第十講豬鏈球菌病診斷

病原：1豬鏈球菌2型（Streptococcussuis2）2馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcusequi

subspzooepidemicus)，舊稱獸疫鏈球菌3D、E、L、S群鏈球菌(Lancefield)蘭氏血清學(xué)分群，鏈球菌分為20個(gè)血清群（A、B、C.....V,I、J除外）當(dāng)前第1頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)一、病原分離1采樣活豬：采樣用滅菌棉拭子擦拭扁桃體病死豬：扁桃體、肺、肝、血液，有腦炎癥狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液當(dāng)前第2頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)2分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基：THB培養(yǎng)基、綿羊血或馬血平板（2）培養(yǎng)條件：需氧兼性厭氧、37℃、pH7.2豬鏈球菌2性營養(yǎng)要求比馬鏈球菌獸疫亞種低，后者需加3-5%的犢牛血清當(dāng)前第3頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)二、臨床診斷主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等。但不同鏈球菌病原引起的癥狀類似，故該診斷不能用于確診。當(dāng)前第4頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)關(guān)節(jié)炎癥狀當(dāng)前第5頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)敗血癥當(dāng)前第6頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)1染色鏡檢豬鏈球菌2型：革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。

二、微生物學(xué)診斷當(dāng)前第7頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)馬鏈球菌獸疫亞種：

革蘭氏陽性球菌，直徑0.5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長鏈，菌體表面能形成莢膜。營養(yǎng)要求較高，在5%犢牛血清生長良好。根據(jù)類M蛋白抗原性的差異，該菌至少有15個(gè)血清型。當(dāng)前第8頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）當(dāng)前第9頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)圖2豬鏈球菌2型(ZY05719)

當(dāng)前第10頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)ATCC35246株當(dāng)前第11頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)2培養(yǎng)特性豬鏈球菌2型：

菌落形態(tài)血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在綿羊血平板上呈α溶血，馬血平板則呈β溶血。當(dāng)前第12頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)馬鏈球菌獸疫亞種：在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時(shí)有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。于5％綿羊血瓊脂（THA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，大部分菌株形成3～4mm的粘液樣大菌落，產(chǎn)生明顯的β溶血。小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。當(dāng)前第13頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)3生化鑒定豬鏈球菌2型：

發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚(yáng)苷，部分菌株發(fā)酵棉實(shí)糖、菊糖；不發(fā)酵甘露醇、山梨醇當(dāng)前第14頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)馬鏈球菌獸疫亞種：能水解精氨酸，發(fā)酵乳糖、水揚(yáng)苷、山梨醇產(chǎn)酸。不能發(fā)酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P試驗(yàn)陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。當(dāng)前第15頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)三、免疫學(xué)診斷1玻板凝集實(shí)驗(yàn)用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價(jià)高；馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群

2乳膠凝集實(shí)驗(yàn)敏感性較高，結(jié)果容易判斷，但有非特異性當(dāng)前第16頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)3免疫熒光豬鏈球菌2型：用MRP特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察，但需用激光共聚焦顯微鏡。馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察當(dāng)前第17頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)MRP單抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像

MRP單抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像當(dāng)前第18頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)

SS2多抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記的SS2的激光共聚焦圖像

當(dāng)前第19頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)ELISA常用鏈球菌多克隆抗體包被，以MRP或類M蛋白的單克隆抗體夾心，敏感性高，特異性較強(qiáng)。當(dāng)前第20頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)四、分子診斷1多酶電泳法：原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場中，其遷移率有差異。用于不同型鏈球菌的分析當(dāng)前第21頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)2限制性酶切圖譜分析

原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用于分離株變異分析，亦可用于不同種或型的鑒定當(dāng)前第22頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析（RAPD）用多對隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性?？捎糜诜N或型的鑒定或分離株變異分析當(dāng)前第23頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)PCR豬鏈球菌2型：mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進(jìn)行檢測cps2具有型特異性當(dāng)前第24頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)bp970744622557mrp,ef,sly,CPS2123451:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:陰性對照當(dāng)前第25頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)250bp500bp750bpM122000bp1000bpMaker1.HA9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2當(dāng)前第26頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)250bp500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626bp)2.mrp(316bp)3.gdh(688bp)4.orf2(858bp).當(dāng)前第27頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)250bp500bp750bp1000bp2000bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1099bp1310bpM1M1slyfbpsMaker1.slyMaker1.fbps當(dāng)前第28頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有30頁\編于星期六\8點(diǎn)1040bp100bp250