銀耳多糖成分資料

文獻：銀耳抱糖的化學結(jié)構(gòu)初步研究及其免疫活性112分離純化銀耳抱糖1kg，加水配成5%的溶液，充分攪拌，離心(3000r?min-1)，除去色素等雜質(zhì)，離心(1000r?min-1),離心液攪拌下加乙醇至60%,離心，離心液加乙醇至醇濃度為80%,離心,收集沉淀，干燥，即得粗多糖100g。取粗多糖10g，加水溶解，經(jīng)DEAE2Sephadex2A50離子交換柱，依次用蒸餾水、012mol?L-1、014mol?L-1、018mol?L-1、2mol?L-1NaCL溶液洗脫，分別收集各洗脫液，透析,干燥。將012mol-L-1部分稱為TSP22。對TSP22經(jīng)SephadexG2150進一步純化，分別得至UTSP22a?TSP22c。純度鑒定及分子量測定采用標準葡聚糖DextranT系列在下述色譜條件下制作標準曲線，然后測定TSP22a?TSP22C在相同色譜條件下的色譜圖及保留時間，從標準曲線上求出各多糖的分子量，此過程由GPC軟件完成。流動相為017%的硫酸鈉,流速為015mL-min-1,柱溫30±011°C。理化性質(zhì)及組成糖分析［2］1121211理化性質(zhì)測定總糖含量以酚-硫酸法測定，糖醛酸以間羥基聯(lián)苯方法測定，蛋白質(zhì)含量以lowry法測定。1121212組成糖分析取TSP22a?TSP22C各10mg，加2mol-L-1三氟乙酸1mL,溶解，密封，于121C烘箱中水解115h吹干,殘渣加1mL甲醇吹干，反復3次，加水015mL溶解,加硼氫化鈉20mg，室溫放置115h不時振蕩，滴加醋酸至無氣泡產(chǎn)生，吹干。殘渣加10%醋酸甲醇溶液1mL,吹干，反復3次，殘渣置五氧化二磷真空干燥器中過夜。殘渣加毗啶015mL,醋酐1mL,密封，置121C烘箱中3h,放至室溫，吹干。加3mL水使溶解，用氯仿萃取3次,氯仿層吹干，作為中性糖供試品溶液，進行GC檢測。酸性糖的還原，將TSP22a?TSP22C水解后吹干,置真空干燥箱80C減壓干燥2h，置五氧化二磷真空干燥器中過夜使成內(nèi)酯后，再加硼氫化鈉還原，以下操作同中性糖部分。樣品進行GC檢測，與標準糖醇衍生物對比,確定單糖的種類。甲基化分析取TSP22a?TSP22C各20mg,第一部分甲基化按文獻［3］進行，衍生物通過GC2MS檢測。第二部分取少量第一部分甲基化樣品，加氘代四氫鋁鋰還原液［4］,充氮氣，密封,80°。水浴回流16h，放至室溫,滴加稀鹽酸至無氣泡，反應液充氮氣離心，取上清液吹干，按組成糖分析方法制備乙?；苌铮ㄟ^GC2MS檢測，確定糖苷鍵連接位置。放射免疫法定量細胞因子放射免疫試管一套,每份設3副平行管，第一天,每支試管中加入100^不同濃度的標準細胞因子和TSP22、TSP22a?TSP22C，并加入100^細胞因子抗體，最后加入300pl013%正常家兔血清，振蕩。第二天每支試管加入100pl125I標記的細胞因子。第三天每支試管中加入700pl含6%PEG和2%放射免疫緩沖液，待反應完全后,離心，棄去上清，放置過夜。測定沉淀物的放射性，從標準曲線上查出TSP22和TSP22a?TSP22C的細胞因子含量。2結(jié)果與討論銀耳抱糖經(jīng)離子交換、凝膠色譜法分離純化得到TSP22a?TSP22C，并對其進行純度分析及分子量測定。SepharoseCL26B柱層析表明，TSP22a?TSP22C均為單峰;HPGPC分析的結(jié)果表明，TSP22a?TSP22C均為單一對稱峰，表明他們?yōu)榫欢嗵?。用標準葡聚糖DextranT系列制作校正曲線。測得TSP22a?TSP22C分子量分別為1100kD、500kD、400kD。舊光譜中,3組分在1733Cm-1處的肩峰為C=O的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰，提示可能都含有糖醛酸。并在810及870Cm-1處均出現(xiàn)甘露糖的特征吸收峰，表明含有甘露糖。組成糖分析結(jié)果表明,TSP22a?TSP22C是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖4種糖組成。還原后的TSP22a?TSP22C重新進行組成糖分析，結(jié)果表明，還原后的TSP22a?TSP22C組成糖沒有變化，但各單糖殘基的摩爾比發(fā)生了變化，其中葡萄糖的含量明顯增加，結(jié)合GC及舊光譜分析,TSP22a?TSP22C中應含有葡萄糖醛酸。其還原前后的摩爾百分比見表1。3種均一多糖的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)的含量見表2。甲基化分兩部分進行，第一部分確定中性糖部分糖苷鍵的連接方式。第二部分確定糖醛酸的連接方式。TSP22a?TSP22C經(jīng)2次甲基化后，舊譜檢測,300023600cm21處的羥基峰基本消失，相反2900Cm-1處的甲基特征吸收峰顯著增大,表明甲基化已完全。第一部分取少量完全甲基化樣品,經(jīng)水解、還原、乙?；苽涑刹糠旨谆糠忠阴；苌?GC2MS分析以確定中性糖部分糖苷鍵的連接方式，結(jié)果見表3。3種多糖均以(1-3)2D2Man為主鏈,部分Man以非還原形式處于末端(terminal)。并含有大量的分枝,主要在2202,4202,2,42di202分枝。在TSP22a?TSP22C中,Fuc(p)及部分Xyl(p)以非還原形式存在于terminal。第二部分取完全甲基化以后剩余的樣品經(jīng)還原液(氘代四氫鋁鋰)還原糖醛酸后借助舊光譜分析,結(jié)果顯示在1728Cm-1處的C=O吸收峰消失,說明糖醛酸的羧基已被還原，經(jīng)水解、還原、乙?；苽涑刹糠旨谆糠忠阴；苌?。還原后的TSP22a-TSP22C在MS的碎片峰出現(xiàn)氘代的特征碎片101、117、129、161、191、235。此結(jié)果應是1,5,62三乙?；?,3,42三甲基葡萄糖26,62d2的峰，此峰在還原前的GC2MS圖中沒有出現(xiàn)，進一步證明了葡萄糖醛酸位于非還原末端。結(jié)果見表3。TSP22、TSP22a?TSP22C對細胞因子的影響結(jié)果見表4,各組分在不同程度上都能刺激人外周單核細胞產(chǎn)生IL21a、IL26和IL28的數(shù)量增加，且呈劑量依賴性，與陽性對照LPS相比,TSP22和TSP22a?TSP22C高劑量組的刺激作用要明顯高于LPS。表明它們均可不同程度地促進細胞因子分泌，并顯示出活性的強弱與分子量大小無關(guān)。文獻：銀耳多糖的提取及其清除自由基作用銀耳多糖的精制將以上得到的銀耳粗多糖加水溶解成接近飽和狀態(tài)，以8000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘去除少量不溶物.再次醇析，可提高多糖的純度.也可分級加入乙醇，既可純化多糖又可使不同分子量和性質(zhì)的多糖達到進一步分離目的.去除雜蛋白、色素按表1步驟操作.將去除雜蛋白、色素的多糖溶液裝入預先處理好的透析袋，先用自來水透析24小時，再用蒸餾水透析12小時，然后醇析，干燥備用.文獻：銀耳多糖結(jié)構(gòu)與生物活性研究進展1銀耳多糖結(jié)構(gòu)特征銀耳多糖是以o-(1一3)-D-甘露糖為主鏈的雜多糖，在子實體、抱子、發(fā)酵液和細胞壁中都有存在，其組成單糖有葡萄糖、甘露糖、果糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖醛酸，目前研究較多的是子實體和抱子多糖，且主要側(cè)重于單糖組成、相對分子質(zhì)量和支鏈等方面的研究。1.1子實體多糖1.1.1子實體酸性雜多糖酸性雜多糖中含有特征性葡萄糖醛酸殘基，多種單糖以不同物質(zhì)的量比存在，多糖相對分子質(zhì)量大小不一，支鏈與主鏈甘露糖的C2.C4或C6相連。首先從銀耳子實體的水提取物中分離到3種具有抗腫瘤作用的酸性雜多糖A、B、C，主要由木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸組成，含有少量的葡萄糖、微量巖藻糖。A、B均含有O-乙?；Y(jié)構(gòu)，多曲相對分子質(zhì)量為4.7x105,木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖(含少量葡萄糖)物質(zhì)的量比為1.5:1:3.7［2］。后來，Ukai等［3］在證明子實體中酸性雜多糖入0BC結(jié)構(gòu)的過程中，用硫酸水解法得到3種均質(zhì)的酸性低聚糖(H-1、H-2和H-3)。20世紀80年代，中國學者夏爾寧等［4］從銀耳子實體中提取一種相對分子質(zhì)量為1.15x105的多糖，是由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，其物質(zhì)的量比為0.92:0.49:0.18:1.00:1.15:0.57，其中總糖含量為75.7%，葡萄糖醛酸含量14.7%。Gao等［5-7］從銀耳子實體中提取多種酸性多糖T1a-T1c、T2a-T2d、T3a-T3d，相對分子質(zhì)量大小不等，均是以(1-3)-甘露糖為主鏈，葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和葡萄糖醛酸組成的支鏈通過O-2、O-4或O-6連接在主鏈上。銀耳子實體酸性多糖高級結(jié)構(gòu)也有研究，Yui等［8］提取的多糖一級結(jié)構(gòu)是以a-D-甘露糖為主鏈，/3-D-木糖、/3-D-葡萄糖酸、p-D-木二糖與主鏈甘露糖的C2連接的，主鏈具有左旋三重螺旋對稱結(jié)構(gòu)，6個甘露糖殘基及3個側(cè)鏈基團沿中心軸2.42nm形成一個重復單位。1.1.2子實體中性雜多糖從銀耳子實體中分離出的一種堿溶性中性雜多糖為無色粉末，其相對分子質(zhì)量為8000，聚合度46，主要由木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成，物質(zhì)的量比大約為2:4:5:35［9］。1.2抱子多糖銀耳抱子可以通過固體培養(yǎng)或深層液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得，抱子多糖結(jié)構(gòu)特點與子實體多糖極其相似。1.2.1抱子酸性雜多糖從固體培養(yǎng)法獲得的中國福建產(chǎn)銀耳抱子中提取、分離得到3種均一體多糖，分別命名為TF-A、TF-B、TF-C，相對分子質(zhì)量分別為7.6x104、7.6x104、7.0x104。TF-A由L巖藻糖、L阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比是0.29:0.037:0.33:1.0:0.75:1.06。TF-B和TF-C由L巖藻糖、L阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，物質(zhì)的量比為0.73:0.036:0.28:1.0:0.16:0.19和0.75:0.058:0.37:1.0:0.086:0.37［10］。最近，姜瑞芝等［11］從銀耳抱子中分離純化出3種均一酸性雜多糖丁SP2a-TSP2c，其分子質(zhì)量分別為1100、500、400kD，組成糖為巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸，TSP2a-TSP2c均是以(1-3)-D-甘露糖為主鏈，并在O-2,O-4，O-6位上有多分枝結(jié)構(gòu)復雜的酸性多糖。1.2.2抱子中性雜多糖用堿提取法得到銀耳抱子中性多糖A-BTF，其相對分子質(zhì)量為6.7x104,主鏈由1,6連接的葡萄糖和1,3,6連接的甘露糖組成，分支點在甘露糖上，側(cè)鏈由1,4連接的葡萄糖，1,6連接的半乳糖和2,3,5,1-NH2-來蘇糖，及端基連接的葡萄糖組成［12］。另外，用水提取法得到相對分子質(zhì)量為7.3x104的銀耳抱子多糖TFA，主鏈由1,6連接的半乳糖和1,3,6連接的甘露糖組成，分支點在甘露糖上，側(cè)鏈由1,2,4鏈接的甘露糖、2個七碳糖組成，末端為端基連接的甘露糖和葡萄糖，其中半乳糖、甘露糖、葡萄糖和2個七碳糖物質(zhì)的量比接近7:3:1:1:1［13］。1.3胞外多糖在菌株T-19和T-7酵母狀細胞培養(yǎng)液中分離到2種多糖，與其子實體多糖的主鏈均是以a-(l-3)-D-甘露糖為主鏈，都有P-D-葡萄糖醛酸殘基、P-(1-2)-D-木糖殘基或短鏈連接在主鏈甘露糖C2位。2種胞外多糖中D-葡糖醛酸、D-木糖和D-甘露糖物質(zhì)的量比為：1.3:1.0:3.5(「7)和0.8:1.0:2.1(「19)，另外含有少量子實體多糖所沒有的L巖藻