釀酒酵母低滲敏感性突變株的選育

葉菁;岳希潔;蔣雪薇;羅曉明;陳代文;吳健;李赤翎【摘要】InordertoimprovetheefficientsecretionofintracellularproductinSaccharomycescerevisiae,wilddiploidY1(2n)weremutagenizedwithUVtreatmentasoriginalstrain.Tofurtheridentify.thedegreeofautolysisofeachmutantstrainwascontrastedinlowpermeabilityconditionbythetestofitscontentofFDP,extracellularnucleicacidsandproteins.Theresultsshowed:Hs5*(n)showedthehighestdegreeofconditionalautolysisinlowpermeabilitycondition,theconcentrationofFDPinextracellularenvironmentwas25.81pg/mL.Atthesixthhourinlowpermeability,itspenetrationrateofnucleicacidandproteininextracellularenvironmentwere1.86and2.07,respectively.Inaddition,mutantstrainHs2*(n),Hs1(2n)alsohadagreatextentofconditionalautolysiscapacity.Thesethreelow-permeabilitymutantstrainsobtainedinthisstudypossessedgreaterefficiencyofintracellularproductsecretioncontrastwithwildstrain.%為促進(jìn)釀酒酵母胞內(nèi)產(chǎn)物的有效釋放以其野生型二倍^體(2n)菌株Y1為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變處理，通過測定其胞外FDP濃度及核酸、蛋白質(zhì)滲透率,對比各突變株在低滲條件下的自溶程度.結(jié)果表明:突變株Hs5*(n)低滲培養(yǎng)時(shí)，條件性自溶程度最高，其胞外FDP濃度達(dá)25.82pg/mL,低滲培養(yǎng)6h時(shí),其核酸、蛋白質(zhì)滲透率高達(dá)1.86,2.07.此外突變株Hs2*(n)、Hs1(2n)也具有較好的條件性自溶能力.試驗(yàn)共篩選獲得3株低滲敏感性突變株，與野生型菌株相比，條件性自溶的低滲敏感性突變株能有效促進(jìn)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的外泌.【期刊名稱】《食品與機(jī)械》【年(卷)，期】2017(033)008【總頁數(shù)】5頁(P23-26,154)【關(guān)鍵詞】釀酒酵母;紫外誘變;低滲敏感性突變株;條件性自溶【作者】葉菁;岳希潔;蔣雪薇;羅曉明;陳代文;吳健;李赤翎【作者單位】長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙410004溢陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與信息工程系,湖南益陽410600;長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙410004;廣東益鮮美生物科技有限公司，廣東清遠(yuǎn)513300;長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙410004;廣東益鮮美生物科技有限公司，廣東清遠(yuǎn)513300;長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙410004;長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長沙410004【正文語種】中文Abstract:InordertoimprovetheefficientsecretionofintracellularproductinSaccharomycescerevisiae,wilddiploidY1(2n)weremutagenizedwithUVtreatmentasoriginalstrain.Tofurtheridentify,thedegreeofautolysisofeachmutantstrainwascontrastedinlowpermeabilityconditionbythetestofitscontentofFDP,extra-cellularnucleicacidsandproteins.Theresultsshowed:Hs5*(n)showedthehighestdegreeofconditionalautolysisinlowpermeabilitycondition,theconcentrationofFDPinextracellularenvironmentwas25.81pg/mL.Atthesixthhourinlowpermeability,itspenetrationrateofnucleicacidandproteininextracellularenvironmentwere1.86and2.07,respectively.Inaddition,mutantstrainHs2*(n),Hs1(2n)alsohadagreatextentofconditionalautolysiscapacity.Thesethreelow-permeabilitymutantstrainsobtainedinthisstudypossessedgreaterefficiencyofintracellularproductsecretioncontrastwithwildstrain.Keywords:Saccharomycescerevisiae;UVmutagenesis;low-permeabilitymutant;conditionalautolysis釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是生物技術(shù)領(lǐng)域最常用的真核外源基因表達(dá)系統(tǒng)［1］，但其堅(jiān)硬的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜是阻礙胞內(nèi)產(chǎn)物釋放的主要屏障［2］，因此如何促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)及外源蛋白的高效分泌成為研究熱點(diǎn)。目前提高胞內(nèi)物質(zhì)釋放的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法，其中物理法和化學(xué)法是目前最常采用的手段，這2種方法雖然效果明顯但也存在著不足［3-5］。物理法以脈沖電場、超聲波等方法為主，對儀器設(shè)備要求較高；化學(xué)法主要采用溶劑破碎，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生改變。此外，采用基因工程手段改造外源基因中的信號(hào)肽，增強(qiáng)外源蛋白的分泌能力也是研究的主流方向［6-7］，但此法技術(shù)難度高、處理步驟復(fù)雜。相比之下，采用傳統(tǒng)的遺傳育種方式篩選條件致死突變株顯得更為安全、簡便。條件致死突變株的突變位點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生在細(xì)胞壁(膜)的相關(guān)基因上，導(dǎo)致其在相應(yīng)的條件下細(xì)胞通透性增大，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自溶，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外［8］。目前，常見的條件致死酵母菌株主要有三類：溫度敏感突變株［8］、高滲脅迫突變株［9］以及低滲敏感突變株［10］。課題組［11］前期研究過程中以釀酒酵母Y1為出發(fā)菌株，誘變選育出一株溫度敏感突變酵母菌Ts4,37°C培養(yǎng)時(shí)其胞內(nèi)大分子物質(zhì)分泌能力明顯提升，證明了條件致死突變株能有效釋放胞內(nèi)產(chǎn)物?；诖?，本研究擬繼續(xù)對釀酒酵母Y1進(jìn)行誘變處理，采用等滲、低滲培養(yǎng)基對比培養(yǎng)進(jìn)行初篩，再以胞外1、6-二磷酸果糖(Fructose-1,6-diphosphate,FDP)濃度及胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸滲透率為復(fù)篩指標(biāo)，篩選出具有高蛋白外泌水平的低滲敏感性突變株(Hypotonic-sensitivemutant,Hs)，旨在豐富釀酒酵母條件致死菌株類型，并為快速構(gòu)建有效釋放胞內(nèi)產(chǎn)物的宿主系統(tǒng)提供更為簡單有效的方法。1.1材料1.1.1菌種釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)Y1:長沙理工大學(xué)食品與發(fā)酵研究所分離并保藏。1.1.2培養(yǎng)基活化斜面培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基［12］242；生孢子培養(yǎng)基：Meclary培養(yǎng)基［12］244；種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)液［13］；YEPDK培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加4.5%KCl；YEPDS+K培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加4.5%KCl和0.004%十二烷基磺酸鈉(SDS)；YEPS培養(yǎng)基：用蔗糖代替YEPD培養(yǎng)基中的葡萄糖；YEPDS培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加0.004%十二烷基磺酸鈉(SDS)；發(fā)酵培養(yǎng)基：在YEPDS培養(yǎng)液中添加0.2%MgCl2。1.1.3儀器顯微成像系統(tǒng)：EclipseE200型，尼康儀器(上海)有限公司；紫外分光光度計(jì)：UV1800型，日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：ZWY-2102C型，上海智城分析儀器制造有限公司；高速離心機(jī)：臺(tái)式TGL-16G型，常州諾基儀器有限公司。1.2方法1.2.1菌懸液的制備菌株Y1在28°C、160r/min下培養(yǎng)12h，無菌生理鹽水離心洗滌3次，制成108CFU/mL的菌懸液備用。1.2.2紫外誘變及突變株的篩選根據(jù)文獻(xiàn)［11］，對Y1菌的二倍體（2捫及單倍體⑴）菌懸液進(jìn)行紫外誘變，將誘變后的酵母菌懸液梯度稀釋，影印接種于YEPDK、YEPDS平板上，28°C、培養(yǎng)48h。挑選在YEPDK上正常生長，而在YEPDS上微生長或不生長的突變株進(jìn)入復(fù)篩；取初篩挑選的菌株依次接種于YEPD、YEPDK、YEPDS、YEPS、YEPDS+K平板上，再次篩選低滲透壓時(shí)微生長或不長的菌株［2］。1.2.3FDP含量的測定參考文獻(xiàn)［14］,并采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算發(fā)酵液菌體濃度，以每毫升發(fā)酵液中107個(gè)細(xì)胞計(jì)算FDP含量。1.2.4酵母核酸、蛋白質(zhì)滲透率的測定取篩選獲得的突變株依次進(jìn)行活化、種子培養(yǎng)基培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)（培養(yǎng)3h時(shí)添加SDS0.04g/L）。取兩份發(fā)酵液，其中一份采用紫外分光光度法直接測定菌體密度（OD600）,另一份先80C水浴5min，再10000r/min離心20min，取上清液，分別測定OD260、OD280，按式（1）、（2）計(jì)算胞外核酸滲透率（LD260）、蛋白質(zhì)滲透率（LD280）。LD260=,LD280=。2.1酵母子囊孢子的制備通常條件下酵母細(xì)胞以二倍體的形式存在，進(jìn)行出芽生殖，但在特殊條件誘導(dǎo)下（以醋酸鈉為唯一碳源，缺乏氮源），可以進(jìn)行有性繁殖，產(chǎn)生2~4個(gè)單倍體有性孢子［15］，即子囊孢子，釀酒酵母產(chǎn)生的子囊孢子是人工選育優(yōu)良雜交酵母菌株的重要基因純核系來源［16］。將釀酒酵母Y1二倍體（2門）接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)一周，篩選獲得其單倍體0，并通過顯微鏡下觀察，檢驗(yàn)其二倍體生孢子情況，孔雀綠一番紅染色后見圖1?？梢钥闯觯邴?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，Y1二倍體（2捫營養(yǎng)細(xì)胞易轉(zhuǎn)變生成子囊，這時(shí)細(xì)胞核進(jìn)行減數(shù)分裂，形成子囊孢子。釀酒酵母的營養(yǎng)體多以二倍體(2n)的形式存在，但其單倍體(n)的突變率相對較高，且單倍體⑴)突變株經(jīng)重新結(jié)合形成二倍體(2捫后，誘變所獲得的性狀才能較穩(wěn)定地遺傳下去［17］。因此，同時(shí)以酵母二倍體(2捫、單倍體0為出發(fā)菌株，采用紫外線對菌株Y1的二倍^體(2n)及單倍體⑴)菌株分別照射30s，4.5min，利用影印培養(yǎng)法對等滲及低滲條件下菌株的生長狀況進(jìn)行對比初篩，獲得低滲敏感性突變株，結(jié)果見圖2及表1、2。由圖2可知，圓圈標(biāo)出的突變株在等滲培養(yǎng)條件下(YEPDK培養(yǎng))生長正常，但在低滲培養(yǎng)條件下(YEPDS培養(yǎng))生長微弱甚至無法生長；表1、2顯示，根據(jù)等滲平板與低滲透平板菌落生長對照情況，篩選出8株二倍體(2捫、7株單倍體⑴)低滲敏感性突變株。低滲培養(yǎng)基(YEPDS)中添加了表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，SDS能形成低滲環(huán)境，并作用于細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外，進(jìn)而引起酵母細(xì)胞的自溶［18］。由表1、2可知，出發(fā)菌株Y1(2n，n)在等滲培養(yǎng)基(YEPDK)、等滲保護(hù)培養(yǎng)基(YEPDS+K)、低滲培養(yǎng)基1(YEPS)及低滲培養(yǎng)基2(YEPDS)中均能生長，說明其不具有低滲敏感性。而Hs1、Hs2*、Hs5*3株突變株在YEPDK上均生長旺盛，在低滲培養(yǎng)基(YEPDS)上則生長被抑制，且當(dāng)在低滲培養(yǎng)基中添加4.5%氯化鉀(YEPDS+K)后3株突變株的生長均得到部分恢復(fù)，因此選擇突變株Hs1、Hs2*、Hs5*作進(jìn)一步分析。對比發(fā)現(xiàn)，Hs1、Hs2*、Hs5*存在一些特性差異，在酵母菌常規(guī)培養(yǎng)基(YEPD)上，Hs1、Hs2*生長狀況一般，而Hs5*生長茂盛，說明常規(guī)條件下Hs5*更易繁殖；在低滲條件相對較弱的培養(yǎng)基(YEPS)上Hs1、Hs5*生長微弱，而Hs2*則正常生長，說明Hs1、Hs5*的滲透壓敏感性強(qiáng)于Hs2*，因此，初步推測Hs1、Hs2*、Hs5*為低滲敏感性突變株，且Hs5*在低滲時(shí)更易發(fā)生自溶。2.3低滲敏感性突變株自溶程度考察2.3.1低滲敏感性突變株胞外FDP測定FDP是酵母細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑中的中間產(chǎn)物，由于其不斷參與代謝反應(yīng)所以存在時(shí)間非常短。正常情況下，未經(jīng)處理的細(xì)胞其通透性較差，F(xiàn)DP在胞外很難得到積累［19］，而低滲敏感性突變株在低滲條件下細(xì)胞的通透性發(fā)生改變，培養(yǎng)液中FDP的濃度升高，因此FDP是衡量酵母細(xì)胞低滲敏感程度的重要指標(biāo)。測定釀酒酵母及其突變株在低滲條件下培養(yǎng)2h時(shí)的菌體濃度及其胞外FDP濃度，菌體濃度以數(shù)量級(jí)107個(gè)為單位，計(jì)算出FDP在發(fā)酵液中的濃度，結(jié)果見圖3、4。由圖3可知，在釀酒酵母二倍體突變株中，Hs1胞外FDP含量最高，為出發(fā)菌株的1.55倍，說明二倍體突變株中Hs1的滲透壓敏感性最強(qiáng)。由圖4可知，在釀酒酵母單倍體突變株中，Hs2*、Hs5*的胞外FDP濃度明顯高于其它菌株，分別為出發(fā)菌株的1.94、2.37倍。由圖3、4可以確定Hs1、Hs2*、Hs5*3株突變株為低滲敏感性突變株，其中Hs5*低滲敏感性最強(qiáng)，其細(xì)胞外FDP濃度達(dá)25.82pg/mLo2.3.2低滲敏感性突變株核酸、蛋白質(zhì)胞外滲透率測定正常情況下難以分泌到胞外的大分子物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)滲透率也是可以衡量酵母細(xì)胞自溶程度的重要指標(biāo)。對比分析添加SDS前后突變株Hs1、Hs2*、Hs5*以及發(fā)菌株Y1的核酸、蛋白質(zhì)滲透率，結(jié)果見圖5、6。由圖5、6可知，突變株Hs1、Hs2*、Hs5*核酸、蛋白質(zhì)滲透率均明顯大于出發(fā)菌株，說明紫外誘變導(dǎo)致突變株的細(xì)胞壁/膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，當(dāng)其處于低滲環(huán)境時(shí)會(huì)出現(xiàn)適度自溶，因此胞外大分子物質(zhì)含量增大。此外從圖5、6還可以看出，出發(fā)菌株Y1在添加SDS前后的核酸、蛋白質(zhì)滲透率變化很小，而突變株核酸、蛋白質(zhì)的滲透率隨著添加SDS發(fā)酵時(shí)間的延長而越來越高，其原因是突變株在低滲環(huán)境中生長微弱，同時(shí)細(xì)胞溶脹作用引起了膜不可逆的破壞，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的外泌［20］。其中Hs5*大分子滲透率最大，發(fā)酵6h時(shí)，其胞外核酸、蛋白質(zhì)滲透率分別達(dá)2.07,1.86，為出發(fā)菌株的3.22倍及3.64倍。由此證明突變株Hs1、Hs2*、Hs5*屬于具有大分子外泌能力的低滲敏感性突變株，且Hs5*在低滲條件下展現(xiàn)出最強(qiáng)的外泌特性。釀酒酵母作為外源基因最理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，其細(xì)胞通透性對胞內(nèi)產(chǎn)物的有效釋放具有重要意義。通過簡單的誘變處理，利用低滲培養(yǎng)基定向篩選出3株低滲敏感性自溶突變株，即Hs1、Hs2*、Hs5*。對比其低滲條件下自溶程度可以發(fā)現(xiàn)：Hs5*突變株自溶程度最高，其胞外FDP濃度達(dá)25.82pg/mL,為出發(fā)菌株的2.37倍，核酸及蛋白質(zhì)滲透率分別為2.07,1.86，為出發(fā)菌株的3.22倍及3.64倍，可以較大程度地提高釀酒酵母對外源蛋白的分泌能力。將低滲敏感突變株Hs5*與前期篩選的溫度敏感突變株Ts4對比分析發(fā)現(xiàn)Hs5*具有更強(qiáng)的胞內(nèi)物質(zhì)釋放能力。溫度和滲透壓在微生物培養(yǎng)中都是易于控制的條件，篩選對滲透壓、溫度敏感性強(qiáng)的目標(biāo)菌株，有利于簡化胞內(nèi)產(chǎn)物的提取工藝，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】何秀萍.國內(nèi)釀酒酵母分子遺傳與育種研究40年[J].微生物學(xué)通報(bào),2014,41(3):450-458.何秀萍，劉增然,劉春秀，等.酵母菌細(xì)胞自溶突變株的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2003,43(2):283287.GANEVAV,GALUTOVB,TEISSIEJ.Highyieldelectroextractionofproteinsfromyeastbyaflowprocess[J].AnalyticalBiochemistry,2003,315(1):77-84.FONSECARAS,RAFAELRS,KALILSJ,etal.DifferentcelldisruptionmethodsforastaxanthinrecoverybyPhaffiarhodozyma[J].AfricanJournalofBiotechnology,2011,10(7):1165-1171.ROLLINIM,MUSATTIA,MANZONIM.ProductionofglutathioneinextracellularformbySaccharomycescerevisiae[J].ProcessBiochemistry,2010,45(4):441-445.暴立娟,宋慶鳳,李杰.重組木聚糖酶的安全高效表達(dá)與應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2011(1):156-158.SUDAY,RODRIGUEZRK,COLUCCIOAE,etal.Ascreenforsporewallpermeabilitymutantsidentifiesasecretedproteaserequiredforpropersporewallassembly[J].PLoSOne,2009,4(9):e7184.郭科,周兵.酵母Ndilp突變表達(dá)文庫的建立和溫度敏感株的篩選[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2012,28(10):966-970.彭酈,曾新安.高糖脅迫對生長期釀酒酵母生理代謝的影響[J].現(xiàn)代食品科技,2011,27(4):397-399.SHIMIZUJ,Y