第五章工業(yè)微生物誘變育種誘變劑演示文稿

第五章工業(yè)微生物誘變育種誘變劑演示文稿當前第1頁\共有53頁\編于星期五\22點優(yōu)選第五章工業(yè)微生物誘變育種誘變劑當前第2頁\共有53頁\編于星期五\22點誘變劑是指那些能誘發(fā)基因突變、并使突變率提高到超過自發(fā)突變水平的物理或化學因子。物理誘變劑種類化學誘變劑生物誘變劑第一節(jié)微生物育種誘變劑當前第3頁\共有53頁\編于星期五\22點當前第4頁\共有53頁\編于星期五\22點誘變育種的特點（1）提高突變率、擴大突變譜。（2）改良單一性狀比較有效，同時改良多個性狀較困難.

（3）性狀穩(wěn)定快，育種年限短。（4）誘發(fā)突變的方向和性質尚難掌握。

當前第5頁\共有53頁\編于星期五\22點一、物理誘變劑包括紫外光、x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。其中紫外光沿用最廣，誘變抗生素高產突變株有很優(yōu)異的效果。非電離輻射：電子級能提高，但不產生離子。電離輻射:能擊中電子并產生正離子物理誘變主要是由于高能輻射導致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復雜的連鎖反應過程。常可以分為物理、物理-化學、化學、生物學階段(p35)。當前第6頁\共有53頁\編于星期五\22點（一）物理誘變劑的生物學效應直接作用間接作用擊中DNA或其它生物結構引起的能量吸收環(huán)境中其它分子激發(fā)和電離分子激發(fā)和電離分子重排重排原初損傷擴散自由基分子的變化代謝代謝突變突變體生物變化細胞死亡物理物理-化學化學生物學當前第7頁\共有53頁\編于星期五\22點1、物理階段

持續(xù)時間極短（10-5~10-8秒）。電離輻射產生能量轉移，在體內形成電離效應。2、化學階段持續(xù)時間極短（10-5~10-8秒）。形成大量的自由基。3、生物化學階段持續(xù)時間短（10~10-2秒）。大量的自由基與生物大分子發(fā)生化學反應，形成大量的烷化自由基(R.)，將輻射效應轉移到生物大分子中。烷化自由基持續(xù)時間長，并可通過繁殖傳遞。當前第8頁\共有53頁\編于星期五\22點4、生物學階段持續(xù)時間長（甚至幾個世代）,并可通過繁殖傳遞。烷化自由基(R.)與生物大分子發(fā)生一系列反應，引起生理和遺傳損傷。4.1形態(tài)方面的表現(xiàn)損傷：造成死亡，死亡率與輻射劑量成正比生長：抑制生長等，與輻射劑量成正比形態(tài)變異：菌落（體）、色澤大小變化。生理變異：不能遺傳，逐漸消失。遺傳變異：能遺傳當前第9頁\共有53頁\編于星期五\22點4.2生理方面的表現(xiàn)生理方面的表現(xiàn)酶活性的變化POD（過氧化物酶）、SOD、CAT（過氧化氫酶）、核酸酶相關物質含量的變化蛋白質、氨基酸、核苷酸生長素、ABA（天然脫落酸）

當前第10頁\共有53頁\編于星期五\22點4.3遺傳方面的表現(xiàn)細胞核方面的表現(xiàn):細胞核擴大、松散（膨松puffing）微核細胞，微核細胞率與輻射劑量成正比微核細胞率是評價遺傳損傷的指標染色體方面的表現(xiàn):斷裂，形成染色體斷片、環(huán)、橋等。染色體畸變率與輻射劑量成正比染色體畸變率是評價遺傳損傷的指標當前第11頁\共有53頁\編于星期五\22點DNA方面的表現(xiàn):DNA斷裂、分解，形成單鏈結構DNA非按時合成存在自我損傷修復機制，提前進行DNA合成，進行DNA損傷修復生長素類物質促進DNA損傷修復咖啡因、EDTA等擬制DNA損傷修復當前第12頁\共有53頁\編于星期五\22點①菌種的遺傳背景和生理狀態(tài)；②可見光；③水分；④電離輻射誘變劑在氧氣或空氣中使用時，其輻射效應一般要比在真空中或在惰性氣體中時要高；⑤溫度對電離輻射效應也有影響，主要是能改變氧與自由基，或自由基相互間的作用程度。（二）影響輻射效應的因子當前第13頁\共有53頁\編于星期五\22點1、性質和來源波長在40一390nm之間。由于DNA分子的紫外光吸收值為260nm，因而波長在200-300nm的紫外光才有誘變作用。紫外光源一般要求為發(fā)射光譜集中在260nm附近的紫外光燈，燈管內裝有氖氣的低壓放電燈是較理想的光源，國內一般采用30瓦的紫外光燈，光譜分布范圍廣，誘變效率差。特點：能量較低；對組織穿透力強.（三）非電離輻射——紫外線當前第14頁\共有53頁\編于星期五\22點2、紫外光的劑量單位:爾格能量/mm2(燈具發(fā)射強度隨使用時間延長而下降。)實際應用-相對劑量：照射時間、殺菌率來表示殺菌率：90.0%-99.9%時間：芽孢菌10min；小芽孢桿菌營養(yǎng)缺陷型1-3min；一般營養(yǎng)體3-5min；無芽孢菌和革蘭氏陽性菌0.5-2min。當前第15頁\共有53頁\編于星期五\22點3、誘變機理

嘧啶二聚體DNA鏈的斷裂胞嘧啶與尿嘧啶的水和作用DNA與蛋白質交聯(lián)當前第16頁\共有53頁\編于星期五\22點當前第17頁\共有53頁\編于星期五\22點

出發(fā)菌株前培養(yǎng)；培養(yǎng)基豐富營養(yǎng)、細菌培養(yǎng)到

對數期、真菌孢子剛成熟；制備菌懸液：處理液均用生理鹽水制備。細菌調節(jié)菌液濃度到108個/ml，真菌約為106—107/ml，放線菌則為l07—108/ml.4、操作方法當前第18頁\共有53頁\編于星期五\22點

照射設備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室、培養(yǎng)皿等;紫外燈：波長為253.7nm,功率是15W;處理時的照射距離：20cm—30cm;樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm,照射時，要用磁力攪拌器攪拌。注意：操作和培養(yǎng)時必需避免可見光直射液面，最好在黃色或紅色燈光下操作。

后培養(yǎng)：1.5-2小時；

稀釋涂皿當前第19頁\共有53頁\編于星期五\22點（四）、電離輻射當前第20頁\共有53頁\編于星期五\22點（五）新型誘變劑

微波:電磁波紅外線：0.75～1000μm激光：光量子流高能電子流：強電離輻射航天育種：利用返回式衛(wèi)星進行農作物新品種的選育的一種方法。當前第21頁\共有53頁\編于星期五\22點航椒1號航茄2號當前第22頁\共有53頁\編于星期五\22點航天葫蘆當前第23頁\共有53頁\編于星期五\22點6、低能離子注入過程：能量沉積、動量傳遞、離子注入和電荷交換時間：10－19－10－13s中間時發(fā)生。特征：具有Y射線能量沉積引起機體損傷的；動能交換產生的級聯(lián)損傷，表現(xiàn)為遺傳物質原子轉移、重排或基因的缺失；慢化離子、移位原子和本底元素復合反應造成的化學損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉移造成的損傷。當前第24頁\共有53頁\編于星期五\22點常用離子：通常采用N+、H+、Ar＋。生物學效應：相當于物理和化學誘變兩者相結合的復合誘變效應當前第25頁\共有53頁\編于星期五\22點化學誘變劑是一些能和DNA起作用，改變其結構，并引起遺傳變異的化學物質。堿基類似物烷化劑移碼突變劑其他類二、化學誘變劑種類當前第26頁\共有53頁\編于星期五\22點1、種類胸腺嘧啶的結構類似物（一）堿基類似物常用當前第27頁\共有53頁\編于星期五\22點腺嘌呤的結構類似物常用當前第28頁\共有53頁\編于星期五\22點鳥嘌呤的結構類似物當前第29頁\共有53頁\編于星期五\22點2、堿基類似物作用機制5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶的結構類似物也是一種強誘變劑。它滲入到DNA中，會發(fā)生酮式和烯醇式互變，不僅和原來的堿基配對而且和其它堿基配對。當前第30頁\共有53頁\編于星期五\22點例5-BU誘發(fā)A-T變?yōu)镚-C過程摻入到DNA的復制過程，堿基類似物又成為摻入誘變劑當前第31頁\共有53頁\編于星期五\22點3、各種堿基類似物的性質和使用方法

性質5-溴(氟)尿嘧啶(5-Bu，或5-Fu)為白色無味結晶粉末，溶于水或醇中，幾乎不溶于氯仿和乙醚。脫氧溴尿核苷(亦即溴脫氧尿核苷，5-BudR)，白色結晶狀粉末，無臭、無味，難溶于水和甲醇，易溶于堿性溶液。6-巰基嘌呤(6—MP)為黃色無臭結晶粉末，熔點313-314℃(當即分解)，在空氣中或見光會發(fā)黑變質，溶于乙醇，堿性溶液和稀硫酸，幾乎不溶于水、丙酮、氯仿和醚。當前第32頁\共有53頁\編于星期五\22點使用方法1）將待處理的細菌于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數期，離心去培養(yǎng)液。2）饑餓培養(yǎng)：生理鹽水8-10小時3)把5-Bu或5-Fu（一般劑量為5-300μg／ml，細菌25-40μg／ml）加到培養(yǎng)基中，做平板。4）涂皿菌體涂布在含一定濃度的堿基類似物的培養(yǎng)基平皿上，適溫培養(yǎng)，挑取菌落篩選。當前第33頁\共有53頁\編于星期五\22點(二)烷化劑烷化劑是一種常見的誘變劑，這類誘變劑具有一個或多個活性烷基，他們容易取代DNA分子中的活潑氫原子，直接和一個或多個堿基起烷化反應。85當前第34頁\共有53頁\編于星期五\22點1）單功能烷化劑：有一個烷化基團，對生物毒性小誘變效應大。2）雙功能或多功能烷化劑：有兩個或多個烷化基團對生物毒性大，誘變效應小。1、烷化劑種類當前第35頁\共有53頁\編于星期五\22點甲基磺酸甲酯MMSSCH3OCH3OOCH3SO2?OCH3SO2·

(OC2H5)2:硫酸二乙酯DMS當前第36頁\共有53頁\編于星期五\22點2、烷化劑作用機理EMS引起堿基轉換

當前第37頁\共有53頁\編于星期五\22點一般認為甲基化比乙基化造成能造成更多的斷裂和缺失，所以MMS的毒性大于EMS。甲基黃磺酸乙酯EMSSCH3OC2H5OO甲基黃磺酸甲酯MMSSCH3OCH3OO烷化劑當前第38頁\共有53頁\編于星期五\22點3、常用烷化劑及其使用方法亞硝基胍（NG、NTG）黃色結晶、性質不穩(wěn)定，遇光分解。是一種特別強的誘變劑，有超誘變劑的稱號。還能誘發(fā)鄰近的基因同時發(fā)生突變，即并發(fā)突變。且易誘發(fā)復制叉附近并發(fā)突變。有微弱移碼作用,適于誘變營養(yǎng)缺陷型突變株(10%營養(yǎng)缺陷型)。CH3NNOCNHNHNO2當前第39頁\共有53頁\編于星期五\22點NTG在水溶液中隨著不同pH將產生不同的分解物，從而影響誘變效用.當溶液pH低于5.5時，NTG分解成亞硝酸；當溶液pH在8.0以上時，NTG會分解產生重氮甲烷，對核酸其烷化作用；當溶液pH6.0時，NTG本身DNA其烷化反應而導致突變。當前第40頁\共有53頁\編于星期五\22點a、根據處理菌體特性，選用一定范圍pH值的緩沖液制備菌體或孢子懸液。再離心洗滌，除去培養(yǎng)液，然后用緩沖液制備孢子液。b、NG試劑要保存在冰箱內，使用時要特別注意安全﹗﹗﹗操作要在通風柜內，帶上橡皮手套，穿上工作服，也不得將NG直接放在紙上暴露稱量。最好先準備一只滅菌小瓶，在通風柜中用小勺取15-30mg放入小瓶中稱重(現(xiàn)用現(xiàn)配)。NG難溶于水，可按10mg/1ml的比例加入丙酮溶解，再用緩沖液稀釋。NG使用注意事項﹗當前第41頁\共有53頁\編于星期五\22點c、取0.2mlNG處理液與2ml孢子液混合，在一定溫度下處理n分鐘;d、用緩沖液或生理食鹽水大量稀釋或多次離心洗滌處理后的混合液并稀釋到合適濃度，涂布平皿，分離培養(yǎng)。f、所有接觸過NG的器皿均須用l-2N的NaOH液解毒處理。要浸泡過夜并在陽光下曬。最好將接觸稀濃不同的NG液的器皿分別作解毒處理。當前第42頁\共有53頁\編于星期五\22點能和DNA分子結合，并造成其堿基對增多或缺失，從而誘發(fā)突變的化合物。包括壓吖啶類雜環(huán)染料以及一些烷化劑和吖啶類相結合的化合物，總稱為ICR類化合物。使用方法：用pH7.0磷酸緩沖液將吖啶黃配制成濃度為0.2%溶液，在28℃振蕩3—4小時使其完全溶解。直接加入孢子液接觸處理或加入培養(yǎng)基內。如為生長過程處理，平皿內濃度一般為10-50μg／ml的吖啶黃，處理時避光操作。(三)移碼誘變劑當前第43頁\共有53頁\編于星期五\22點DNA鏈上的兩個堿基插入移碼突變劑后，兩個堿基之間的距離變大，引起堿基缺失和插入當前第44頁\共有53頁\編于星期五\22點

羥胺：專一作用于胞嘧啶，改變了DNA上該堿基的結構，以致在DNA復制過程中，結構改變的胞嘧啶同腺嘌呤而不與鳥嘌呤配對，從而引起了堿基轉換G：C→A：T。羥胺（NH2OH）（白色晶體，具有腐蝕性）和其它誘變劑相比，只引起G:C轉變?yōu)锳:T,而不引起A:T轉變?yōu)镚:C。（四）羥胺劑當前第45頁\共有53頁\編于星期五\22點CGCGHAC*GC*ACGC*ATA羥胺和細胞內其它物質也能發(fā)生作用，生成過氧化氫。過氧化氫是非專一性誘變劑。對于噬菌體或離體DNA，羥胺是專一性很強的誘變劑，但對細菌、真菌和放線菌等微生物，誘變效果不理想當前第46頁\共有53頁\編于星期五\22點當前第47頁\共有53頁\編于星期五\22點（五）脫氨劑-亞硝類誘變劑作用原理作用：通過氧化脫氨基造成的。胞嘧啶(C)經氧化脫氨后成為尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)經脫氨后成為次黃嘌呤(H)，鳥嘌呤(G)脫氨成為黃嘌呤(X)。當前第48頁\共有53頁\編于星期五\22點當前第49頁\共有53頁\編于星期五\22點

使用方法不穩(wěn)定，常用鹽類—亞硝酸鈉1、0.1M亞硝酸鈉溶液：稱用0.1M醋酸緩沖液配制濃度為0.05M亞硝酸鈉溶液。2、挑