免疫病原微生物學(xué)進(jìn)展

基因工程疫苗制備原理與產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀Lecture19重組疫苗（基因缺失疫苗）重組載活體疫苗重組亞單位疫苗基因疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗基因工程疫苗種類“標(biāo)記”疫苗

基因添加疫苗

野病毒基因弱毒病毒基因非毒力基因鑒定克隆該關(guān)鍵基因至質(zhì)粒將該關(guān)鍵基因與野毒株基因結(jié)合穩(wěn)定低毒力基因

重組病毒構(gòu)建原理（I)1.該類疫苗安全性好、不易返祖；2.免疫接種與強(qiáng)毒感染相似，機(jī)體可對(duì)病毒多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答；3.免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長(zhǎng)，局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生粘膜免疫力;。4.缺失的基因及其編碼的產(chǎn)物可作為一種檢測(cè)標(biāo)志用于免疫與感染動(dòng)物的鑒別診斷。

基因缺失疫苗genedeletedvaccines優(yōu)點(diǎn):缺失與毒力相關(guān)基因及病毒復(fù)制非必需的基因常被缺失基因：胸腺激酶基因(TK)

痘苗病毒TK基因缺失單純皰疹病毒(HSV)的22毒力基因缺失、TK基因缺失牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)TK基因缺失疫苗缺點(diǎn)是疫苗病毒具有潛伏性偽狂犬病病毒TK基因缺失苗

1986年獲美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)投放市場(chǎng)缺失非必需基因

單復(fù)制周期病毒(Single-cycleviruses)

缺失的基因只是在病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)所必需病毒可完成其復(fù)制周期，也可從感染細(xì)胞釋放出來，但釋放的病毒無感染性缺失糖蛋白H基因的單純皰疹病毒

復(fù)制缺陷型病毒(replicationdefectivevirus)

流產(chǎn)性感染（如：雞痘病毒與金絲雀痘病毒）病毒復(fù)制早期蛋白基因，E1a缺失的腺病毒

缺失必需基因

如缺失gH糖蛋白的HSV突變株在免疫宿主的細(xì)胞中能完成一個(gè)復(fù)制周期，但在體內(nèi)還是體外均不在細(xì)胞間傳染，將此疫苗用于鼠模型中，可產(chǎn)生與野毒株感染一樣強(qiáng)的免疫反應(yīng)。能抵抗HSV-1強(qiáng)毒攻擊，該疫苗的保護(hù)效果、細(xì)胞免疫水平比滅活苗高。單復(fù)制周期病毒產(chǎn)生的病毒特異性CTLs與野毒感染相同?；蛉笔缂嬗腥醵疽呙缂皽缁钜呙绲膬?yōu)點(diǎn)。偽狂犬病毒缺失疫苗：缺失gD基因的PRV雖可在動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞間傳染，但不會(huì)在畜群間傳播。

缺失越是后期必需的基因，誘發(fā)的免疫反應(yīng)越強(qiáng)從cDNA克隆拯救感染性病毒

病毒全長(zhǎng)感染性cDNA克隆技術(shù)反向遺傳操作技術(shù)(ReverseGenetics)

“病毒拯救(rescueofvirus)

重組病毒構(gòu)建原理（II)“分段克隆”策略：將病毒基因組各片段順次克隆。低拷貝載體：復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高沉默突變：在構(gòu)建cDNA克隆時(shí)，一般均在一處或幾處合適的位置上進(jìn)行沉默突變，便于鑒定拯救出的病毒?；蚪M3’末端和5’末端的克隆采用cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)

基因組全長(zhǎng)片段的克隆Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆舉例

mRNABHK21細(xì)胞病毒子接點(diǎn)插入位點(diǎn)PRRSVNDV--微型基因組的構(gòu)建與共轉(zhuǎn)染啟動(dòng)子病毒基因組片段病毒前導(dǎo)序列尾隨序列輔助重組質(zhì)粒NP、P和L蛋白共轉(zhuǎn)染微型基因組流感病毒:NP、PB1、PB2、PA

Menlenbarg等（2000，2003）NSPGP2GP3GP4GP5MN

FMDV蛋白酶2A基因

人A型流感病毒HA基因抗原表位

感染性cDNA克隆舉例

mRNABHK21細(xì)胞病毒子接點(diǎn)插入位點(diǎn)PRRSV病毒復(fù)制非必需片段基因鑒定病毒復(fù)制非必需片段基因克隆外源基因插入非必需片段基因中間(即重組載體)將病毒基因和重組載體基因共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，同源重組，產(chǎn)生感染性病毒粒子篩選穩(wěn)定的重組病毒重組病毒活載體研制原理重組病毒載體

痘病毒載體

(fowlpox,canarypox)

皰疹病毒載體桿狀病毒載體腺病毒載體

RNA病毒

NDV，PRRSV，PoliovirusSindbisvirus(Alphaviruses)

痘病毒載體基因組容量大、含多個(gè)非必需區(qū)基因，適于插入多個(gè)外源基因(可達(dá)40kb)，易于構(gòu)建，表達(dá)水平高。宿主范圍廣、增殖滴度高、抗原性穩(wěn)定，免疫原性持久，能夠同時(shí)誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫，相對(duì)安全。

缺點(diǎn)：種痘后局部反應(yīng)較大。(百萬分之一)

抗原性強(qiáng)，不能多次使用。禽類痘病毒，引起頓挫型感染，但卻可以持續(xù)表達(dá)外源基因，并且不影響再次接種

痘病毒載體①啟動(dòng)子②外源病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因③終止子④非必需區(qū)同源序列痘病毒載體構(gòu)建時(shí)，應(yīng)考慮的主要因素①啟動(dòng)子痘病毒與其他大多數(shù)DNA病毒不同，是在胞漿內(nèi)復(fù)制，病毒DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，必須靠其自身合成的RNA聚合酶，因此在痘病毒內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)，必須使用痘病毒自身的啟動(dòng)子。在痘苗病毒和禽痘病毒載體構(gòu)建時(shí)，外源基因前多使用來自于痘苗病毒的早期啟動(dòng)子P7.5，或晚期啟動(dòng)子PL11。②外源病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因由于痘病毒不具有編接機(jī)制，外源病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因應(yīng)為其連續(xù)編碼區(qū)，不能有內(nèi)含子或間隔區(qū)。③終止子為了不影響痘病毒載體基因的正常表達(dá)，在使用早期啟動(dòng)子時(shí)，在3′末端加上早期基因轉(zhuǎn)錄終止子T5NT；采用晚期啟動(dòng)子時(shí)不必考慮終止子問題，晚期啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可在痘病毒基因組中被終止。痘病毒不識(shí)別其他真核基因的轉(zhuǎn)錄終止子。④非必需區(qū)同源序列由于將外源性病毒基因?qū)攵徊《镜臋C(jī)制是同源重組，因此，在構(gòu)建載體時(shí)，必須在外源目的基因及啟動(dòng)子兩側(cè)帶有痘病毒基因組的同源序列。同源序列一般取自于病毒復(fù)制非必需區(qū)，這樣可以保證病毒的復(fù)制能力不受影響。痘病毒載體中表達(dá)的外源基因V.VHIVgag/pol，core，gp160，envFPVNDVHA/NA，F(xiàn)usion，F(xiàn)usion/HA/NPV.VPRVgp50/gp63,gp50/63/I/XCPVMeaslesF/HA,FusionV.V/CPVRabiesGV.V.InfluenzaHAFPVIBDVVP2V.V.FLVenv表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的重組痘苗病毒表達(dá)牛瘟病毒F和HA蛋白的重組痘苗病毒疫苗表達(dá)新城疫病毒F和HN蛋白表達(dá)禽流感病毒的HA和NP蛋白馬立克氏病毒SB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白牛白血病病毒膜蛋白貓白血病毒膜蛋白牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒囊膜蛋白痘病毒活載體疫苗舉例

人Ad2和Ad5：外源基因容量為20kb左右。

E3：病毒復(fù)制的非必須區(qū)，允許插入的外源基因的最大長(zhǎng)度為4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表達(dá)調(diào)控元件，利用腺病毒本身的調(diào)節(jié)元件，即外源基因可插在E3啟動(dòng)子后,在感染早期有效表達(dá)。[HSsAg、HIV-1、狂犬病毒]E1：為病毒復(fù)制必須區(qū)。缺失E1區(qū)的人腺病毒必須在特殊的工程細(xì)胞中（比如293細(xì)胞系（人胚腎細(xì)胞））或非缺失的腺病毒輔助下才能復(fù)制增殖，因此稱為病毒缺陷型載體。腺病毒載體腺病毒載體優(yōu)點(diǎn)

腺病毒比較安全。腺病毒的靶細(xì)胞范圍廣:復(fù)制分裂細(xì)胞、非復(fù)制分裂細(xì)胞。腺病毒容易制備，對(duì)熱不敏感，高滴度增殖。腺病毒可以在腸道及呼吸道繁殖，能誘導(dǎo)粘膜免疫，能制成藥囊經(jīng)口服途徑接種以預(yù)防消化道及呼吸道感染。

Ad2、Ad5等啟動(dòng)子較強(qiáng)，能高水平表達(dá)外源基因，特別是換以更強(qiáng)的啟動(dòng)子如CMV早期啟動(dòng)子后，更可明顯提高外源基因的表達(dá)水平。常規(guī)的構(gòu)建方法：

在E1區(qū)插入一個(gè)表達(dá)盒：包括啟動(dòng)子、外源基因和polyA序列

啟動(dòng)子：巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子

Rous肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng)末端重復(fù)(ITR)/增強(qiáng)子序列，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)和三聯(lián)先導(dǎo)序列(TPL)。表達(dá)盒的方向?qū)τ诒磉_(dá)不太重要，但有文章報(bào)道以CMV早期啟動(dòng)子的表達(dá)盒右向表達(dá)β-gal比反向的表達(dá)的高7倍。缺失E1的病毒載體安全E3區(qū)編碼的gp19蛋白降低感染細(xì)胞MHC-I類抗原的表達(dá)，因而缺失該基因的載體可以更有效地將外源基因提供給宿主免疫系統(tǒng)B型肝炎病毒、呼吸道合胞體病毒

HIV、SIV

水皰性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛皰疹病毒I型牛冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒

重組腺病毒構(gòu)建成功舉例基因組較大，約150kb，含70個(gè)編碼基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容納多個(gè)外源基因的插入。大多數(shù)皰疹病毒的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會(huì)產(chǎn)生流行病學(xué)方面的不良后果(偽狂犬病毒除外)

。許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構(gòu)建的載體活疫苗可經(jīng)粘膜途徑提呈抗原，誘導(dǎo)特異性粘膜免疫。皰疹病毒作為活載體表達(dá)外源基因作為疫苗的研究：

皰疹病毒載體火雞皰疹病毒活載體

NDVF和HN基因，

HVT/MDVgB重組病毒:CEF:2.2×105PFU/ml。

HVT/緩發(fā)型NDVHitchnerB1株的F和HN基因

HVT/IBDVVP2基因。皰疹病毒活載體的應(yīng)用

豬偽狂犬病病毒弱毒株構(gòu)建活載體疫苗口蹄疫病毒VPl基因豬瘟病毒E2基因豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因豬流感病毒HA基因牛I型皰疹病毒

FMDVVP1基因、PRV的gⅢ基因雞傳染性喉氣管炎病毒禽流感病毒HA基因皰疹病毒活載體的應(yīng)用

脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)疫苗安全、可口服，易增殖，滴度高。

PV表達(dá)的外源性病毒蛋白以嵌合的形式存在于病毒顆粒表面可以構(gòu)建成多價(jià)載體疫苗病毒基因組容量較小，插入的外源基因片段大小有限插入不當(dāng)會(huì)造成致死性突變形成的嵌合體病毒增殖較慢外源性病毒抗原的免疫原性較弱

PV-人免疫缺陷病毒、PV-人乳頭瘤病毒嵌合體病毒

PV-FMDV嵌合體病毒小RNA病毒載體

負(fù)鏈RNA病毒，RNA沒有感染性，不能自行復(fù)制。流感病毒核糖核蛋白體(RNP)的重組及轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，可以使重組的RNA能夠復(fù)制并具有感染性，即用提純的病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)已被輔助病毒感染的細(xì)胞。流感病毒可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，并能產(chǎn)生

IgA介導(dǎo)的粘膜免疫流感病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期中，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA，并整合到宿主細(xì)胞的染色體中，因此，同其它RNA病毒相比，構(gòu)建感染性前病毒分子克隆相對(duì)容易?；蚪M8～10kb，非必需區(qū)很小，外源基因的容量很小。可作為將外源基因?qū)塍w細(xì)胞的工具，用于基因治療。表達(dá)禽流感病毒的血凝素(H7)基因，免疫雞用強(qiáng)毒株H7N7

攻擊后完全獲得保護(hù)。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體①生產(chǎn)成本和接種使用成本低，類似于常規(guī)弱毒疫苗；②能真實(shí)地再現(xiàn)外源基因編碼蛋白后的抗原性，并能全方位地激發(fā)免疫應(yīng)管，包括細(xì)胞介導(dǎo)免疫，體液免疫以及局部規(guī)模免疫；③提呈免疫的單一性類似亞單位疫苗，但不需佐劑，如果載體病毒安全，則不會(huì)引起疾??；④免疫接種和自然感染動(dòng)物，用特異性診斷試劑可進(jìn)行鑒別；⑤在同一病毒載體中插入多種免疫原基因，可構(gòu)建多價(jià)疫苗。具備活疫苗的免疫效力和低成本及滅活疫苗的安全性。病毒活載體疫苗優(yōu)缺點(diǎn)小結(jié)優(yōu)點(diǎn)病毒活載體疫苗的缺點(diǎn)：使用同一載體的不同疫苗不能同時(shí)使用解決辦法：①構(gòu)建多價(jià)疫苗②構(gòu)建多種可用的載體③建立合理的免疫程序病毒活疫苗、滅活疫苗及病毒活載體疫苗配合應(yīng)用。

格氏鏈球菌、木糖鏈球菌：人的皮膚共棲菌，可作為表面定居的融合蛋白載體乳酸桿菌：腸道和陰道內(nèi)的共棲菌，但出現(xiàn)時(shí)間很短。腸道菌（大腸桿菌、霍亂弧菌、結(jié)腸耶耳森氏菌、志賀氏菌）

大腸桿菌/TGEVS蛋白的融合蛋白，CS31A:腹腔注射免疫鼠（加佐劑）刺激產(chǎn)生顯著的血清抗體應(yīng)答。大腸桿菌/艾美球蟲子孢子蛋白的118氨基酸與β-半乳糖苷酶融合:接種雞，可產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。4.沙門氏菌

細(xì)菌性活載體

能運(yùn)送抗原至腸道的淋巴組織，并引起分泌免疫反應(yīng)，其中分泌性IgA浸潤(rùn)所有的粘膜表面及外分泌腺體的分泌物中。傷寒沙門氏菌在人體、鼠傷寒沙門氏菌在小鼠能在寄主腸道中定居，并在腸道淋巴組織、肝和脾中增殖。沙門氏菌人工突變后，它們?nèi)阅茉谀c道淋巴組織中定居?？捎糜诒磉_(dá)各種定居因子、毒性抗原基因的載體，以遞呈這些抗原到腸道淋巴組織。沙門氏菌活疫苗載體

基本特性營(yíng)養(yǎng)缺陷質(zhì)粒補(bǔ)救系統(tǒng)

該系統(tǒng)的寄主是某一營(yíng)養(yǎng)代謝物的染色體突變株，而轉(zhuǎn)移質(zhì)粒則帶有與寄主突變互補(bǔ)的非同源基因。整合表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)鞭毛表達(dá)系統(tǒng)。

沙門氏菌活載體表達(dá)系統(tǒng)FMDVVP1基因的10個(gè)氨基酸殘基的DNA片段嵌合到

E.coli.K-12菌株的外膜蛋白基因中，實(shí)現(xiàn)融合蛋白表達(dá)

E.coli外膜蛋白(Lamb)-乳多空病毒的VPl抗原決定簇乙肝病毒的S2的兩個(gè)抗原決定簇DNA片段-E.coli菌體

FMDV多肽-E.coliP4菌株纖毛大腸桿菌載體疫苗腸毒素性大腸桿菌(ETEC)-產(chǎn)氣莢膜梭菌p—毒素(羔羊痢疾、犢牛腸毒血癥等)的基因工程重組細(xì)菌毒素疫苗寧夏大學(xué)王玉炯已完成全部實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和田間試驗(yàn)在寧夏、內(nèi)蒙、遼寧、山東和吉林等省進(jìn)行區(qū)域性試驗(yàn)，受試羊53000只，受試牛12000頭免疫保護(hù)率達(dá)到90％以上該疫苗正在申請(qǐng)新獸藥證書，即將進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。幼畜腹瀉雙價(jià)基因工程苗

轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原蛋白經(jīng)純化后仍保留了免疫學(xué)活性，注入動(dòng)物體內(nèi)能產(chǎn)生特異性抗體；用轉(zhuǎn)基因植物組織飼喂動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原遞呈到動(dòng)物的腸道相關(guān)淋巴組織，產(chǎn)生粘膜和體液免疫應(yīng)答。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenicplantvaccine）食用疫苗（ediblevaccine）

1.整合表達(dá)系統(tǒng)：把編碼病原體保護(hù)性抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，并整合到細(xì)胞染色體上，形成表達(dá)疫苗的植物品系。2.瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)：用植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中。再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配而得以高效表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗的表達(dá)系統(tǒng)安全性好：疫苗中不含傳染性材料，接種后不會(huì)發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況。減少或消除了常規(guī)疫苗有害的反應(yīng)原：熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原等穩(wěn)定性好：便于保存和運(yùn)輸，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅計(jì)劃。將高度危險(xiǎn)和致病的病原體的免疫原性蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)移到不致病而且無害的微生物，用于大量生產(chǎn)，安全性更好?？捎糜谕鈦聿〔≡w和不能培養(yǎng)的病原體。優(yōu)點(diǎn)：重組亞單位疫苗構(gòu)建原理

保護(hù)性抗原的基因原核或真核表達(dá)載體

原核或真核細(xì)胞

保護(hù)性抗原肽鏈

重組亞單位疫苗佐劑

表達(dá)系統(tǒng)：

原核生物：E.coli；枯草桿菌（Bacillussubtilis）酵母真菌昆蟲細(xì)胞(桿狀病毒)

哺乳類細(xì)胞關(guān)鍵：研究和了解在各種表達(dá)系統(tǒng)中基因表