納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析硅膠包裹納米鋱熒

納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析作者：葉志強,譚明乾指導(dǎo)教師：袁景利,王桂蘭摘要：在油包水型的微乳液中，合成了三種形狀規(guī)則、尺寸均勻的硅膠基質(zhì)納米稀土熒光材料。與前驅(qū)體相比，新型熒光納米微粒具有更強的熒光強度和抗光漂白性能。將納米微粒表面修飾并標記鏈酶親和素SA(或抗體)后應(yīng)用于時間分辨熒光免疫分析，建立了人血清中前列腺特異抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)的高靈敏度檢測方法。關(guān)鍵詞：熒光納米微粒；稀土配合物；生物標記；時間分辨熒光免疫分析。時間分辨熒光生物分析技術(shù)是基于稀土熒光化合物特殊熒光性質(zhì)而建立起來的一種高的領(lǐng)域1。該技術(shù)利用具有熒光壽命長、Stokes位移大和半峰寬窄等特點的稀土熒光配合物作為標記物，不僅適用于多標記分析，而且可完全消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的干擾，從而實現(xiàn)超高靈敏度分析?；谶@些優(yōu)點，時間分辨熒光生物分析技術(shù)在近20年來取得了重大的發(fā)展，在臨床醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)的實踐與研究中發(fā)揮著重要的作用。是由于納米尺度的發(fā)光粒子的瑞利、拉曼和丁達爾散射產(chǎn)生的背景光對測定的嚴重干擾,影響了檢測在我們的研究中，綜合稀土熒光標記物和納米技術(shù)的優(yōu)勢，合成了三種具有長壽命熒光的納米稀土熒光微粒5-7。新型納米熒光微粒用于時間分辨熒光生物分子分析，不僅可從根本上徹底消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的干擾，提高分析方法的靈敏度,而且由于熒光配合物被包覆在硅膠的骨架結(jié)構(gòu)中,基本隔絕了外部環(huán)境對配合物的影響，極大地增強了熒光材1.摻雜型納米熒光微粒的制備將160mgN,N,N1,N1-[2,6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-phenyl-pyridine]tetrakis(acetate)-Tb3+(BPTA-Tb3+)溶于ml的水后和200μl的四乙氧基硅 結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水各洗三次，真空干燥后得到白色硅膠包裹BPTA-Tb3+納米熒光微粒。2.摻雜型納米熒光微粒用于測定人血清樣品中的PSA注于96微孔板的各孔中，4oC,24小時包被后，將PSA標準溶液(用5%%%NaN的pH值的3應(yīng)后，用含有%Tween20的pH值的mol/LTris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液1)洗兩次，再用pH值的mol/LTris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液2)洗一次，然后加入45μl生物素標記的抗3.共聚合型納米熒光微粒的制備微乳液。室溫攪拌反應(yīng)5小時后，加入6μl的時后，加入50ml丙酮結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水分別洗三次，真空干燥后得到白色的共聚合型硅膠包裹BPTA-Tb3+納米熒光微粒。4.共聚合型熒光納米微粒用于測定人血清樣品中的AFP行固相時間分辨熒光測定。5.共價鍵合型熒光納米微粒的制備將mg氨丙基三乙氧基硅(APS，47?mol)，?mol4,4-bis(1",1",1",2",2",3",3"-heptafluoro-4",6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT)及?molEuCl?6HO加入30μl環(huán)己烷中，超聲振蕩反應(yīng)15分鐘后，反應(yīng)液加入到32將反應(yīng)液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水分別洗三次后懸浮于水中備用。6.共價鍵合型納米微粒用于人血清中乙肝表面抗原(HBsAg)測定使用抗HBsAg單抗和多抗進行測定，測定步驟與摻雜型納米熒光微粒測定人血清中PSA相同。1.摻雜型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定PSA摻雜型納米熒光微粒的制備原理見圖1。在表面活性劑和助表面活性劑的作用下，含有TEOS,BPTA-Tb3+的水溶液在油相中形成均勻的小液室，每一個小液室相當于一個微反應(yīng)器，TEOS的水合化和聚合化的過程都被限制在微反應(yīng)器內(nèi)。微反應(yīng)器的體積主要由水和表面活性劑的比值所決定，而微反應(yīng)器的體積大小又決定了納米顆粒的尺寸大小。我們用這種方法制OilOilCosurfactantmolculestantmoleculesSiOSiNH4OH,PolymerizationBPTA-Tb3+SiOSiOTbOSi(OEt)WaterPool4圖1在微乳液中制備納米微粒的原理圖2硅膠包裹BPTA-Tb3+納米微粒的電鏡照片納米熒光微粒表面的硅膠經(jīng)過修飾后可與生物分子相連。將納米熒光微粒與SA共價結(jié)合方法主要有放射性免疫法和酶聯(lián)免疫法，它們的檢測靈敏度大約在100pg/ml左右。而最近udr的研究表明，如果方法的檢測靈敏度可達到20pg/ml以下，那么至少可以提前一年診斷出治療后前列腺癌患者是否復(fù)發(fā)。所以發(fā)展高靈敏度的血中PSA的檢測方法顯得十分重要。使用的PSA濃度進行了測定，并與臨床測定的結(jié)果進行了比較，兩者的相關(guān)性見圖4。兩種方法對24個人血清樣品中PSA濃度測定結(jié)果的相關(guān)性方程式為y＝＋，相關(guān)系數(shù)為，說明使用納米微粒作為標記物的測定方法的結(jié)果是完全可信的。uuoco1030.0010.010.1110100AS864204681012142.共聚合型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定AFP性基團-NH2在聚合后會存在于納米微粒的表面，為后續(xù)標記生物分子提供極大的方便。所以，在我們的研究中利用將AEPS和TEOS共聚合的方法在微乳液中制備出了表面帶有活性氨基的功能性硅膠包裹鋱配合物納米熒光微粒。其電鏡測定結(jié)果(見圖5)顯示這種納米微粒不僅形狀規(guī)則，而且粒徑分布范圍窄(45±3nm)。聚合后存在于納米微粒表面的-NH2基團使得生物AFP合后，建立了一種以納米微粒為的最低檢測限為ng/ml，相對標準偏差(CV%)小于%，血清添加回收率在范圍，說明該法具有較高的精密度和準確度，可以用于人血清樣品的測定。1105u1041030.1110100Conc.ofAFP(ng/ml)u3.共價鍵合型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定HBsAg納米微粒時只有少量的配合物被包進納米微粒中，導(dǎo)致制得的納米微粒熒光很弱。而采用共ll微粒的熒光強度得到大幅度提高，而且一次性地在納米微粒表面導(dǎo)入了自由氨基。電鏡測定結(jié)果(見圖7)顯示該法制得的納米微粒大小均勻，粒徑為37±3nm。 (a)(b0.1SA(a)和BHHCT-Eu3+標記SA-BSA(b)測定人血清中HBsAg的工作曲線將納米微粒與SA結(jié)合后，用于時間分辨熒光免疫測定人血清中的HBsAg，其工作曲線的測定方法(圖8b，最低檢測限為84pg/ml)。該法用于人血清樣品測定的相對標準偏差小于本研究利用微乳液法制備了三種硅膠基質(zhì)納米稀土熒光微粒，制備方法簡單且重復(fù)性好。所制備的納米微粒形狀規(guī)則、尺寸均勻，在對其進行表面修飾后用于生物標記及時間分辨熒熒光微粒具有強熒光、強抗光漂白性能及易用于生物標記等優(yōu)點，預(yù)計其在熒光顯微鏡生物成像測定及生物芯片等領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用前景，這部分的研究工作將在近期展開。領(lǐng)域前沿項目－大連化物所青年基金資