選專題基因工程的基本操作程序

選專題基因工程的基本操作程序第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二知識點一：1.原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.(以模板轉錄然后脫落)第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內含子：外顯子：知識點一：2.真核細胞的基因結構第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結合位點等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內含子第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定知識點二.基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質的結構基因請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成請閱讀P9第一和二兩段第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中直接獲取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫5.基因文庫的構建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉錄酶DNA聚合酶反轉錄法：cDNA的合成流程圖解5.基因文庫的構建方法之第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二

概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段原理：DNA復制2、利用PCR技術擴增目的基因第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二

過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）重復循環(huán)第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2、具體過程第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二PCR(多聚酶鏈式反應) 第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二PCR擴增儀第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二二、基因表達載體的構建

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2、基因表達載體的構建過程第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2、基因表達載體的構建的過程質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二3、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二常用的受體細胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。三、將目的基因導入受體細胞第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二三、將目的基因導入受體細胞（一）轉化：（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1、將目的基因導入植物細胞的方法：（1）農桿菌轉化法

①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質粒上的T---DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二③過程：目的基因插入Ti質粒的T-DNA上重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二（2）基因槍法（3）花粉管通道法第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二3、將目的基因導入微生物細胞①原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少②方法：

用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二（一）、檢測1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關鍵步驟)①.首先取出轉基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針③.使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二（二）、鑒定（個體生物學水平）2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:

用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二目的基因的表達和檢測接種實驗抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉基因特征個體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉錄目的基因是否導入分子水平方法檢測對象第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯鑒定：第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa第四十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和