細胞生物學(xué)實驗技術(shù)一

動物細胞生物學(xué)實驗技術(shù)當(dāng)前第1頁\共有108頁\編于星期四\21點主要內(nèi)容第一節(jié)培養(yǎng)細胞的細胞生物學(xué)第二節(jié)細胞培養(yǎng)第三節(jié)顯微鏡知識第四節(jié)細胞生物學(xué)實驗技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有108頁\編于星期四\21點第一節(jié)

培養(yǎng)細胞的細胞生物學(xué)當(dāng)前第3頁\共有108頁\編于星期四\21點主要內(nèi)容（一）體內(nèi)、外細胞的差異（二）體外培養(yǎng)細胞的分型（三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程當(dāng)前第4頁\共有108頁\編于星期四\21點體外培養(yǎng)的細胞和體內(nèi)細胞的比較相似：仍存在細胞和細胞、

細胞和基質(zhì)的相互關(guān)系單個細胞雖能生長繁殖,但不如群體細胞能力強，

當(dāng)相鄰細胞接觸，便導(dǎo)致運動停止

細胞相互溝通生物信息的結(jié)果對細胞外基質(zhì)仍有依存性

差異：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，

分化減弱或不明顯

當(dāng)前第5頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞外基質(zhì)存在于組織中，由細胞合成并分泌至胞外的成分，分布在細胞表面或細胞之間的大分子，包括纖維性成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子(主要為糖胺聚糖)等，其對細胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。當(dāng)前第6頁\共有108頁\編于星期四\21點1．影響細胞的存活、生長與死亡

正常真核細胞，大多須粘附于特定的細胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性（anchoragedependence）。例如，上皮細胞及內(nèi)皮細胞一旦脫離了細胞外基質(zhì)則會發(fā)生程序性死亡。

當(dāng)前第7頁\共有108頁\編于星期四\21點2．決定細胞的形狀細胞呈單個游離狀態(tài)時多呈球形。同一種細胞在不同的細胞外基質(zhì)上粘附時可表現(xiàn)出完全不同的形狀。細胞外基質(zhì)決定細胞的形狀這一作用是通過其受體影響細胞骨架的組裝而實現(xiàn)的。當(dāng)前第8頁\共有108頁\編于星期四\21點3．控制細胞的分化細胞通過與特定的細胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。例如，成肌細胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖，進行分化，融合為肌管。當(dāng)前第9頁\共有108頁\編于星期四\21點4．參與細胞的遷移細胞外基質(zhì)可以控制細胞遷移的速度與方向，并為細胞遷移提供“腳手架”。細胞的遷移依賴于細胞的粘附與細胞骨架的組裝。細胞粘附于一定的細胞外基質(zhì)時誘導(dǎo)粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系細胞外基質(zhì)與細胞骨架“鉚釘”。當(dāng)前第10頁\共有108頁\編于星期四\21點（一）體內(nèi)、外細胞的差異體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細胞間相互影響體外：缺乏動態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境發(fā)生的變化分化現(xiàn)象減弱形態(tài)功能趨于單一化一定時間后死亡或者轉(zhuǎn)化獲得不死性當(dāng)前第11頁\共有108頁\編于星期四\21點體外培養(yǎng)的細胞仍具有研究的意義許多性狀仍與體內(nèi)相同如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動，細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應(yīng)基因關(guān)閉／開啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達與調(diào)控提供線索。當(dāng)前第12頁\共有108頁\編于星期四\21點（二）體外培養(yǎng)細胞的分型

貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按體內(nèi)組織學(xué)標推判定懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，白血病細胞，骨髓細胞或免疫細胞，不需要細胞間和細胞與培養(yǎng)表面的接觸。當(dāng)前第13頁\共有108頁\編于星期四\21點貼附型細胞的分類成纖維細胞型上皮型細胞游走細胞型多型細胞型當(dāng)前第14頁\共有108頁\編于星期四\21點成纖維細胞型梭型或不規(guī)則三角形，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似時皆可稱為成纖維細胞。

當(dāng)前第15頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第16頁\共有108頁\編于星期四\21點上皮型細胞：扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，細胞很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。當(dāng)前第17頁\共有108頁\編于星期四\21點游走細胞型：散在生長，不連成片，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

當(dāng)前第18頁\共有108頁\編于星期四\21點多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

當(dāng)前第19頁\共有108頁\編于星期四\21點（三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程當(dāng)前第20頁\共有108頁\編于星期四\21點培養(yǎng)細胞的生命周期是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。種類、供體的年齡等。人胚成纖維細胞可傳30～50代，約150～300個增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細胞僅可傳幾代供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。當(dāng)細胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。當(dāng)前第21頁\共有108頁\編于星期四\21點生命周期的三個階段原代培養(yǎng)期

傳代期衰退期

當(dāng)前第22頁\共有108頁\編于星期四\21點原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織,分離出細胞、接種培養(yǎng)到第一次傳代。原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期原代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。特點細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous）細胞克隆形成率（CloningEfficiency）低，即細胞獨立生存性差。由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象當(dāng)前第23頁\共有108頁\編于星期四\21點原代培養(yǎng)分為兩種方法直接接種組織塊由組織分離出細胞后接種當(dāng)前第24頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第25頁\共有108頁\編于星期四\21點組織塊接種：牛胎兒成纖維細胞當(dāng)前第26頁\共有108頁\編于星期四\21點傳代期：原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。當(dāng)前第27頁\共有108頁\編于星期四\21點衰退期：增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。少數(shù)情況下，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性質(zhì)（Malignancy）。這樣的細胞群體稱無限細胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細胞系（ContinuousCellLine）。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。當(dāng)前第28頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞的一代生存期1．潛伏期（LatentPhase）

2．指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）3．停滯期（StagnatePhase）

當(dāng)前第29頁\共有108頁\編于星期四\21點1．潛伏期（LatentPhase）細胞接種培養(yǎng)后，先是懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著細胞貼附于底物表面，稱貼壁，各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。經(jīng)過延展過程變成極性細胞可運動，基本無增殖。細胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。當(dāng)前第30頁\共有108頁\編于星期四\21點不同的細胞貼壁的時間不同如巨噬細胞、成纖維細胞等粘附能力強,能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面

如神經(jīng)元細胞、羊水細胞，粘附能力弱,需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面可利用此特點（粘附：快、牢；慢、弱）

分離、純化細胞當(dāng)前第31頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第32頁\共有108頁\編于星期四\21點貼附過程：3步貼附因子粘附細胞開始附著細胞進一步

牢固附著—伸展當(dāng)前第33頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞貼壁影響因素生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機械、物理等其他因素：流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著離心：促進附著低溫：可抑制附著當(dāng)前第34頁\共有108頁\編于星期四\21點加速細胞貼壁的措施包被培養(yǎng)皿底面：對分化程度高、生長能力差的細胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細胞粘附和生長的生物活性物質(zhì)如:--通過其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部,培養(yǎng)的細胞再與其結(jié)合。血清內(nèi)含有多種能夠促進細胞粘附的成分減少接種時細胞懸液的量，待細胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液當(dāng)前第35頁\共有108頁\編于星期四\21點培養(yǎng)液中離子成分及其濃度如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于

細胞的粘附、貼壁和鋪展合適的培養(yǎng)溫度當(dāng)前第36頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞鋪展（伸展）

(spread)

進行生命活動的一種基本的生長特點或生長行為鋪展狀況制約細胞的分裂增殖活動鋪展的過程細胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細胞)逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細，鋪展的越好與生長基質(zhì)的表面接觸面越大極性細胞就是細胞在體外的特征性細胞形態(tài)鋪展狀況與細胞的生長有密切關(guān)系只有當(dāng)細胞鋪展到合適的程度DNA合成才開始進行當(dāng)前第37頁\共有108頁\編于星期四\21點2，指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）是細胞增值最旺盛的階段，是細胞一代中活力最好的時期,是進行各種實驗最好的和最主要的階段。以細胞分裂指數(shù)（MitoticIndex：MI）作為判定細胞生長旺盛與否的重要標志。即每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，原代細胞分裂指數(shù)低，永生細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響

當(dāng)前第38頁\共有108頁\編于星期四\21點2，指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）接觸抑制（ContactInhibition）由于細胞增殖而的相互接觸，進而抑制細胞的運動和增殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個十分有趣的現(xiàn)象。當(dāng)周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時,一旦上皮細胞互相接觸,就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫"接觸抑制"。因此,創(chuàng)面上不會出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和"神秘"的調(diào)控現(xiàn)象。

當(dāng)前第39頁\共有108頁\編于星期四\21點接觸抑制（Contactinhibition）細胞相互接觸時，將停止增長；細胞停留在細胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細胞重疊堆積生長。當(dāng)前第40頁\共有108頁\編于星期四\21點3．停滯期（StagnatePhase）：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后，才能再用。當(dāng)前第41頁\共有108頁\編于星期四\21點第二節(jié)、細胞培養(yǎng)當(dāng)前第42頁\共有108頁\編于星期四\21點主要內(nèi)容（一）細胞培養(yǎng)所需條件（二）細胞培養(yǎng)所需用品（三）細胞培養(yǎng)液（四）細胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細胞的凍存和復(fù)蘇（六）細胞污染當(dāng)前第43頁\共有108頁\編于星期四\21點（一）細胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境

溫度:

37℃

O2

CO2:

5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:

滲透壓

濕度3無污染4無毒當(dāng)前第44頁\共有108頁\編于星期四\21點（二）細胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管當(dāng)前第45頁\共有108頁\編于星期四\21點1．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Horizontalairflow)B.垂直流超凈工作臺(Lateralairflow)C.層流空氣超凈工作臺(Laminarairflow)當(dāng)前第46頁\共有108頁\編于星期四\21點水平流超凈工作臺背送風(fēng)，但病毒是不實用的，容易對人有害當(dāng)前第47頁\共有108頁\編于星期四\21點垂直流超凈工作臺當(dāng)前第48頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第49頁\共有108頁\編于星期四\21點超凈工作臺的清潔維護：

保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實驗結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。當(dāng)前第50頁\共有108頁\編于星期四\21點整個接種操作應(yīng)在近火焰處進行，且動作要迅速

正

確

錯

誤當(dāng)前第51頁\共有108頁\編于星期四\21點接種過程中盡可能達到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯

誤當(dāng)前第52頁\共有108頁\編于星期四\21點接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯

誤當(dāng)前第53頁\共有108頁\編于星期四\21點瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤當(dāng)前第54頁\共有108頁\編于星期四\21點2，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕度，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。當(dāng)前第55頁\共有108頁\編于星期四\21點濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠當(dāng)前第56頁\共有108頁\編于星期四\21點3．消毒設(shè)備：

A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110oC，15lb，20分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9lb，10分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。

B.干熱消毒箱：150-200oC，2-3小時。

適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛

等，酒精濃度為75－95％。

當(dāng)前第57頁\共有108頁\編于星期四\21點高壓消毒鍋當(dāng)前第58頁\共有108頁\編于星期四\21點

D.濾膜過濾：正壓過濾:

蠕動泵通入培液；通入氣體。

負壓過濾：用水泵或油泵抽濾。

濾膜孔徑為0.22μm，為延長濾膜壽命可同時添加0.45μm和1.2μm濾膜。當(dāng)前第59頁\共有108頁\編于星期四\21點濾膜濾器當(dāng)前第60頁\共有108頁\編于星期四\21點兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）當(dāng)前第61頁\共有108頁\編于星期四\21點4.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：1）用三蒸水，通過去離子純水系統(tǒng)，電阻需達到170萬歐姆以上。2）專門的去離子水系統(tǒng)5.倒置相差顯微鏡：需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。當(dāng)前第62頁\共有108頁\編于星期四\21點純水系統(tǒng)

當(dāng)前第63頁\共有108頁\編于星期四\21點倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉當(dāng)前第64頁\共有108頁\編于星期四\21點5，培養(yǎng)器皿當(dāng)前第65頁\共有108頁\編于星期四\21點培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶當(dāng)前第66頁\共有108頁\編于星期四\21點5，恒溫水浴箱，血清滅活，細胞解凍當(dāng)前第67頁\共有108頁\編于星期四\21點6，移液管當(dāng)前第68頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第69頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第70頁\共有108頁\編于星期四\21點7，低速離心機當(dāng)前第71頁\共有108頁\編于星期四\21點（三）細胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys5A、M199、F12等當(dāng)前第72頁\共有108頁\編于星期四\21點Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3,丙酮酸鈉、抗生素等當(dāng)前第73頁\共有108頁\編于星期四\21點Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進行分裝，避免反復(fù)凍融，血清保存要放置－20℃當(dāng)前第74頁\共有108頁\編于星期四\21點培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標準，有幾點建議可供參考

選擇培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)液?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。其它實驗室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細胞。用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIMV培養(yǎng)基（SFM）。當(dāng)前第75頁\共有108頁\編于星期四\21點血清使用注意事項血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)當(dāng)前第76頁\共有108頁\編于星期四\21點補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細胞溶解（抗體包裹細胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補體系統(tǒng)主要的功能是通過在病原體表面的作用，破壞其細胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

當(dāng)前第77頁\共有108頁\編于星期四\21點凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。

血清沉淀物

當(dāng)前第78頁\共有108頁\編于星期四\21點谷氨酰胺L－谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分攪拌溶解后（應(yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM當(dāng)前第79頁\共有108頁\編于星期四\21點酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示橙色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。當(dāng)前第80頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞消化液由組織中分離細胞和細胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用當(dāng)前第81頁\共有108頁\編于星期四\21點胰蛋白酶溶液主要作用：使細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞相互離散消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細胞生長當(dāng)前第82頁\共有108頁\編于星期四\21點（四）細胞的原代和傳代培養(yǎng)當(dāng)前第83頁\共有108頁\編于星期四\21點鼠胎組織細胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)當(dāng)前第84頁\共有108頁\編于星期四\21點全量換液和半量換液換液時機的選擇：培養(yǎng)液pH值：細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細胞狀態(tài)細胞換液當(dāng)前第85頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞傳代原代細胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細胞株細胞系傳代以得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)接觸抑制營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同，在一代中，細胞培增3～6次當(dāng)前第86頁\共有108頁\編于星期四\21點消化法傳代培養(yǎng)步驟當(dāng)前第87頁\共有108頁\編于星期四\21點(五)細胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：緩凍速溶4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液當(dāng)前第88頁\共有108頁\編于星期四\21點冷凍細胞注意事項凍存液配制:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積：要小，0.5-1ml凍存細胞數(shù)：與正常傳代細胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度：降溫緩慢4C，10－30min-20C，1--2h-80C，1hour–過夜

-196C，1--2year完善記錄：凍存細胞名稱，PD，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等當(dāng)前第89頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞凍存管，做好標記當(dāng)前第90頁\共有108頁\編于星期四\21點當(dāng)前第91頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞復(fù)蘇速融凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中當(dāng)前第92頁\共有108頁\編于星期四\21點（六）細胞污染細菌污染真菌污染細菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除當(dāng)前第93頁\共有108頁\編于星期四\21點細菌污染

細胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

當(dāng)前第94頁\共有108頁\編于星期四\21點真菌污染真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

當(dāng)前第95頁\共有108頁\編于星期四\21點白色念珠菌（倒置顯微鏡下）

中間長梭型的是正在分裂的念珠菌當(dāng)前第96頁\共有108頁\編于星期四\21點細菌和真菌的清除使用抗生素抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。當(dāng)前第97頁\共有108頁\編于星期四\21點95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發(fā)生率達到11%能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達不能通過可視法對其進行檢測對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實驗器具不潔等已受污染的細胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染當(dāng)前第98頁\共有108頁\編于星期四\21點熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法支原體污染檢測當(dāng)前第99頁\共有108頁\編于星期四\21點細胞營養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細胞生長變緩，部分細胞發(fā)生脫落等等，細胞間隙可見鋪滿細沙樣小點。支原體污染表現(xiàn)熒光染料Hoechst33258染色法檢測支原體當(dāng)前第100頁\共有108頁\編于星期四\21點支原體的清除

支原體清除劑MRA（Mycoplasma

Removal

Agent）處理法每4天換一次液，連續(xù)處理15天清洗純化法細胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復(fù)離心洗滌原理：由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生，所以通過反復(fù)洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限.如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織