薄層色譜和柱層析課件

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將溶劑抽提中的一個相固定在硅膠上，裝在柱內(nèi)，并按色譜法操作，使另一液相流過柱子，分離獲得成功。從此出現(xiàn)了基于分配原理的分配色譜法，因此獲得了諾貝爾獎。以后的發(fā)展采用了纖維素、繼而采用濾紙作分配色譜載體，發(fā)展了紙色譜法。薄層色譜法的研究和發(fā)展也出現(xiàn)在二十世紀(jì)的三、四十年代，現(xiàn)在已和氣、液色譜一起成為最常用的色譜分離、分析方法。為與柱色譜相區(qū)別，并突出紙色譜和薄層色譜的特點，這兩種方法也叫平床色譜法（Flatbedchromatography）或平面色譜法（Planarchromatography）。色譜法經(jīng)過多年的發(fā)展已有多種操作形式，其分類方法也有多種。按固定相和流動相的物態(tài)可分為以氣體為流動相的氣相色譜（包括氣固色譜、氣液色譜）和以液體為流動相的液相色譜（包括液固色譜、液-液色譜）；如以固定相的操作方式以及形狀分類則有柱色譜、

紙色譜、薄層色譜；11:46:04

2-薄層色譜中，組分的移動情況常用比移值Rf來表示：

Rf=原點至組分點中心的距離/原點至流動相前沿的距離也有用“高比移值”表示：

hRf=Rf×100

和“相對比移值”表示，即相對于某一物質(zhì)X的Rf值，用Rx表示：

Rx=Rf/Rx（原點至組分點中心距離與原點至物質(zhì)X點中心的距離的比值）

Rf總小于1；Rx可小于1，也可大于1；hRf可在1～100之間11:46:04薄層色譜中，Rf值與組分的分配系數(shù)K值有關(guān)：

K=Cs/CM

=溶質(zhì)在固定相中濃度/溶質(zhì)在流動相中濃度若該組分的移動距離為d1，流動相移動距離為dm,

d2=dm－d1Rf=d1/dm=d1/(d1+d2)

如果組分的分配系數(shù)大，則在水中分配量大，移動距離小，Rf小。因此，K與d1、d2有如下關(guān)系：

K∝d2/d1

此外，移動距離也與二相之體積比有關(guān)，體積大者，在其中分配的量也多。如以Vs

表示固定相的體積，Vm表示流動相的體積

Vs/Vm∝d2/d111:46:04

合并上兩式：

d2/d1=KVs/Vm

Rf=d1/(d1+d2)=d1/(d1+d1KVs/Vm)=Vm/(Vm+KVs)

或K=Vm/Vs(1/Rf－1)

若實驗條件固定，則兩相體積比也固定不變，則決定Rf的主要因素是分配系數(shù)K。由K值可推倒出Rf值。但有時紙纖維對某些物質(zhì)也有作用，從而使實測Rf值與計算（推倒）Rf值有一定差別。在分配色譜中，但固定液的極性大于流動相的極性時，稱為正相分配；當(dāng)固定液的極性小于流動相的極性時稱為反相分配。通常紙色譜均為正相，即有機溶劑為流動相，吸收在濾紙上的水分作固定相。但有時也有將濾紙用極性較小的液體（如烴類）處理后作固定相，而以極性較大的含水溶劑作流動相，則為反相色譜。用DMF處理的仍然為正相。11:46:04

薄層色譜與HPLC的對比

薄層色譜HPLC

色譜系統(tǒng)開放式閉路展開方式展開洗脫流速控制吸附劑的毛細管作用由泵調(diào)節(jié)平衡時間短不定分析樣品可同時分析多個每次一個樣品樣品量高低板高（μm）302～5

有效板數(shù)<600～5000

檢測方式靜態(tài)動態(tài)溶劑用量少多溶劑更換易難固定相一次棄去重復(fù)使用11:46:044-吸附劑與載體（1）對吸附劑的要求（Ⅰ）具有大的表面積與足夠的吸附能力（Ⅱ）對不同組分有不同吸附性能，這樣有好的分離效果（Ⅲ）在所用溶劑和展開劑中不溶解（Ⅳ）不與試樣中各組分、溶劑和展開劑起化學(xué)反應(yīng)、破壞或分解作用11:46:04（Ⅴ）粒度均勻，使用過程中不破壞（Ⅵ）具有可逆的吸附性，既能吸附樣品組分，又易于解析（Ⅶ）為便于觀察分離結(jié)果，吸附劑最好為白色。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、硅酸鎂、而CaO、MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、淀粉、蔗糖等，或因堿性太大，或吸附性太弱，用途有限，活性炭因吸附性太強和黑色，使應(yīng)用受到限制。（2）分配色譜對載體的要求（Ⅰ）表面積大（Ⅱ）在展開劑中不溶，與展開劑和樣品組分不起化學(xué)反應(yīng)或分解作用（Ⅲ）對樣品組分無吸附性或吸附性弱（Ⅳ）對固定液是惰性的11:46:04

常用的有纖維素和硅藻土。實際工作中，吸附劑、載體等的選擇，首先決定于樣品成分的性質(zhì)，即它們的溶解度、酸堿性、極性以及是否與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)等，還有價格、是否容易得到等。（Ⅰ）樣品的溶解度任何類型的化合物都可首先考慮使用硅膠和氧化鋁薄層，如果水溶性的化合物在吸附薄層上分離不好，可試用纖維素或硅藻土分配薄層，如果正相不行可選用反相。（Ⅱ）樣品的酸堿性硅膠略帶酸性，適用于酸性和中性物質(zhì)分離；堿性物質(zhì)與硅膠有相互作用，展開時易吸附于原點不動或拖尾。氧化鋁呈堿性，適用于堿性和中性物質(zhì)的分離。硅膠和氧化鋁1：1量摻和使用，得中性吸附劑，或在制板時加入稀酸或稀堿使其變性，或用酸性或堿性展開劑展開，以改變硅膠或氧化鋁原來的性質(zhì)。11:46:04（Ⅲ）樣品的極性物質(zhì)的極性愈大，氧化鋁和硅膠吸附愈牢，物質(zhì)極性大小如下：飽和烴<不飽和烴<醚<酯<醛<酮<胺<羥基化合物<酸和堿吸附太牢也不易分離，如果硅膠、氧化鋁吸附性太強，可摻入不同比例的硅藻土，或其它低吸附性物質(zhì)。（3）常用吸附劑硅膠：105～110℃活化，但不能高于170℃。氧化鋁：180～200℃活化聚酰胺纖維素硅藻土硅酸鎂離子交換劑多孔玻璃珠反相鍵合硅膠（硅烷化處理）11:46:045-薄層板的制備將吸附劑均勻地涂鋪在規(guī)定尺寸的玻璃板或其它平面板上，這一過程稱鋪板或鋪層，即制成薄層板。板的好壞是分離成功與否的關(guān)鍵，好的板要求吸附劑涂鋪均勻，表面光滑，厚度一致?，F(xiàn)有預(yù)制板出售。制板方法主要有干法和濕法兩種：（1）干法制板氧化鋁和硅膠可用干法鋪板，干法鋪層比較簡便，制得的板展開速度快，但展開后不能保存，薄層不牢固，噴顯色劑時易吹散。方法：將吸附劑均勻地撒在薄層板上，兩手用兩端圈套的玻璃棒滾動，厚度0.25～3mm，滾動不宜太快，不能停。0.25mm左右主要是分析和分離用，3mm的厚板主要是制備色譜用。11:46:04（2）濕法鋪板在吸附劑中加入少量粘合劑，加水調(diào)成糊狀制板。濕法制得的半薄層牢固，不易脫落，易保存。氧化鋁和硅膠均可用該法鋪板，鋪成的濕板經(jīng)風(fēng)干、活化等處理后即可使用。濕法鋪板有三種方法：傾注法、平鋪法和涂鋪法。傾注法：通過振動鋪平，在105～120℃活化0.5～2h。粘合劑用鍛石膏，干燥速度快，用羧甲基纖維素慢。平鋪法：二邊有框涂鋪法：用涂鋪器，厚度可調(diào)。所用粘合劑有：鍛石膏、羧甲基纖維素及某些聚合物如：聚丙烯酸等。鍛石膏的用量一般為吸附劑的10～15%

羧甲基纖維素一般用0.2～1.0%的水溶液淀粉用5%的水溶液。11:46:04（3）薄層板類型除上述正常的硅膠、氧化鋁板外，還有一些板適用于化合物的分離和檢出：（a）熒光薄層板：吸附劑中加入熒光物質(zhì)即得熒光板，可檢出一些本身無色、在紫外光下也不顯熒光的化合物，熒光板在紫外光照射下顯熒光，而化合物斑點呈現(xiàn)暗點。無機熒光物質(zhì)有：在254nm紫外光下激發(fā)熒光，如錳激活的硅酸鋅（Zn2SiO4:Mn），在365nm紫外光激發(fā)熒光，如銀激活的硫化鋅.硫化鎘（ZnS2.CdS:Ag）有機物有熒光素鈉、桑色素加入量為0.5～1.5%（吸附劑中）11:46:04（b）絡(luò)合薄層板含有AgNO3、H3BO3或Na4B4O10等化合物的板與某些化合物在展開過程中形成絡(luò)合物。如AgNO3絡(luò)合薄層可用來分離碳原子數(shù)相同、而C=C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等，原因是Ag+可與C=C形成絡(luò)合物，飽和的吸附弱，Rf高，雙鍵數(shù)目不同，Rf亦不同。含多羥基的長鏈脂肪酸和它們的甲酯及酚等均可與硼酸、硼砂絡(luò)合。（c）酸堿薄層板和pH緩沖薄層板：有些化合物在普通板上分離不好時，可通過改變原來吸附劑的酸堿性，改善分離效果。如在鋪層時用稀酸（一般用1～4%的鹽酸或0.1～0.25mol/L草酸溶液）代替水制成酸性板，使生物堿形成離子對而分離。（d）混合薄層板：兩種不同吸附劑按一定比例混合，制板，也可分段鋪板，前段預(yù)處理，以吸附雜質(zhì)，后段分離。11:46:04（e）徑向薄層板：徑向板鋪法與一般板不同，點樣前按下法處理：刮去刮去用此板展開，可使Rf值相近的化合物得到較好的分離，且靈敏度高。（f）梯度薄層板：梯度是指由一種性質(zhì)到另一種性質(zhì)的變化。梯度薄層與常規(guī)薄層不同，它顯示出具有漸變的分離性能，如有兩種不同吸附劑的比例漸變（吸附性梯度）；用不同pH值溶液（pH梯度）或AgNO3濃度（0.5～10%濃度梯度）鋪層；用不同粒度吸附劑鋪層（粒度梯度）。11:46:04（g）燒結(jié)板：由玻璃粉（作粘合劑）與硅膠或氧化鋁等吸附劑按一定比例混勻后，經(jīng)高溫?zé)Y(jié)而成，該板可一此制備多次使用。吸附劑粘合劑配比燒結(jié)條件硅膠玻璃粉1：2～5470～770℃，7～10min

氧化鋁玻璃粉1：1～4470～870℃，7～10min

硅藻土玻璃粉1：1～6470～770℃，7～10min（h）旋轉(zhuǎn)薄層板：旋轉(zhuǎn)薄層色譜由稱離心薄層色譜，用于快速分離、提純、制備。（i）聚酰胺薄層板：聚酰胺薄層板一般不需要外加粘合劑，可直接將聚酰胺粉（常用小于60目的粉末）制成勻漿制板，欲提高牢度，可加石膏或淀粉。該種板可以反復(fù)使用，再生方法為丙酮和濃氨水（9：1）或丙酮和甲酸（9：1）浸泡6h，洗去污物，再用丙酮洗滌，晾干后即可使用。11:46:04（j）纖維素薄層板：薄層用短纖維素制成，斑點集中，天然纖維素長2～25μm，微晶纖維素20～40μm，鋪板可用粘合劑。一般用纖維素與水1：5混勻，鋪板，晾干即可，105℃烘干。（k）反相薄層板：原來反相板是用石蠟處理，現(xiàn)在改用化學(xué)鍵合相硅膠和乙?；w維素等制備。（l）高效板：使用窄范圍的細粒度硅膠或鍵合相硅膠鋪板，常用粒度范圍為5～7μm，厚度一般為0.2mm，高效板分離度和靈敏度高，分析速度快。11:46:04點樣1.樣品濃度溶解樣品溶劑避免用水，因水溶液點樣斑點易擴散而且不易揮發(fā)。一般用有機溶劑，最好與展開劑極性相似的溶劑，應(yīng)盡量使點樣后溶劑迅速揮發(fā)；如是水溶液宜邊點樣、邊用電吹風(fēng)加熱吹干；若樣品加熱不穩(wěn)定，用冷風(fēng)吹干。

2.點樣量點樣量多少與紙或薄層的性能、厚度及顯色劑的靈敏度有關(guān)，點樣量對組分的分離效果有很大的影響。點樣量少，可能斑點模糊或完全不顯出斑點；但點樣量過多，斑點過大或拖尾。常用量為幾到幾十微克，制備型為毫克。11:46:043.點樣方式點樣要求嚴(yán)格、準(zhǔn)確、小心。點樣斑點不能太大，否則斑點不集中，影響分離效果和檢出限；斑點直徑最好3～5mm。斑點可為點狀、也可為條狀，距離下端1cm左右。

4.點樣容器（1）毛細管0.5～1.0μl樣品（2）微量注射器（3）專門的點樣裝置（國外有）：如瑞士Camag公司的Nanomat點樣器，Linomat線性點樣器。5.展開點樣后薄層板須在密閉容器（展開槽）中用適當(dāng)?shù)恼归_劑展開，使欲分離的組分彼此分開。11:46:04（1）

水蒸氣的影響水一般不單獨作為展開劑，但在展開過程中，空氣的相對濕度以及展開槽中的水蒸氣必須嚴(yán)格控制，因水和吸附劑之間有巨大的親和性，即使微量的水也能對色譜分離結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。硅膠的硅羥基以氫鍵形式優(yōu)先吸附水，物理吸附的水阻止了弱極性物質(zhì)的吸附，從而硅膠活性減弱，化合物的Rf值升高（制成的板要活化，儲存于干藻器中，就因為水的影響）。經(jīng)過活化的板，在點樣過程中會立即吸附周圍空氣中的水份，吸附水份的量決定于點樣速度和空氣的相對濕度，硅膠板吸水速度很快。0.2mm厚、20×20cm板在50%濕度空氣中3min就會失去活性一半，15min吸水達最大值。濕度不同，Rf值不同，有差別。此外，適宜的相對濕度范圍也決定于溶質(zhì)和溶劑的極性，極性增加，濕度范圍也按比例增大。如苯作展開劑，范圍窄，乙醚做展開劑，濕度范圍為20～50%；氯仿：異丙醇：25%氨水（45：45：10）作展開劑，濕度范圍為20～80%，重復(fù)性好。展開劑極性越大，濕度影響越小。11:46:04（2）

溶劑蒸氣的影響在使用混合溶劑時，由于溶劑揮發(fā)性不同，導(dǎo)致極性較弱和沸點較低的溶劑在板的邊緣易揮發(fā)，故邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf值大，中間部分的Rf小，這種現(xiàn)象叫溶劑的“邊緣效應(yīng)”。（3）展開槽可用不銹鋼槽和玻璃槽，但不銹鋼槽價格高，一般用玻璃槽。玻璃槽有幾種形狀：（a）普通槽：有立式、臥式，方形、圓形。（b）雙底槽：abc11:46:04（4）展開方式（a）近水平展開采用臥式槽，板與槽底部的夾角約5～10o，下端浸入展開劑0.5cm。適用于不含粘合劑的軟板展開。（b）上行展開適用于含粘合劑的硬板，是最常用的方法。（c）下行展開在展開槽內(nèi)薄層板的上端放一個盛展開劑的槽，用厚濾紙把展開劑引到板的上端，使展開劑從上而下流動。下行展開法展開劑除毛細作用還有重力作用，展開速度快，但操作麻煩。（d）雙向展開使板沿一個方向先展開，完成后，取出薄層板，揮發(fā)掉展開劑，轉(zhuǎn)90o，沿另一方向再展開。該方法用于組分復(fù)雜，性質(zhì)比較接近的難分離的物質(zhì)的分離。

11:46:045展開劑選擇合適的展開劑是分離好壞的關(guān)鍵。1.選擇展開劑的方法（1）查閱文獻這類方法已有幾十年的歷史，積累了大量的文獻資料，如雜志、期刊、專著、手冊等，必要時可以進行改進，可較快地找到合適的展開劑。（2）微量圓環(huán)技術(shù)在沒有合適的展開劑系統(tǒng)參考時，應(yīng)用微量圓環(huán)技術(shù)可簡便、快速地比較出被試物質(zhì)在所用展開劑中的移動速度以及最后得到大致的分離效果。11:46:046顯色方法和顯色劑1.顯色方法（1）首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點位置；（2）在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點，并記錄其顏色、位置及強弱。有熒光的物質(zhì)或有紫外吸收物質(zhì)可用此法檢出；（3）熒光薄層板檢測，適用于有紫外吸收的物質(zhì)。（4）既無色、又無紫外吸收的物質(zhì)可用顯色劑顯色。2.顯色劑（1）有機物質(zhì)通用試劑

a.碘蒸汽在淺黃色背景上，很多有機物吸附碘，可逆地產(chǎn)生棕色到黃色斑點，不少有機化合物的檢測靈敏度可達0.5~1ug.

11:46:04b.10%硫酸乙醇液，噴霧后105度加熱10-15分鐘，日光或紫外光下觀察，大多有機化合物呈有色斑點，如紅色、棕色和紫色等，在炭化以前，不同的化合物將出現(xiàn)一系列顏色的改變，被炭化的化合物常出現(xiàn)熒光。c.高錳酸鉀-硫酸液配制方法為把500mg高錳酸鉀溶在15ml濃硫酸中。注意要少量地慢慢混合，結(jié)果為粉底本色上產(chǎn)生白色斑點。d.25%高氯酸水溶液，噴霧后加熱至150度左右；e.10%-20%五氯化銻的四氯化碳溶液，或三氯化銻的乙醇飽和溶液。噴霧后，在100-120度加熱，日光下和紫外光下觀察，該試劑也為有機化合物的通用試劑，和很多有機化合物產(chǎn)生不同的顏色。f.水11:46:04（2）專屬性顯色劑

a.含0.3%溴甲酚綠的80%甲醇溶液，在綠色背景下顯黃色斑點，表示脂肪族羧酸b.5%磷鉬酸乙醇溶液，噴霧后120度烘烤，還原性物質(zhì)顯藍色，再以氨熏，背景變?yōu)闊o色c.含2%2，4-二硝基苯肼的乙醇溶液，噴霧后120度加熱3分鐘，醛、酮在黃橙色背景上顯紅色或橙色斑點；d.含0.3%茚三酮的溶液（含3%的醋酸）用來檢測氨基酸及脂肪族伯胺，在白色背景上顯粉紅色到紫色斑點；e.三氯化鐵-鐵氰化鉀溶液，分別為0.1摩爾/升溶液臨用前混合配成，用來檢測酚類、芳香族胺類、甾族化合物等。顯色劑種類繁多，總數(shù)超過300種，詳細可查閱有關(guān)手冊。11:46:046-6定量方法

1.刮板、浸取，定量

2.掃描儀。

11:46:04二、柱色譜原理柱色譜（柱上層析）常用的有吸附色譜和分配色譜兩類。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠作固定相；而分配色譜中以硅膠、硅藻土和纖維素作為支持劑，以吸收較大量的液體作固定相，而支持劑本身不起分離作用。11:46:04吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑。當(dāng)待分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，11:46:04于是溶質(zhì)在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色帶，再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出并收集；或?qū)⒅?，擠出后按色帶分割開，再用溶劑將各色帶中的