第六章分子發(fā)光分析課件

(MolecularLuminescenceAnalysis)第6章分子發(fā)光分析法第6章紅外吸收光譜法

6.1熒光分析法

6.2磷光分析法6.3化學(xué)發(fā)光分析法MolecularFluorescenceAnalysisMolecularphosphorescenceAnalysis

分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量(電、熱、化學(xué)和光能等)被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。

發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。物質(zhì)吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱之為熒光和磷光。MolecularFluorescenceAnalysis

一、概述

分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。

6.1熒光分法分子發(fā)光光譜

分子發(fā)光光譜包括熒光光譜、磷光光譜和化學(xué)發(fā)光光譜。

熒光和磷光為光致發(fā)光，是物質(zhì)的基態(tài)分子吸收一定波長(zhǎng)范圍的光輻射激發(fā)至單重激發(fā)態(tài)，當(dāng)其由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的二次輻射。

熒光由單重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷產(chǎn)生。

磷光由單重激發(fā)態(tài)先過(guò)渡到三重激發(fā)態(tài)，然后由三重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷向基態(tài)躍遷產(chǎn)生。

化學(xué)發(fā)光是化學(xué)反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物受反應(yīng)釋放的化學(xué)能激發(fā)而產(chǎn)生的光輻射。當(dāng)n,L,S三個(gè)量子數(shù)確定之后，原子能級(jí)就基本確定了。用n、L、S三個(gè)量子數(shù)描述原子能級(jí)的光譜項(xiàng)（n2S+1L）。L與S相互作用，可產(chǎn)生2S+1個(gè)能級(jí)稍微不同的分裂，是產(chǎn)生光譜多重線的原因。M=2S+1叫做譜線的多重性。習(xí)慣上將多重性為1、2、3的光譜項(xiàng)分別稱為單重態(tài)、雙重態(tài)、三重態(tài)。光譜項(xiàng)與光譜支項(xiàng)熒光分析的特點(diǎn)：靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在0.10.001g/mL之間。比UV-Vis的靈敏度高得多。

選擇性好：可同時(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。應(yīng)用不廣泛：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對(duì)熒光量子效率影響大、干擾測(cè)量的因素較多。紫外可見(jiàn)分光光度法的特點(diǎn)(一)靈敏度高

吸光光度法測(cè)定物質(zhì)的濃度下限(最低濃度)一般可達(dá)1~10-3%的微量組分。對(duì)固體試樣一般可測(cè)到10-4~10-5%的痕量組分。如果對(duì)被測(cè)組分事先加以富集，靈敏度還可以提高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。二、基本原理

(一)分子熒光的產(chǎn)生

處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對(duì)，其自旋方向相反，當(dāng)其中一個(gè)電子被激發(fā)時(shí)，通常躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級(jí)更高的單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)具有較低能級(jí)。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s;而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上(通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài))。

根據(jù)量子力學(xué)的原理，電子的躍遷不能在任意兩個(gè)能級(jí)之間進(jìn)行，而必須遵循一定的“選擇定則”，這個(gè)定則是①△L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但當(dāng)J=0時(shí)，△J=0的躍遷是不允許的。不符合光譜選擇定則的躍遷叫禁戒躍遷。若兩光譜項(xiàng)之間為禁戒躍遷，處于較高能級(jí)的原子具有較長(zhǎng)的壽命，原子的這種狀態(tài)稱為亞穩(wěn)態(tài)。光譜選擇定則基態(tài)：電子自旋配對(duì)，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級(jí)低于單重態(tài)(Hund規(guī)則)圖6.1分子內(nèi)的光物理過(guò)程

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無(wú)輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動(dòng)弛豫(VR)、內(nèi)部轉(zhuǎn)移(IR)、系間竄躍(IX)及外部轉(zhuǎn)移(EC)等，各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。（二）去活化過(guò)程(Deactivation)

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過(guò)輻射或非輻射躍遷等去活化過(guò)程返回至基態(tài)。這些過(guò)程包括：1)振動(dòng)弛豫(VibrationalRelaxation，VR)

在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過(guò)程，稱為振動(dòng)弛豫。熒光、磷光能級(jí)圖

→振動(dòng)弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振動(dòng)弛豫在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。2)內(nèi)轉(zhuǎn)化(

InternalConversion，IC)

對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng)耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。S0S1S2T1吸光1吸光2內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光、磷光能級(jí)圖3)熒光發(fā)射

處于第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的電子躍遷至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)(S0)時(shí)，將得到最大波長(zhǎng)為3的熒光。

注意：

基態(tài)中也有振動(dòng)馳豫躍遷。很明顯，3的波長(zhǎng)較激發(fā)波長(zhǎng)1或2都長(zhǎng)，而且不論電子開(kāi)始被激發(fā)至什么高能級(jí)，最終將只發(fā)射出波長(zhǎng)為3的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-7-10-9s內(nèi)完成。熒光、磷光能級(jí)圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3熒光4)系間竄躍

指不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。

有時(shí)，通過(guò)熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。熒光、磷光能級(jí)圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3系間竄躍5)外轉(zhuǎn)換(ExternalConversion，EC)

受激分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過(guò)程，也稱“熄滅”或“猝滅”。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（三）熒光效率及其影響因素

熒光量子產(chǎn)率(熒光效率或量子效率)，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，常用下式表示?；?發(fā)射熒光量子數(shù)/吸收熒光量子數(shù)。

在產(chǎn)生熒光的過(guò)程中，涉及到許多輻射和無(wú)輻射躍遷過(guò)程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)移、系間竄躍和外轉(zhuǎn)移等。很明顯，熒光的量子產(chǎn)率，將與上述每一個(gè)過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)。若用數(shù)學(xué)式來(lái)表達(dá)這些關(guān)系，得到

=kf

/(kf+ki)

式中:

kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，ki為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和。

凡是能使kf

值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。

實(shí)際上，對(duì)于高熒光分子，例如熒光素，其量子產(chǎn)率在某些情況下接近1，說(shuō)明ki很小，可以忽略不計(jì)。

一般來(lái)說(shuō)，kf主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而ki則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。磷光的量子產(chǎn)率與此類似。

分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：

①分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。(1)躍遷類型

對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)：

首先，經(jīng)歷或n激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生或n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，躍遷常能發(fā)出較強(qiáng)的熒光(較大)。這是由于躍遷具有較大的(一般比n大100-1000倍)。其次，躍遷的壽命約為10-7~10-9s，比n躍遷的壽命10-5—10-7s要短。在各種躍遷過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)中，它是有利于發(fā)射熒光的。此外，在躍遷過(guò)程中，通過(guò)系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小。(S1T1能級(jí)差較大)，這也有利于熒光的發(fā)射。

總之，躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。(2)共軛效應(yīng)

容易實(shí)現(xiàn)激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少(僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外)。此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。

例如：在多烯結(jié)構(gòu)中，Ph(CH=CH)3Ph和Ph(CH=CH)2Ph在苯中的分別為0.68和0.28。

共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)的原因：

主要是由于增大熒光物質(zhì)的

，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。(3)剛性平面結(jié)構(gòu)

多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。(4)取代基效應(yīng)

芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對(duì)該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。給電子基團(tuán)，如-OH、-OR、-CN、-NH2

、-NR2等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)楫a(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團(tuán)，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，會(huì)減弱甚至?xí)鐭晒狻?/p>

鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可能是由所謂“重原子效應(yīng)”使系間竄躍速率增加所致。在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的概率。

取代基的空間障礙對(duì)熒光也有影響。

立體異構(gòu)現(xiàn)象對(duì)熒光強(qiáng)度有顯著的影響。四、金屬螯合物的熒光

除過(guò)渡元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。(1)螯合物中配位體的發(fā)光

不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光。

如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強(qiáng)的熒光。(2)螯合物中金屬離子的特征熒光

這類發(fā)光過(guò)程通常是螯合物首先通過(guò)配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)給金屬離子，導(dǎo)致dd*躍遷和ff*躍遷，最終發(fā)射的是dd*躍遷和ff*躍遷光譜。35例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯五、影響熒光強(qiáng)度的因素(環(huán)境因素）①溶劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。

一般溶劑效應(yīng)指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。特殊溶劑效應(yīng)指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用，如氫鍵的生成和化合作用。

一般溶劑效應(yīng)是普遍的，而特殊溶劑效應(yīng)則決定于溶劑和熒光體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。特殊溶劑效應(yīng)所引起熒光光譜的移動(dòng)值，往往大于一般溶劑效應(yīng)所引起的影響。由于溶質(zhì)分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜可能會(huì)有顯著不同。有的情況，增大溶劑的極性，將使n躍遷的能量增大，躍遷的能量減小，而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光峰紅移。

但也有相反的情況，例如，苯胺、萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減小，熒光峰藍(lán)移。因此熒光光譜的位置和強(qiáng)度與溶劑極性之間的關(guān)系，應(yīng)根據(jù)熒光物質(zhì)與溶劑的不同而異。

如果溶劑和熒光物質(zhì)形成了化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電力狀態(tài)改變，則熒光峰位和強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生較大的變化。②溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

溫度上升使熒光強(qiáng)度下降。其中一個(gè)原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時(shí)，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動(dòng)能量，隨后迅速振動(dòng)弛豫而喪失振動(dòng)能量。另一個(gè)原因是碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。③溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關(guān)。

具有酸性或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。

對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光螯合物，一方面pH會(huì)影響合螯物的形成，另一方面還會(huì)影響螯合物的組成，從而影響它們的熒光性質(zhì)。④內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象

溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光作用”。

內(nèi)濾光作用的另一種情況是熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)的一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)一端有重疊。

在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。

⑤順磁性物質(zhì)的存在，使激發(fā)單重態(tài)的體系間竄越速率增大，因而會(huì)使熒光效率降低。2、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應(yīng)折射率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應(yīng)熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用如氫鍵的生成同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度上升使熒光強(qiáng)度下降內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用增大碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的幾率增加酸度化合物所處狀態(tài)不同電子構(gòu)型上有所不同熒光強(qiáng)度和熒光光譜不同46（三）熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系根據(jù)熒光強(qiáng)度的定義式：

=If/Ia

熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率(熒光量子效率)

。

If=Ia=f（I0-I）Ia：吸收的輻射強(qiáng)度I0：入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A將上式展開(kāi)

在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，方括號(hào)中除第一項(xiàng)之外的其他項(xiàng)均可忽略，可得：

If=2.3I0A

=2.3I0bc

當(dāng)入射光強(qiáng)度I0

和激發(fā)光一定時(shí)，上式為：

If=Kc

即，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)A0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。熒光定量分析依據(jù)熒光猝滅

熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。

使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑。氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見(jiàn)的熒光猝滅劑。碰撞猝滅——是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式躍遷，熒光效率降低。

M+激→

M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。

任何熒(磷)光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒(磷)光定性分析的基礎(chǔ)。1)激發(fā)光譜

改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒(磷)光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到熒光激發(fā)光譜。

激發(fā)光譜實(shí)質(zhì)上就是熒光物質(zhì)的吸收光譜。(四)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。

2)發(fā)射光譜

發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)和強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。

由于不同物質(zhì)具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。

圖6.2熒光發(fā)射光譜萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)液槽I0

IIf發(fā)射單色器掃描發(fā)射光譜消除其它光線的干擾，獲得所需的熒光檢測(cè)器顯示器光電倍增管三、熒光分析儀器與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同

①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角1、光源

激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬

熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源

熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源2、單色器

熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜

大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。

第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)ex

，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)ex。

第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)

em。在選定的

em

下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析。3、液槽（樣品池）

盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測(cè)器

把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度。熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管。熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度。5、讀出裝置（顯示器）

記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。(一)無(wú)機(jī)化合物的分析

大多數(shù)無(wú)機(jī)離子與溶劑之間的相互作用很強(qiáng)，其激發(fā)態(tài)多以非輻射躍遷方式返回基態(tài)，發(fā)熒光者甚少。但很多無(wú)機(jī)離子可以與一些有機(jī)化合物形成有熒光的絡(luò)合物，利用這一性質(zhì)可對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定。

能夠同金屬離子形成熒光絡(luò)合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，通常含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的官能團(tuán)，能與金屬離子形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物。由于螯合物的生成，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，使原來(lái)不發(fā)熒光或熒光較弱的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)熒光化合物。四、熒光分析法的應(yīng)用

另一類絡(luò)合物是三元離子締合物。

羅明丹B為陽(yáng)離子熒光染料，Au3+、Ga3+

、Tl3+等陽(yáng)離子首先與Cl-、Br-等X-形成二元絡(luò)陰離子，再與羅明丹B締合成熒光化合物。

署紅為陰離子染料，Ag+與鄰菲咯啉形成二元絡(luò)陽(yáng)離子，再與署紅締合后可使其熒光猝滅，由熒光降低的程度也可對(duì)Ag+進(jìn)行分析。(二)有機(jī)化合物的分析

脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)生熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析，如丙三醇與苯胺在濃硫酸介質(zhì)中反應(yīng)生成發(fā)射藍(lán)色熒光的喹啉，據(jù)此可以測(cè)定0.1~2μg?mL?1的丙三醇。

芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測(cè)定。激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強(qiáng)度

I波長(zhǎng)

(nm)300400500硫酸奎寧的兩個(gè)光譜ex,maxfl,max可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖

三維熒光光譜IF

∝f(ex

、em)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng)IF

∝f(

ex、em)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng)蒽的三維等高線光譜圖蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜一、概述

磷光分析法是以分子磷光光譜來(lái)鑒別有機(jī)化合物和進(jìn)行定量分析的一種方法。

磷光分析法在藥物分析，臨床分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益發(fā)展。

6.2磷光分析法二、基本原理(一)磷光的產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度

磷光是處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。1.磷光的特點(diǎn)：磷光波長(zhǎng)比熒光的長(zhǎng)(T1<S1)；

磷光壽命比熒光的長(zhǎng)(磷光為禁阻躍遷產(chǎn)生，速率常數(shù)小)；磷光壽命和強(qiáng)度對(duì)重原子和氧敏感(自旋軌道耦合，使kISC增加)。2.磷光強(qiáng)度:

IP=2.3PI0bc

式中，

IP：磷光強(qiáng)度，P：磷光效率，

I0：激發(fā)光的強(qiáng)度，b：試樣池的光程，

：磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，

c：磷光物質(zhì)的濃度。

在一定的條件下，p、Ip

、k、b均為常數(shù)，因此上式可寫(xiě)成：

Ip=Kc(二)溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響1.隨著溫度降低，分子熱運(yùn)動(dòng)速率減慢，磷光逐漸增強(qiáng)。2.低溫磷光(液氮)

由于磷光壽命長(zhǎng)，T1的非輻射躍遷(內(nèi)轉(zhuǎn)換)幾率增加，碰撞失活(振動(dòng)弛豫)的幾率、光化學(xué)反應(yīng)幾率都增加，從而降低磷光強(qiáng)度。因此有必要在低溫下測(cè)量磷光。同時(shí)要求溶劑：

易提純且在分析波長(zhǎng)區(qū)無(wú)強(qiáng)吸收和發(fā)射；低溫下形成具有足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：

EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚(2+2+5)IEPA——CH3I+EPA(1+10)。(三)重原子效應(yīng)

使用含有重原子的溶劑(碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質(zhì)的磷光強(qiáng)度，這種效應(yīng)稱為重原子效應(yīng)。前者稱為外部重原子效應(yīng)，后者稱為內(nèi)部重原子效應(yīng)。

機(jī)理：重原子的高核電荷使得磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1→T1的體系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。(四)室溫磷光

低溫磷光需低溫實(shí)驗(yàn)裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光(RTP)。

1)固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)(如纖維素等)吸附磷光體，可增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。

2)膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。

利用膠束增穩(wěn)、重原子效應(yīng)和溶液除氧是該法的三要素。三、磷光儀器

在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產(chǎn)生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射。轉(zhuǎn)筒式轉(zhuǎn)盤(pán)式圖6.7磷光分析儀器示意圖盛放液氮測(cè)定低溫磷光在熒光分光光度計(jì)上配上磷光配件后，即可用于磷光測(cè)定。磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室

試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測(cè)定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡

有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。關(guān)于磷光分析儀注意：

在熒光分光光度計(jì)上配上磷光配件后，即可用于磷光測(cè)定。

1.液槽：將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)，即可用于低溫磷光測(cè)定。

2.斬波片：分別測(cè)熒光和磷光；測(cè)出不同壽命的磷光。四、應(yīng)用

磷光分析主要用于測(cè)定有機(jī)化合物，如石油產(chǎn)品、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、藥物等方面。

（1）相同點(diǎn)：

1.都是電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時(shí)放出的輻射，波長(zhǎng)一般都不同于入射光的波長(zhǎng)。

2.溫度均低于白灼光，一般在800K以下，故稱為化學(xué)冷光。熒光與磷光的異同點(diǎn)

（2）不同點(diǎn)：1.躍遷時(shí)重度不同熒光：S1→S0重度未變。

磷光：T1→S0重度改變。2.輻射強(qiáng)度不同熒光：強(qiáng)度較大，因從S0→S1是自旋允許的，處于S1，S2態(tài)電子多，因而熒光亦強(qiáng)。

磷光：很弱，因?yàn)镾0→T1是自旋禁阻的，處于T1態(tài)電子少。3.壽命不同熒光：10-9~10-6s，壽命短。

磷光：10-4~10-2s，壽命稍長(zhǎng)。一、概述

某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過(guò)程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來(lái)的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。

6.2化學(xué)發(fā)光分析法80

生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光中的一類，特指在生物體內(nèi)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來(lái)催化產(chǎn)生的。

多種細(xì)菌、昆蟲(chóng)、魚(yú)類等均能發(fā)光化學(xué)發(fā)光分析具有以下突出特點(diǎn)

靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至2×10-17mol·L-1ATP

線性范圍寬——一般有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)

儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理

化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件

任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟：

化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量

A+B→C*+D

產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā)

C*→C+hv能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光必須滿足如下條件：（1）能夠快速地釋放出足夠的能量

在可見(jiàn)光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。具有過(guò)氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求。化學(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中。（2）反應(yīng)途徑有利于激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的形成（3）處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，或能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移給可以產(chǎn)生輻射躍遷的其他分子。(二)化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率CL，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它等于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率r和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率f。r

取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f

與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率

具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中。亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲(chóng)發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過(guò)1%

化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL(t)與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對(duì)下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

A+B→C*+D

C+hICL隨時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小。

A+B→C*+D

A：待測(cè)物質(zhì)，C：發(fā)光物質(zhì)

當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量于待測(cè)物濃度時(shí)，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)。

t時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度與該時(shí)刻的分析物濃度成正比?；瘜W(xué)