浸出物測定法課件

第六章中藥制劑的含量測定

概述一、含量測定的定義和意義

用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法或儀器分析方法對制劑中某種（些）有效成分或指標(biāo)性成分進(jìn)行的定量分析。意義：判斷藥品的優(yōu)劣，是控制和評價藥品質(zhì)量的重要方法。二、含量測定方法

包括由于中藥制劑組成復(fù)雜，儀器分析法更為常用。

《中國藥典》中藥制劑含量測定方法概況見下表。

化學(xué)分析法儀器分析法第二節(jié)可見-紫外分光光度法

鑒別用于檢查含量測定一、概述

1、定義

根據(jù)被測物質(zhì)在可見-紫外光的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度對該物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的方法稱可見-紫外分光光度法。

2、特點

操作簡便，靈敏度高，常用于中成藥含測。但本法不具分離功能，常用于總成分的測定。

3

、含量測定方法

對照品比較法、吸收系數(shù)法、比色法4、定量分析的理論基礎(chǔ)

朗伯-比爾定律

A=KCL

A----吸光度

K----吸收系數(shù)

C----溶液濃度

L----溶液厚度百分吸收系數(shù)：E藥典采用摩爾吸收系數(shù)：∈K1%1cmA=E

CL1%1cm二、儀器

紫外-可見分光光度計工作波長范圍：190~900nm組成光源單色器吸收池檢測器信號顯示處理系統(tǒng)紫外分光光度計工作原理1—氫燈；2—凹面聚光鏡；3—鎢燈；4—吸收池；5—紫敏光電管；6—紅敏光電管7—光電管調(diào)動推桿；8—暗電流控制閘門拉桿；9—吸收池架；10—濾光片架拉桿11—平面鏡；12—入射狹縫及石英窗；13—球面準(zhǔn)直鏡；14—石英棱鏡；15—出射狹縫；16—石英透鏡

1、光源氫燈或氘燈：紫外光區(qū)鎢燈或鹵鎢燈：可見光區(qū)

2、單色器狹縫、棱鏡、光柵

3、吸收池石英吸收池：紫外、可見光區(qū)玻璃吸收池：可見光區(qū)

4、檢測器

光電管、光電倍增管等

5、信號顯示處理系統(tǒng)三、操作方法（一）操作前的準(zhǔn)備紫外-可見分光光度計的校正波長汞燈、氘燈、鈥玻璃吸光度重鉻酸鉀的硫酸溶液P186

雜散光碘化鈉和亞硝酸鈉溶液吸收池誤差 （二）儀器操作通法（三）樣品測定法

藥典收載了三種測定方法

1.吸收系數(shù)法

2.對照品比較法

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線法（原計算分光光度法取消）1.原理配制一系列不同濃度（Ci）的對照品溶液（5～7份），在相同條件下分別測其吸收度(Ai)，以A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制A-C曲線，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線（又稱工作曲線）。在相同條件下測定供試品的A,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出與之對應(yīng)的C，即可求出濃度和含量（圖6－3）。亦可將一系列對照品溶液的C與相應(yīng)的A進(jìn)行一元線性回歸，求出回歸方程（相關(guān)系r≥0.999），將供試品溶液的A代入回歸方程，算出被測成分的濃度和含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線A=a+bCA-C曲線1、比色法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

2.特點本法多用于可見分光光度法，由于影響顯色反應(yīng)的因素多，有的儀器單色光純度較差，故測定時應(yīng)用對照品同時操作。本法適用于批量樣品的分析，當(dāng)儀器和測定條件固定時，曲線可多次使用。

3.應(yīng)用主要用于總成分的測定。例如《中國藥典》槐米中的蘆丁、復(fù)方皂礬丸中的硫酸亞鐵、獨一味膠囊、益心酮片、消咳喘糖漿和排石顆粒中的總黃酮、桂林西瓜霜中總生物堿的含量測定。

二、對照品比較法

1.原理在相同條件下分別配制供試品溶液和對照品溶液，在規(guī)定波長處測定試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品溶液的濃度：

C供(g/ml)=（A供/A對）C對

C供為供試品溶液的濃度；A供為供試品溶液的吸光度；C對為對照品溶液的濃度；A對對照品溶液的吸光度。

2.特點對照品溶液與供試品溶液的濃度應(yīng)盡可能接近，一般要求對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的100%±10%。

3.應(yīng)用實例

《中國藥典》華山參片中總生物堿、黃楊寧片中黃楊寧的含量測定等均采用本法。

3、吸收系數(shù)法原理

C為供試液濃度（g/100ml）

A為供試液測得的吸收度

E為被測物質(zhì)的百分吸收系數(shù)（藥典給出）

L為比色皿（液層）厚度（1cm）特點

不需對照品隨行測定，操作簡便，僅用于紫外分光光度法。故需嚴(yán)格校正儀器，規(guī)范實驗條件，做好前處理工作。1cm1%1%EL1%A∵A=ECL∴C=1cm四、注意事項1、使用的吸收池必須潔凈，并注意配對。2、取吸收池時，手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)。3、供試液的濃度：A=0.3~0.74、對溶劑的要求A盡量小，空白對照測定波長確證±2nm5、平行操作6、狹縫寬度五、記錄與計算六、結(jié)果判斷

七.實例

1、黃楊寧片中黃楊寧的含量測定本品為黃楊寧經(jīng)加工制成的片劑。每片含環(huán)維黃楊星D0.5mg或1mg。

對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的環(huán)維黃楊星D對照品25mg，置250ml量瓶中，加甲醇70ml使溶解,用0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置100ml量瓶中，用0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。（每1ml含環(huán)維黃楊星D10μg）環(huán)維黃楊星D

供試品溶液的制備取本品20片（每片含環(huán)維黃楊星D0.5mg），精密稱定（2.050g），研細(xì)，精密稱取0.1020g（約相當(dāng)于黃楊0.5mg），置50ml量瓶中，加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至近刻度，80℃水浴恒溫1.5小時后取出，冷卻至室溫,加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至刻度，搖勻，離心6分鐘（每分鐘轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)），取上清液，即得。

測定法精密量取對照品溶液與供試品溶液各5ml,分別置分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚藍(lán)溶液（取溴麝香草酚藍(lán)18mg，置250ml量瓶中，加甲醇5ml使溶解，加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至刻度，搖勻，即得）5ml，搖勻，立即分別精密加入氯仿10ml，振搖2分鐘，靜置1.5小時，分取氯仿層，置含0.5g無水硫酸鈉的具塞試管中，振搖，靜置，取上清液，照分光光度法（附錄ⅤA），在410nm的波長處分別測定吸收度（A對＝0.454A供＝0.445），計算，即得。本品每片含黃楊寧以環(huán)維黃楊星D(C26H46N2O)計，應(yīng)為標(biāo)示量90.0%～110.0％。2、前列舒丸（水蜜丸）中牡丹皮的含量測定

取本品切碎，取2g，精密稱定（2.135g）；用水蒸氣蒸餾，收集餾出液約450ml,置500ml量瓶中，加水稀釋至刻度，照分光光度法（附錄ⅤA）在274nm的波長處測定吸收度（A=0.333），按丹皮酚（C9H10O3）吸收系數(shù)（Ｅ）為862

計算，即得。本品含牡丹皮按丹皮酚(C9H10O3)計，每1g不得少于0.53mg

1cm

(1)供試液濃度的計算

（2）牡丹皮含量計算1%1cm

駐車丸（水丸）中總生物堿的含量測定本品由黃連、炮姜、當(dāng)歸、阿膠等四味中藥制成。取本品粉末（過三號篩）2g，精密稱定，置索氏提取器中，加鹽酸－甲醇(1:100)的混合溶液適量，加熱回流至回流提取液無色時為止，將提取液（必要時濃縮）移至50ml量瓶中，加鹽酸－甲醇(1:100)的混合溶液至刻度，搖勻。照柱色譜法（附錄ⅥC）試驗，精密量取5ml,置中性氧化鋁柱（5g，內(nèi)徑0.9cm,濕法裝柱，用乙醇30ml預(yù)洗）上，用乙醇25ml分次洗脫，收集洗脫液，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，精密量取2ml置50ml量瓶中，加0.05mol／L硫酸溶液至刻度，搖勻，照分光光度法（附錄ⅤA），在345nm的波長處測定吸收度，按鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl)的吸收系數(shù)（Ｅ）為728計算，即得。本品按干燥品計算，每1g含總生物堿以鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl計，不得少于30.0mg。1%

1cm實例益心酮片總黃酮的含量測定本品為山楂葉經(jīng)提取總黃酮制成的片劑。

對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對照品25mg置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml含無水蘆丁0.20mg）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，使混勻，放置6分鐘。加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘；以相應(yīng)的溶液為空白。照分光光度法（中國藥典附錄VB），在500nm為波長處測定吸度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測定法取本品20片，除去包衣，精密稱定2.100g，研成細(xì)粉，精密稱取0.5315g（約相當(dāng)于5片的重量），精密加入稀乙醇25ml，密塞，搖勻，超聲處理5分鐘，靜置3小時以上，濾過，精密量取濾液4ml，置50ml量瓶中，用水稀釋到刻度，搖勻，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線置備項下的方法，自“加水至6ml”起，依法測定吸收度，A=0.3620，并取同樣量的供試品溶液，加水至25ml作空白。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計算每片總黃酮含量（以無水蘆丁計）。《中國藥典》規(guī)定本品每片含黃酮以無水蘆?。–27H30O16）計，不得少于25.0mg。第三節(jié)薄層掃描法--TLCS

一、概述

1、定義

薄層掃描法（TLCS）系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量分析的方法。2、特點

具有分離分析雙重功能。與高效液相色譜法比較，具有多通道效應(yīng)，可同時平行分離分析多個樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點。目前隨著制板、點樣、展開等操作的儀器化及儀器性能的改進(jìn)，該法檢測的靈敏度，結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度均大大提高，在中藥及其制劑檢驗中，已成為重要的分析方法?！吨袊幍洹分杏?2個中成藥品種采用該法進(jìn)行含量測定。瑞士CAMAGSCANNER3薄層掃描儀島津CS-9000雙波長薄層掃描儀

二、儀器及其工作原理

1.薄層掃描儀中國藥典采用雙波長薄層掃描儀。常用的有島津CS-930型和CAMAG-Ⅱ型等。

2.掃描儀工作原理

三、操作方法（一）操作前的準(zhǔn)備

1、對照液和供試液的制備

2、市售薄層板（二）操作通法點樣→展開→上機(jī)掃描→數(shù)據(jù)處理

1、點樣

2、展開

3、上機(jī)掃描檢測方法：（1）吸收法（2）熒光法測定方式：（1）反射法（常用）（2）透射法掃描波長：（1）單波長（2）雙波長（藥典采用）掃描方式：（1）線形掃描（2）鋸齒掃描（常用）

4、數(shù)據(jù)處理

測定方法

（1）吸收法

適用于有紫外（可見）吸收的成分，較常用。該法又可采用反射法或透射法測定。理論上講，透射法比反射法優(yōu)越，但實際工作中常用反射法，因為紫外光不能通過玻板。

（2）熒光法

適用于有熒光性質(zhì)的成分，例如小檗堿等。該法僅采用反射法測定，其靈敏度比吸收法高。測定波長

（1）單波長

一般用于熒光測定法，即用某一波長的紫外光（激發(fā)光）進(jìn)行掃描。對玻板和斑點的質(zhì)量要求較高。

（2）雙波長

主要用于吸收測定法。該法可消除背景干擾，對玻板和斑點的質(zhì)量要求不高，故較常用。測定時，樣品波長（λs）和參比波長（λR）依次掃描斑點，所測吸收度為ΔA=Aλs

－AλR

樣品波長（λs）：即被測成分的λmax

參比波長（λR）：即被測成分的λmin或此波長處無吸收。光束掃描方式（1）直線掃描

適用于規(guī)則的斑點，僅用于熒光測定法。（2）鋸齒掃描

適用于不規(guī)則的斑點，測量誤差小，被測成分積分值重現(xiàn)性好，故吸收測定法常用此掃描方式。

6.光源（1）鎢燈（W）供可見光（370～700nm）測定，掃描有色成分的斑點。（2）氘燈（D2）供紫外光（200～370nm）測定，掃描有紫外吸收的成分斑點。（3）氙燈（Xe）供熒光測定，發(fā)射不連續(xù)光譜，常用波長為365nm。

四、含量測定方法（外標(biāo)法）

TLCS含量測定有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，中國藥典僅采用外標(biāo)法。

1.原理

外標(biāo)法系將一定量的供試品溶液和對照品溶液分別點加在同一塊薄層板上，展開，顯色，定位，掃描被測成分和對照品斑點，測得相應(yīng)的吸光度或熒光強度積分值，根據(jù)定量關(guān)系，計算出被測成分的含量。

2.類型

根據(jù)對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線性質(zhì)的不同，外標(biāo)法又分為外標(biāo)一點法和外標(biāo)兩點法。若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點，采用外標(biāo)一點法。若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點，采用外標(biāo)兩點法。

外標(biāo)一點法的直線方程：C=FAF為斜率

外標(biāo)兩點法的直線方程：

、

F1為斜率F2為截距3.操作步驟（1）對照品溶液的制備（2）供試品溶液的制備（3）點樣

一般要求使用市售薄層板。①外標(biāo)一點法：至少6個原點對照品（R）2個（同一質(zhì)量）：2R

供試品（S）4個（同一質(zhì)量）分2組：2S12S2②外標(biāo)兩點法：至少8個原點

對照品（R）4個分2組大質(zhì)量的2個：2R1

小質(zhì)量的2個：2R2

供試品（S）4個（同一質(zhì)量）分2組：2S1

2S2對照品與供試品應(yīng)交叉點加在同一塊薄層板上，目的在于消除各種誤差。測定時應(yīng)保證供試品原點的量在線性范圍內(nèi)，必要時可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點樣量。外標(biāo)兩點法外標(biāo)一點法（4）展開（5）顯色定位

供試品色譜中待測斑點的比移值（Rf值）和光譜掃描得到的吸收光譜最大吸收與最小吸收應(yīng)與對照品相符，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。（6）掃描應(yīng)沿展開方向掃描，不得橫向掃描。（7）含量計算

①外標(biāo)一點法▲求出供試品被測成分（斑點）的質(zhì)量Ms=MR

XAsARMs被測成分的質(zhì)量（Mn=2）MR被測對照品的質(zhì)量As被測成分吸收度（熒光強度）積分值（An=2）AR被測對照品吸收度（熒光強度）積分值（An=2）____▲求出供試品中被測成分的含量含量（W/W）=MsX稀釋倍數(shù)取樣量含量（W/片）=MsX稀釋倍數(shù)X平均片重取樣量②外標(biāo)兩點法

▲求出供試品斑點中被測成分的質(zhì)量Ms=?C+V1C(V2-V1)(A-A1)(A2-A1)Ms被測成分的質(zhì)量（mgn=2）A1對照品小點樣量吸收度V1對照品小點樣量（μl）（熒光強度）積分值（An=2）V2對照品大點樣量（μl）A2對照品大點樣（熒光強度）A被測成分吸收度（熒光強度）積分值（An=2）積分值（An=2）C對照液的濃度（mg/ml）---__五、應(yīng)用實例

1.九分散中士的寧的含量測定九分散是由馬錢子粉、麻黃、乳香和沒藥等制成。馬錢子粉中含有士的寧、番木鱉堿等生物堿，具生理活性但也有毒性，故需控制馬錢子含量。中國藥典規(guī)定按干燥品計每包含馬錢子以士的寧計應(yīng)為4.5～5.5mg。供試品溶液的制備

取本品10包，混合研勻。精密稱取2g置具塞錐形瓶中，精密加氯仿20ml與濃氨試液1ml，輕輕搖勻，稱重，于室溫下放置24小時，再稱重，補足氯仿減失的重量，充分振搖，濾過。精密量取濾液10ml，用硫酸溶液（3→300）分次提取，至生物堿提盡，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加濃氨試液使呈堿性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，殘渣中精密加氯仿5ml使溶解，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備

取士的寧對照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。測定法

吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液。（16∶12∶1∶4）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。照薄層色譜法進(jìn)行掃描，波長：λs=254nm，λR=325nm，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計算，即得。已知：AR＝19663.07，As＝20617.25，取樣量2.098g。

解答問題①采用外標(biāo)一點法還是外標(biāo)兩點法？②采用什么方法顯色定位？③計算每包藥品中馬錢子的含量。（保留兩位有效數(shù)字）①求出供試品斑點中士的寧的質(zhì)量②求出供試品中士的寧的含量Ms=MR

X=5μlx0.4μg/μlx=2.1μgAsAR19663.0720617.25含量（mg/包）=MsX

稀釋倍數(shù)X

標(biāo)示重量取樣量=0.0021mgX5mlX20mlX2.5g/包0.005mlX10mlX2.098g=5.0（mg/包）

2.枳實導(dǎo)滯丸中橙皮苷的含量測定本品系由枳實、大黃和黃連等八味藥材制成的水丸。中國藥典規(guī)定按干燥品計算，每1g含枳實以橙皮苷（C28H34O15）計，不得少于20.0mg。供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定（0.5124g），置索氏提取器中，加甲醇90ml，加熱回流4小時，趁熱濾過至100ml量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液與濾液合并，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，作為對照品溶液。測定法

精密吸取供試品溶液5?、對照品溶液2?與5?，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇為展開劑，展開，展距約3cm，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁的甲醇溶液，放置3小時，在紫外光燈(365nm)下定位。上機(jī)進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長：330nm,線性掃描，測量供試品與對照品熒光強度的積分值（AR(2?)=885.7AR(5?)=979.4AS=835.6），計算，即得。★①聚酰胺TLC分離黃酮類成分效果較好故選之。②橙皮苷與AlCl3反應(yīng)顯色，在330nm紫外光下發(fā)射較強的綠色熒光（波長：500nm）。

回答問題：

①本法采用的是吸收測定法還是熒光測定法？外標(biāo)一點法還是外標(biāo)兩點法？透射法還是反射法？直線掃描還是鋸齒掃描？光源是什么？②求算枳實（橙皮苷）的含量（保留三位有效數(shù)字），并判斷是否符合藥典規(guī)定。(V2-V1)(A-A1)(A2-A1)

①求算出斑點中橙皮苷的質(zhì)量

Ms=?

C+V1C=?0.05mg/ml+2ul?0.05mg/ml(979.4－

885.7)(5ul－2ul)(835.6－885.7)=0.0198ug(1.98X10mg)②求算出枳實（橙皮苷）在藥品中的含量含量（mg/g）=MsX稀釋倍數(shù)取樣量=-51.98X10mgX2.5X10ulX1.0X10ul-5555ulX5X10ulX0.5124g3=38.6第四節(jié)

高效液相色譜法（HPLC）一、概述

1、定義以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱為高效液相色譜法。

2、優(yōu)點“三高”、“一快”、“一廣”

分離效能高—反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果選擇性高—可將性質(zhì)相似的組分分離靈敏度高—10-11~10-13g，可適用于痕量分析分析速度快—幾~幾十分鐘完成分離，一次可以測多種樣品適用范圍廣—氣體、液體、固體物質(zhì)，

色譜柱可反復(fù)使用。

《中國藥典》中藥制劑含量測定最常用的分析方法。缺點：對未知物分析的定性專屬性差、需要與其他分析方法聯(lián)用3、類型

按固定相分類：液-液色譜法液-固色譜法按原理分類：分配色譜法（液-液色譜）吸附色譜法（液-固色譜）

液-液色譜法正相色譜法主要用于極性物質(zhì)的分離反相色譜法主要用于非極性物質(zhì)分離

二、色譜儀及其工作原理（P201圖）

高效液相色譜儀

一般由高壓輸液泵、進(jìn)樣閥、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或色譜工作站組成。

工作原理

系用高壓泵將流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，通過進(jìn)樣閥注入樣品溶液，流動相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離，被分離成分依次進(jìn)入檢測器，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的電信號，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或色譜工作站進(jìn)行處理而得到分析結(jié)果。1、高壓輸液系統(tǒng)是將貯液器中的流動相以高壓連續(xù)不斷地泵入裝有固定相的色譜柱。配制好的流動相應(yīng)用0.45um濾膜過濾，用前脫氣。2、進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用帶有定量管的六通進(jìn)樣閥。3、色譜柱最重要的分離部件，在中藥制劑的定量分析中，主要使用ODS柱。4、檢測器

HPLC最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，尚有二極管陣列檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器等。二、含量測定方法（外標(biāo)法）

內(nèi)標(biāo)法

外標(biāo)法藥物分析大多采用此法

1.系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

包括色譜柱的理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個指標(biāo)。其中分離度和重復(fù)性更具實用意義。

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗即用各品種項下規(guī)定的對照品和條件對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，應(yīng)符合要求。否則可對色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）考察柱效

在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的對照物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同,但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬(Wh/2),按下式計算色譜柱的理論板數(shù)。如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。

（2）分離度（R）考察分離效果在規(guī)定的條件下，注入對照液或供試液，記錄色譜圖，按下式計算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度。除另有規(guī)定，分離度應(yīng)大于1.5。

（3）重復(fù)性考察測量的精密度在規(guī)定條件下，取一定量的對照液，連續(xù)進(jìn)樣3～5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于2.0％。

（4）拖尾因子（T）

考察色譜峰的對稱性，保證測量的準(zhǔn)確度。特別是采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的T是否符合規(guī)定。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05之間。式中:W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。

2.對照品溶液的制備

3.供試品溶液的制備

4.測定法

將上述兩種溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖，按下式計算被測成分的含量。（1）求出供試液中被測成分的濃度C供

（2）求出藥品中被測成分的含量C供＝C對A對A供

三、應(yīng)用實例

1.牛黃解毒片中黃芩的含量測定本品由牛黃、大黃、黃芩、冰片、石膏等八味中藥制成。中國藥典以黃芩苷為指標(biāo)，采用HPLC測定其中黃芩的含量。

（1）色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

固定相：用十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），流速1ml/min；檢測器：紫外檢測器，檢測波長為315nm；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于3000。

（2）對照品溶液制備

精密稱取在60℃減壓干燥4小時的黃芩苷對照品適量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2μg的對照品溶液。

（3）供試品溶液制備

取牛黃解毒片20片，剝?nèi)ヌ且?，精密稱定（6.254g），研細(xì)，精密稱取1.045g，加70%乙醇30ml，超聲處理20分鐘，放冷，濾過，濾液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾于同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

（4）測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl進(jìn)樣，測得對照品及供試品中黃芩苷的峰面積分別為A供＝4340441，A對＝3945856。

2.藿香正氣水中厚樸酚與和厚樸酚總量的測定本品由蒼術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷等十味中藥制成的液體制劑，每支裝10ml（標(biāo)示裝量）。其中厚樸為要藥之一，故《中國藥典》采用HPLC，以厚樸酚及和厚樸酚的總量為指標(biāo)，控制厚樸的含量。

（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-乙腈-水（50:20:40）為流動相；檢測波長294nm。理論板數(shù)按厚樸酚峰計算應(yīng)不低于5000。

（2）對照品溶液的制備

取厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1ml含厚樸酚0.2mg、和厚樸酚0.1mg的溶液，搖勻，即得。

（3）供試品溶液的制備

精密量取裝量項下的本品5ml，加鹽酸2滴，用氯仿振搖提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并精密稀釋至10ml，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

（4）測定法

精密吸取上述三種溶液各10μl，分別注入液相色譜儀測定，根據(jù)對照品的峰面積（AR厚AR和）以及供試品中被測成分的峰面積（AS厚AS和）計算厚樸的含量。本品每支含厚樸以厚樸酚（C18H18O2

）及和厚樸酚（C18H18O2）的總量計，不得少于5.8mg。

混合對照品.和厚樸酚厚樸酚樣品2.和厚樸酚

3.厚樸酚5.6.其他成分峰

四、安全操作注意事項

1.流動相需用微孔濾膜（0.45μm）濾過并脫氣才可使用。

2.開泵后，先打開沖洗鍵（PURGE）進(jìn)行泵排氣。然后將流動相接入色譜柱充分沖洗平衡，待基線穩(wěn)定后方可進(jìn)樣。

3.測試溶液需用微孔濾膜（0.45μm）濾過。

4.使用鍵合硅膠柱，流動相的PH值應(yīng)控制在2～8，否則色譜柱很容易損壞。

5.由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于使用C18柱的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5％。否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值的改變，造成色譜系統(tǒng)的不穩(wěn)定。

6.工作完畢，應(yīng)先后用水和甲醇充分沖洗液路系統(tǒng)，尤其是使用了含鹽的流動相，更應(yīng)充分沖洗。第五節(jié)氣相色譜法（GC）

氣相色譜與液相色譜的根本區(qū)別：流動相不同

一、概述1、定義

以氣體為流動相（亦稱載氣）的色譜分析法稱氣相色譜法。

2、特點

分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等。在中藥制劑中主要用于揮發(fā)油及其他揮發(fā)性組分的含量測定，還可用于水分、乙醇量的測定。但本法也存在一定局限性，它對揮發(fā)性差或遇熱易分解破壞的物質(zhì)難以分析。

3、分類

1.按固定相狀態(tài)分類：氣固GC、氣液GC2.按分離原理分類：吸附GC、分配GC3.按色譜柱分類：填充柱GC、毛細(xì)管柱GC（分辨率高（n>10）常用于農(nóng)殘分析）

二、儀器及其工作原理

工作原理

加熱分析樣品使其氣化，由載氣帶入色譜柱，由于各組分在固定相與載氣間分配系數(shù)不同，故在色譜柱中移動速度不同，經(jīng)一段時間后彼此得到分離，再依次被載氣帶入檢測器，將各組分的濃度或質(zhì)量轉(zhuǎn)換成電信號并記錄成色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰高或峰面積而進(jìn)行定量分析。

五、含量測定

內(nèi)標(biāo)法

常用于藥物分析。外標(biāo)法少用，因為GC進(jìn)樣量小，造成的誤差較大。

1.色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

（1）色譜條件

主要包括載氣、色譜柱、檢測器、固定液（相）測試溫度、進(jìn)樣量、載體等。其中檢測器種類、固定液品種、以及色譜柱的材質(zhì)不得改變，其它的如柱子的內(nèi)徑和長度、載體的種類和粒度、固定液涂布的濃度、載氣的流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)系統(tǒng)適用性試驗的要求。①載氣：一般為N2，還可用H2、He。

②色譜柱：玻璃柱和不銹鋼柱。③檢測器:

氫火焰離子檢測器（氫焰檢測器FID）適合有機(jī)物檢測，靈敏度高，應(yīng)用廣泛。

熱導(dǎo)檢測器（TCD）

無機(jī)物、有機(jī)物均可檢測，靈敏度較低，用于水分測定。電子捕獲檢測器（ECD）

適合含鹵素、硫、氮等電負(fù)性強的元素的化合物測定。用于農(nóng)殘測定。④柱填料：吸附劑：硅膠、氧化鋁等。較少用。高分子多孔小球：常用二乙烯苯乙基乙烯苯型的。氣固吸附GC

例如甲（乙）醇量、水分的測定。涂漬固定液的載體（多用）：常用經(jīng)酸洗并硅烷化的硅藻土（紅色載體、白色載體）屬氣液分配GC。⑤固定液：常用甲基聚硅氧烷（如SE-30、OV-17等）、聚乙二醇（如PEG-20等），一般涂布濃度為5～25％。（2）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗（同HPLC）2.內(nèi)標(biāo)法（同乙醇量測定法）（1）標(biāo)準(zhǔn)液的制備（2）供試液的制備（3）校正因子（f）的測定

內(nèi)標(biāo)法特有的參數(shù)。

內(nèi)標(biāo)法測定時，同一檢測器對不同（被測成分和內(nèi)標(biāo)物）具有不同的響應(yīng)值，故不能用峰面積直接計算的被測成分的含量，要引入校正因子。校正因子（f）藥典中采用的是相對重量校正因子（fw）。其定義為：被測成分（i）單位峰面積所相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)量（Mi/Ai）是內(nèi)標(biāo)物（s）單位峰面積所相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)量（Ms/As）的多少倍。

內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：①應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)。②加入量應(yīng)接近于被測成分。③其色譜峰應(yīng)位于被測成分色譜峰附近且與之完全分離。

Mi/Aifw=Ms/As

六、應(yīng)用實例

十滴水軟膠囊中樟腦含量的測定本品由樟腦、干姜、大黃、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中藥制成，樟腦是其主成分之一，具升華性，故采用氣相色譜法，以樟腦為對照品，薄荷腦為內(nèi)標(biāo)物，對其進(jìn)行含量測定。

1.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以聚乙二醇（PEG）-20M為固定相，涂布濃度為10%，柱溫150℃。理論塔板數(shù)按樟腦峰計算應(yīng)不低于2000，樟腦峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2。

2.校正因子測定

精密稱取樟腦對照品（r）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷腦內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(s)50mg，加無水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1～2μl，注入氣相色譜儀，Ar=211948、As=215835，計算校正因子（保留四位有效數(shù)字）。

3.測定法

取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，取0.8g，精密稱定（0.7956g），置具塞試管中，用無水乙醇提取5次，每次4ml，分取乙醇提取液，合并，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，精密加入薄荷腦125mg，使溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液(i＋s)。精密量取1～2μl，注入氣相色譜儀測定，Ai＝108685、As＝123544，計算即得（保留兩位有效數(shù)字)。解答問題①本法屬于氣液分配GC還是氣固吸附GC？②使用哪種載氣？哪種檢測器？③采用的是外標(biāo)法還是內(nèi)標(biāo)法？④求算樟腦的含量。藥典規(guī)定，本品每粒含樟腦不得少于53mg。（平均粒重0.425g／粒）求算校正因子（f）

f=(As/AR)X(MR/Ms)=(215835/211948)/(50mg/50mg)

＝1.108求算供試液中樟腦的濃度Ci（mg/ml）Ci=fCs=1.108XX5mg/ml=6.30mg/mlAsAi123544108685求算藥品中樟腦的含量（mg／粒）含量＝795.6mg6.30mg/mlX25mlX425mg/粒＝84第六節(jié)其他測定法一、容量分析法容量分析法又稱滴定分析法。它是將一種已知準(zhǔn)確濃度的滴定液加到被測物質(zhì)溶液中，直到兩者完全反應(yīng)，根據(jù)滴定液的濃度及消耗的體積確定被測物含量的方法。根據(jù)滴定液與被測物發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)類型不同，可分為酸堿滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化還原滴定法。多數(shù)滴定反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行，當(dāng)被測物不溶于水或因其他原因不能以水為溶劑時，可采用非水溶劑作滴定介質(zhì)。在中藥制劑的含量測定中，滴定分析法常被用來測定生物堿的含量或某些礦物藥的含量。滴定：用滴定管將標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到樣品溶液中的過程。（一）生物堿的含量測定一般包括三個步驟——提取、分離精制與含量測定。

1．提取:稱取一定量的藥材，根據(jù)生物堿的溶解性能堿化后用有機(jī)溶劑提取或用酸水或用乙醇提取得游離生物堿或其鹽類。提取方法用冷浸法、滲漉法、回流提取法、離子交換法均可。

2．分離精制:多用溶劑法。利用生物堿在酸水中成鹽，不溶于有機(jī)溶劑，堿化后游離易溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，反復(fù)于分液漏斗中萃取精制。有時亦可加某些試劑使雜質(zhì)沉淀而除去或用氧化鋁柱層析法去除雜質(zhì)。

3．含量測定:以容量法應(yīng)用最多。容量法中又以酸堿滴定法較簡便常用。分類：酸堿滴定法、非水酸堿滴定法；直接法、間接法。間接法：將用上述方法提取精制所得的生物堿溶于過量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)堿液回滴，從消耗的酸量算出生物堿的含量。

非水滴定法：高氯酸—冰醋酸系統(tǒng)應(yīng)用實例P223北豆根膠囊（片）中總生物堿的含量測定本品為北豆根中提取的總生物堿片。滴定法—蝙蝠葛堿【實驗?zāi)康摹?、掌握酸堿滴定法測定中藥片劑中生物堿含量的原理和方法。2、熟悉酸堿滴定法測定中藥片劑的供試品前處理方法?！緦嶒炘怼?/p>

北豆根片具有清熱解毒，消腫利咽的功效。其主要成分是蝙蝠葛堿，先加入定量過量的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使生物堿全部成鹽后，剩余的硫酸再用氫氧化鈉滴定液回滴。根據(jù)所消耗的氫氧化鈉的量，計算出剩余硫酸的量，求出和生物堿發(fā)生反應(yīng)的硫酸的量，即可算出被測生物堿的量。【實驗步驟】1、取本品20片，精密稱定，置研缽中，研細(xì)。2、精密稱取適量（約相當(dāng)于總生物堿80mg）置具塞錐形瓶中，加醋酸乙酯25ml，振搖30分鐘，濾過，用醋酸乙酯10ml分三次洗滌容器及濾渣，洗液與濾液合并置蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，加無水乙醇10ml使溶解。3、用25ml移液管加硫酸滴定液(0.01mol/L)25ml

與甲基紅指示液2滴，用氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)

滴定至黃色，即得。每1ml

的硫酸滴定液(0.01mol/L)相當(dāng)于6.248mg蝙蝠葛堿(C38H44N2O6)。本品含生物堿以蝙蝠葛堿(C38H44N2O6)計，應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0％。標(biāo)示含量計算公式為：總生物堿（%）=（25.00-VNaOH）×6.248×WW×標(biāo)示量×100%【注意事項】1、堿性滴定管在使用前首先檢查是否漏水。2、在加入氫氧化鈉滴定液前，堿性滴定管應(yīng)先用氫氧化鈉滴定液蕩洗2～3次（每次5～10ml）。3、裝好滴定液后，應(yīng)檢查滴定管尖有無氣泡，有則排氣泡，排除氣泡后，調(diào)節(jié)液面在0.00ml刻度，并記下初讀數(shù)。4、讀數(shù)時，必須讀到小數(shù)點后兩位，即要求估計到0.00ml。5、臨近終點時，應(yīng)半滴加入。【討論】1、加入硫酸液（0.01mol/L）后，蝙蝠葛堿有什么變化？2、加硫酸滴定液時為什么用移液管，而不能用量筒量?。克釅A滴定容量瓶移液管滴定管二、浸出物測定法（一）概述

1、定義

浸出物測定法系根據(jù)制劑中化學(xué)成分的溶解性，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┙?提取)樣品，并測定浸出物（提取物）的含量，以此來控制藥品的質(zhì)量。2、意義

這是一種較為粗略的定量分析方法。但對于有效成分不明確或無法建立確切的定量分析方法的中藥材及其制劑，尚具有一定的意義。

《中國藥典》附錄收載了三種測定方法：水溶性浸出物測定法、醇溶性浸出物測定法和揮發(fā)性醚浸出物測定法。有的品種還采用了乙酸乙酯浸出物測定法。供試品需粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻。

《中國藥典》收載的中成藥浸出物測定品種及其規(guī)定見表6-4。

類別品名溶劑方法限度（%）醇溶性浸出物測定七厘散乙醇熱浸法≥60.0刺五加浸膏甲醇熱浸法≥60.0刺五加片甲醇熱浸法≥80mg/片兒康寧糖漿正丁醇

≥3.0獨一味膠囊正丁醇

≥8.0鼻竇炎口服液正丁醇

≥1.2揮發(fā)性醚浸出物測定午時茶顆粒乙醚

≥0.35沉香化氣丸乙醚

≥0.40

乙醚

≥0.10九味羌活丸乙醚

≥0.30龜齡集乙醚

≥0.25水浸出物測定暑癥片

冷浸法≥25.0乙酸乙脂浸出物測定

（二）水溶性浸出物測定法

本法系以水為溶劑，對制劑中水溶性成分進(jìn)行提取，并計算其在制劑中的含量(%)。本法包括冷浸法和熱浸法。后者適用于不含或少含淀粉、粘液質(zhì)等成分的樣品。

1．冷浸法取供試品約4g，稱定重量，置250~300ml的錐形瓶中，精密加入水100ml，塞緊，冷浸，前6小時內(nèi)時時振搖，再靜置18小時，用干燥濾器迅速濾過，棄去初濾液，精密量取濾液20ml，置己干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴蒸干后，于105℃干燥3小時，移置干燥器中，冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量，除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量（W/W%）。含量（W/W%）=×100%mi

為水溶性浸出物重量（g）

ms為干燥供試品的重量（g）=供試品重量×（1﹣含水量%)）2.熱浸法(中成藥較少用自學(xué))3.實例暑癥片的水溶性浸出物測定（P220）mi×10020×ms（三）醇溶性浸出物測定法本法系以甲醇、乙醇或正丁醇為溶劑，提取藥品中相應(yīng)的醇溶性成分，并計算其含量（%）。正丁醇浸出物測定法主要用于含較多皂苷類成分的制劑，更具專屬性。

1.甲醇、乙醇浸出物的測定

照水溶性浸出物測定法測定。

2.正丁醇浸出物的測定

按各品種項下規(guī)定的方法測定。一般說來，水溶液制劑可直接用水飽和的正丁醇提取數(shù)次，合并提取液，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，置105℃干燥3小時，移置干燥皿中，冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量，計算供試品中正丁醇浸出物的含量（W/V%）。固體制劑可先加水溶解，移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取數(shù)次，合并提取液，照上述方法蒸干，干燥，稱定浸出物重量，計算出制劑中正丁醇浸出物的含量（W/W%）。3.注意事項（1）稱