講基因工程操作程序課件

講基因工程操作程序課件第一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序的步驟：目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一閱讀與思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過(guò)程分別是怎樣的？第三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、目的基因的獲取1、目的基因概念：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、目的基因獲取方法：從基因文庫(kù)中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因化學(xué)方法直接人工合成第四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一從基因文庫(kù)中獲取目的基因基因文庫(kù)：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）第五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因組文庫(kù)限制酶供體細(xì)胞的全部DNA大量DNA片段拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增第六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程mRNA單鏈DNA

雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA文庫(kù)第七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一如何從基因文庫(kù)中找到所需要的基因？依據(jù)目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。從基因文庫(kù)中獲取目的基因第八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第九頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR的全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的原理：

DNA復(fù)制

PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。第十頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一模板原料引物酶控制溫度利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧核苷酸——如單鏈DNA分子片段——耐熱的DNA聚合酶——PCR儀自動(dòng)調(diào)控PCR的條件：第十一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一PCR的過(guò)程：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因變性(90-95℃)復(fù)性(55-60℃)(退火）延伸(70-75℃)第十二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一用化學(xué)方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。第十三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心用切目的基因相同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒第十四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心第十五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心目的基因第十六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心1、基因表達(dá)載體的組成目的基因啟動(dòng)子:終止子:標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段。位于基因的尾端。第十七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一啟動(dòng)子的作用：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心終止子作用：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。標(biāo)記基因作用：是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，如青霉素基因。

是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。第十八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：a.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。b.使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第十九頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1、什么是轉(zhuǎn)化？

2、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是什么？具體過(guò)程是怎樣的？

3、目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？

4、目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？第二十頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法農(nóng)桿菌的特點(diǎn):a.易感染雙子葉植物和祼子植物。b.具有趨化性。c.Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的導(dǎo)入過(guò)程:構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一２.目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法:

顯微注射技術(shù)操作程序：三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞a.先提純含目的基因的表達(dá)載體b.從動(dòng)物體內(nèi)取出卵(受精卵）c.顯微注射儀進(jìn)行顯微注射d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個(gè)體第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物的特點(diǎn):繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過(guò)程:用Ca2+處理細(xì)胞增加細(xì)胞壁的透性，與細(xì)胞膜無(wú)關(guān)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→

感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1、導(dǎo)入目的基因后需要檢測(cè)哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探針？檢測(cè)時(shí)的DNA探針通過(guò)什么原理來(lái)檢測(cè)目的基因和相應(yīng)的mRNA？3、利用抗體－抗原雜交檢測(cè)的原理是什么？第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體的DNA上目的基因的檢測(cè)內(nèi)容和方法檢測(cè)方法:DNA分子雜交技術(shù)DNA探針：用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第二十七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一DNA分子雜交技術(shù)基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于對(duì)待測(cè)核酸樣品中特定基因順序的探測(cè)。滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測(cè)出來(lái)的標(biāo)記物。第二十八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA目的基因的檢測(cè)