrB還可以直接切割DFF45使之失活，釋放出核酸酶CAD，引起細(xì)胞核DNA片段化；GrB還可以直接遷移至核內(nèi)，切割核蛋白，啟動(dòng)回促進(jìn)核凋亡。在GrB誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過(guò)程中，caspase依賴(lài)性途徑和線粒體途徑占主導(dǎo)地位，其它途徑的作用相對(duì)較弱。但各途徑之間也是相互協(xié)同、相互補(bǔ)充的。當(dāng)病毒或腫瘤細(xì)胞干擾、破壞主要途徑，逃避宿主免疫監(jiān)視時(shí)，次要途徑就發(fā)揮重要作用，清除異常細(xì)胞。當(dāng)前第70頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)AschematicmodelofGrB–mediatedapoptosis當(dāng)前第71頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Putativeextracellular(perforin-independent)rolesforGrBinage-relatedchronicinflammatorydisordersLaboratoryInvestigation(2009)89,1195–1220當(dāng)前第72頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（三）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)途徑Caspase-12前體分子主要定位在ER膜表面，可能與ER介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)鈣離子通道劑A23187等作用下，ER表面的caspase-12被calpain剪切活化并釋放到胞漿中，引起PC12等細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第73頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)成熟和折疊的破壞導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷從而引發(fā)細(xì)胞凋亡;(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白酶caspase-12的激活;(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號(hào)的異常(Breckenridgeetal。2003)。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上也存在Bak等凋亡蛋白，在凋亡因子的刺激下，Bax也能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上富聚，Bax和Bak的多聚化和caspase·12的激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡當(dāng)前第74頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Huetal.JBiochemMolBiol.2005,38(6):709-716Tanetal.JBC2006,Apr5,epubahead當(dāng)前第75頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第76頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（四）細(xì)胞的脫落凋亡（anoikis）細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有重要作用，如果失去基質(zhì)的支持，細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性死亡，稱(chēng)脫落凋亡。整合素家族介導(dǎo)的相關(guān)蛋白激酶途徑起重要作用。包括FAK，PTK，

PI-3K/Akt，MAPK，SAPK/JNK等。當(dāng)前第77頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)ModelforFAK-NTinducedroundingandapoptosisinbreastcancercelllines當(dāng)前第78頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)HIECcellsselectivelyexpressPI3-Kisoformcomplexes,translatingintodistinctrolesinAkt-1activationandcellsurvival,aswellasinaselectiveengagementbyFakand/orSrcwithinthecontextofb1integrin/Fak/Src-mediatedsuppressionofanoikisApoptosis(2012)17:566–578當(dāng)前第79頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第80頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)(五）necroptosis（necrosis+apoptosis，壞死狀凋亡）缺乏凋亡條件(如FasL,TNF等)的情況下，利用RIPK1激酶促發(fā)細(xì)胞壞死狀凋亡當(dāng)前第81頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第82頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Aponecrosis凋亡樣壞死指一類(lèi)凋亡和壞死的混合形式。許多細(xì)胞毒性物質(zhì)會(huì)在低濃度誘導(dǎo)PCD，在高濃度引起細(xì)胞壞死。假設(shè)細(xì)胞程序性死亡發(fā)生前細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過(guò)程已經(jīng)受損，可以解釋該現(xiàn)象。事實(shí)上，這是細(xì)胞毒性最常見(jiàn)的模式，從過(guò)氧化氫和其他氧化物到線粒體毒性物質(zhì)antimycinA。Nicotera，Lipton和他們的同事證明了谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，可能通過(guò)凋亡或壞死,依賴(lài)于線粒體膜電位改變和細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)。然而，在大多數(shù)情況下，與壞死樣形態(tài)學(xué)改變有關(guān)的aponecrosis并未證明是程序化的。當(dāng)前第83頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Apoptoticandnecrotichepatocellulardeathinresponsetostresssignals當(dāng)前第84頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)JournalofReproductiveMedicineandEndocrinology2006;3(2):103-108當(dāng)前第85頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第86頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)§4.3檢測(cè)凋亡的常用方法和技術(shù)一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)1、普通光鏡、熒光顯微鏡觀察分別對(duì)細(xì)胞核、質(zhì)染色，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目缺點(diǎn)：常受主觀因素干擾，重復(fù)性較差ab當(dāng)前第87頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、電子顯微鏡觀察

凋亡細(xì)胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)的丟失，染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮用于定性研究,不適于定量necrosisapoptosis當(dāng)前第88頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)二、質(zhì)膜完整性的評(píng)價(jià)檢測(cè)（一）細(xì)胞膜及核膜完整性的檢測(cè)1、膜通透性檢測(cè)（1）拒染實(shí)驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)、碘化丙啶（PI）、EB等為膜不通透染料，可使壞死細(xì)胞或凋亡后期繼發(fā)性壞死細(xì)胞核著色，而活細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不著色。缺點(diǎn)：不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細(xì)胞；且易低估細(xì)胞死亡的程度，因?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞還具有完整的細(xì)胞膜而被錯(cuò)誤地當(dāng)作活細(xì)胞。當(dāng)前第89頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（2）濃染實(shí)驗(yàn)Hoechst33342、33258等為膜通透性染料，可之凋亡細(xì)胞著色濃密，區(qū)別正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。（3）雙重染色采用對(duì)正常細(xì)胞膜和凋亡細(xì)胞跨膜通透性不同的兩種染料同時(shí)染色來(lái)區(qū)別常用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡對(duì)丫啶橙（AO）和EB的雙重染色的細(xì)胞進(jìn)行分析。正常細(xì)胞AO染色呈綠色；凋亡細(xì)胞AO陽(yáng)性，EB陽(yáng)性紅染。當(dāng)前第90頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、AnnexinV的檢測(cè)一種通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、凋亡或壞死細(xì)胞的方法。凋亡細(xì)胞膜磷脂不對(duì)稱(chēng)，膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻，與連接素（Annexin）V有較強(qiáng)的親和力。因此熒光標(biāo)記的AnnexinV可以作為一種敏感探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡同時(shí)使用膜不通透性染料PI能將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞區(qū)別當(dāng)前第91頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)FCMdetectingofAnnexinV-conjugatedcells當(dāng)前第92頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（二）線粒體等細(xì)胞器膜完整性的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)線粒體跨膜電位的改變，來(lái)檢測(cè)線粒體膜完整性一些帶有正電荷、并具有膜通透性和親脂性的熒光染料均能被活細(xì)胞攝取并堆積在線粒體中。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生后，線粒體跨膜電位降低，染料減少，可借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Thefluorescentindicatorprovidedaggregatesinthemitochondria.

healthycells-redfluorescence.apoptoticcells-greenfluorescence.當(dāng)前第93頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)三、DNA斷裂的檢測(cè)

1、DNAladder細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder。

當(dāng)前第94頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

（自趙允、翟中和）當(dāng)前第95頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)“DNAladder”被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生化指標(biāo)。

缺點(diǎn)：此方法敏感性不高，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細(xì)胞群體，不能用于組織的原位檢測(cè)。

當(dāng)前第96頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、DNA凋亡峰的檢測(cè)凋亡細(xì)胞在固定和清洗中，易發(fā)生小分子量DNA流失，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少應(yīng)用DNA特異性熒光染料（PI，DAPI，Hoechst）染色后，在流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞周期分析中，凋亡細(xì)胞常以亞二倍體形式出現(xiàn)當(dāng)前第97頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3、TUNEL技術(shù)原理:細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。當(dāng)前第98頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

當(dāng)前第99頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)CDEFGHIJ當(dāng)前第100頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3‘-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。當(dāng)前第101頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)缺點(diǎn)值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的等作用，DNA被切割成大小不等的片段，?？沙霈F(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；組織或細(xì)胞處理不當(dāng)時(shí)也可出現(xiàn)假陽(yáng)性。因而，TUNEL等方法對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記是選擇性的,而不是特異性的。TUNEL或其他DNA裂解原位標(biāo)記的分析應(yīng)結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細(xì)胞的分布和有無(wú)炎癥反應(yīng)，以排除非凋亡的陽(yáng)性反應(yīng)。當(dāng)前第102頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)四、生化指標(biāo)Caspase3的活化

當(dāng)前第103頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞色素c的釋放當(dāng)前第104頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Bcl-2的表達(dá)和磷酸化

當(dāng)前第105頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Fas和FasL

的表達(dá)當(dāng)前第106頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)§4.4細(xì)胞凋亡的調(diào)控一、細(xì)胞自身蛋白的調(diào)控作用1、p53的調(diào)控作用

p53的基本結(jié)構(gòu)：野生型p53蛋白為一393AA的轉(zhuǎn)錄因子，活性形式為四聚體，自N-端為：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)及C-端調(diào)節(jié)區(qū)。p53C-端易被降解或發(fā)生磷酸化修飾當(dāng)前第107頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)AA324-355對(duì)p53蛋白的四聚化是必需的，使之首先形成2個(gè)各由2個(gè)β-折疊和2個(gè)α-螺旋構(gòu)成的二聚體，兩個(gè)二聚體通過(guò)疏水作用連接成一個(gè)四螺旋結(jié)構(gòu)當(dāng)前第108頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)P53的表達(dá)及活性調(diào)節(jié)細(xì)胞中DNA損傷，紡錘絲斷裂，癌基因異常激活，缺氧，以及ATP耗竭等信號(hào)都能導(dǎo)致p53水平的迅速升高和p53蛋白活化。（蛋白半衰期延長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄上調(diào)）已發(fā)現(xiàn)幾種探測(cè)DNA損傷的“分子探測(cè)器”ATM、DNA-PKcs、ATR等，可以將DNA損傷或脅迫信號(hào)傳遞給p53,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第109頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)正常細(xì)胞中p53的含量和活性是受到嚴(yán)密監(jiān)控的。HDM2（humandoubleminute-2)是p53的最主要的負(fù)反饋分子，介導(dǎo)p53的胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)和泛素化降解；JNK也可以結(jié)合p53并介導(dǎo)其泛素化降解細(xì)胞受到刺激時(shí)，眾多激酶可以對(duì)p53分子的不同位點(diǎn)進(jìn)行多種修飾，進(jìn)而發(fā)揮不同功能。如p53的Ser15,Thr8,Ser20等被磷酸化后，HDM2不能與p53結(jié)合——阻止降解；某些激酶磷酸化HDM2的p53結(jié)合位點(diǎn)，使其失去結(jié)合能力當(dāng)前第110頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)p14蛋白與HDM2結(jié)合，抑制HDM2的E3泛素連接酶活性，使p53免于降解Regulationofp53protein當(dāng)前第111頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)p53對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)以p53為核心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行基因修復(fù)、引起細(xì)胞周期阻滯、或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡p53主要作用于細(xì)胞周期的G1期、G2/M期、G0-G1-S-Rb等檢查點(diǎn)，并引起細(xì)胞周期停滯。G1/S期調(diào)節(jié)點(diǎn)是p16-cyclinD1-CDK4-Rb途徑，p16是cyclinD1-CDK4的負(fù)調(diào)節(jié)因子，Rb是cyclinD1-CDK4的主要靶蛋白，通過(guò)作用于E2F-DP轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期必需基因。當(dāng)前第112頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)p53可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期抑制蛋白p21作用于p16、Rb等信號(hào)途徑，抑制cyclin-CDK復(fù)合體，如cyclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，當(dāng)前第113頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)接著Rb去磷酸化，結(jié)合E2F并抑制E2F家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，引起細(xì)胞周期停滯在G1期。當(dāng)前第114頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第115頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第116頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞周期在G1、G2/M期的停滯為DNA修復(fù)提供了時(shí)間，一旦修復(fù)失敗，p53則在其它因素的配合下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第117頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、Bcl-2家族蛋白的調(diào)控作用Bcl-2是迄今研究最深入、廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)至少15個(gè)Bcl-2同源蛋白：

凋亡抑制蛋白：Bcl-2,Bcl-XL,A1/Bf-1,Bcl-W,Mcl-1等凋亡誘導(dǎo)蛋白：Bax,Bcl-Xs,Bad,Bik,Bak,Bid,Hrk等當(dāng)前第118頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（1）Bcl-2家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與功能的關(guān)系包含兩大結(jié)構(gòu)域：C-端的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion,TM);數(shù)量不等的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(Bcl-2homology,BH)。按結(jié)構(gòu)分Bcl-2,Bax,BH3家族當(dāng)前第119頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Bcl-2是一種細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜。TM結(jié)構(gòu)域（信號(hào)錨定序列）是Bcl-2定位所必需的。BH結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)與其它分子間相互作用的重要功能區(qū)。多數(shù)Bcl-2家族蛋白能形成二聚體（通過(guò)BH結(jié)構(gòu)域）。促進(jìn)存活和促進(jìn)凋亡的成員間也可以借助于BH形成二聚體，影響彼此功能當(dāng)前第120頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（2）Bcl-2家族蛋白對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用Bcl-2亞家族，如Bcl-XL能通過(guò)BH4結(jié)合Apaf-1，阻止后者對(duì)caspase-9的活化；而B(niǎo)H3亞家族，如Bik，則與Bcl-XL結(jié)合而抑制上述活性。由于含有BH1、BH2，Bcl-2和Bax可以在細(xì)胞器膜上形成性質(zhì)不同的孔道，從而保護(hù)或破壞該細(xì)胞器。如Bcl-2、Bcl-XL能抑制線粒體PTP開(kāi)放和維持跨膜電位；相反，Bcl-Xs則阻止Bcl-XL和CytC結(jié)合。Bcl-2家族蛋白自身活性也受調(diào)節(jié)——蛋白磷酸化當(dāng)前第121頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第122頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Proposedintracellularpathwaysleadingtocelldeathbyapoptosisortotrophicfactor–mediatedcellsurvivalinmammaliancells.當(dāng)前第123頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3、IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白的調(diào)控作用IAP是一類(lèi)發(fā)現(xiàn)于桿狀病毒中的細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族。在人類(lèi)中已發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員：NIAP，c-IAP1，c-IAP-2，XIAP，Survivin，BRUCE。IAP一級(jí)結(jié)構(gòu)中N-端為桿狀病毒IAP重復(fù)序列BIR，BIR的C-端包含CX2CX16HX6C保守序列，IAP分子可串聯(lián)2-3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，但只有含BIR2才有活性。IAP的C-端是一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，與IAP分子的調(diào)節(jié)功能有關(guān)。當(dāng)前第124頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)IAP抑制細(xì)胞凋亡：直接抑制caspase的活化caspase-3,7,9）當(dāng)前第125頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)作用于TNFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(降解I-κB引起NF-κB活化，抑制凋亡的發(fā)生)當(dāng)前第126頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)二、病毒蛋白的調(diào)控作用1、病毒的Bcl-2同源蛋白腺病毒編碼的EIA有雙重功效：激活靜息期細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；而在細(xì)胞增殖受阻時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

EIA表達(dá)的結(jié)果依賴(lài)于細(xì)胞中p53.E1B-19kD類(lèi)似于Bcl-2，抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

LMP、BHRF1等促進(jìn)細(xì)胞存活當(dāng)前第127頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2、caspase活化抑制蛋白如IAP家族等3、HIV感染介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡HIV外殼蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡通過(guò)Fas/FasL途徑當(dāng)前第128頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)三、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡調(diào)控在生物體中細(xì)胞的增殖和死亡是密切相關(guān)，受到精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，二者共同維持特定器官和組織的平衡和細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控G1期——p53，Rb，E2FS，G2/M——Bcl-2，p53當(dāng)前第129頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)CellcyclewereregulatedbyCDKcomplexes當(dāng)前第130頁(yè)\共有148頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)§4.5細(xì)胞凋亡與疾病一、細(xì)胞凋