高效液相色譜分析ppt

高效液相色譜分析ppt1第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二基本概念與特點

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線檢測器，從而發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學(xué)和技術(shù)的不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分離分析手段.特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。2第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相間進行反復(fù)多次分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進而各組分在柱中的移動速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱，彼此分離開來，最后按一定順序流出。3第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二色譜圖及相關(guān)名詞（一）色譜流出曲線—色譜圖

色譜圖是色譜柱流出物通過檢測器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間或液體流出體積的曲線。

色譜流出曲線是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是用來觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標。另外，還可以直接利用色譜圖峰位置點（特征保留值）進行定性，根據(jù)曲線上測得的峰高或峰面積進行定量。4第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（二）柱效能

色譜柱在色譜分離中由動力學(xué)因素所決定的柱效能，通常用塔板高度或塔板數(shù)表示。塔板數(shù)：

塔板高度：渦流擴散相分子擴散相流動相線速度傳質(zhì)阻力相5第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（三）分離度R分離度的表達式：tR(2),tR(1):組分2和組分1的保留時間Wb(2),Wb(1):組分2和組分1的峰底寬度6第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二R=1.5完全分離7第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程高壓泵色譜柱廢液檢測器進樣器儲液瓶高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器8第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。

高壓泵主要有恒流泵（往復(fù)泵）和恒壓泵（氣動泵）兩種。恒流泵特點輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)。分為機械注射泵和機械往復(fù)泵(常用)兩種。恒壓泵特點能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。

9第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二電動機偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑圖10-7柱塞往復(fù)泵示意圖10第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（三）色譜柱

色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對建立適用性強、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。

1.擔體

高效液相色譜的柱填料有離子交換樹脂、凝膠，較多的使用硅膠微粒作為擔體。以下為幾種常用的微粒類型：

(1)全多孔型擔體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質(zhì)，所以最為常用。(2)表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）：

它是直徑為30～40μm的實心核(玻璃微珠)，優(yōu)點是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易于填充均勻，柱效高。這種擔體目前應(yīng)用較為普遍。11第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二2.色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，標準內(nèi)經(jīng)為4.6或3.9mm，柱長15～30cm，填料顆粒粒度5－10μm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度(3－5μm)和柱經(jīng)以提高柱效。

為保護色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護柱。

12第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二3.固定相選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎(chǔ)。如果溶質(zhì)溶于烴類溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可以選擇非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。13第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二4.流動相

液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫劑。流動相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，改變流動相的組成和極性（組成比例）是提高分離度的有效手段。常用溶劑：環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。14第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二正相液相色譜（正相柱）固定相極性>流動相極性反相液相色譜（反相柱）固定相極性<流動相極性組分極性越大，保留時間越長；使用極性化合物的分離。組分極性越小，保留時間越長；適用非極性化合物的分離。15第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二

選擇流動相時應(yīng)注意的問題1、盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。2、避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。16第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二3、試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4、流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。17第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（四）檢測器（一）、紫外檢測器—應(yīng)用最廣泛的檢測器基本原理：試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系符合郎伯-比耳定律。優(yōu)點：靈敏度高，線形范圍寬；死體積??；波長可選；對流速和溫度變化不敏感；可用于梯度洗脫。缺點：無紫外-可見吸收組分不響應(yīng)；流動相選擇受一定限制。18第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器19第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（二）、示差折光檢測器—通用型檢測器每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)?；驹恚哼B續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動相中的組分濃度成正比。

生命科學(xué)中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般要用示差折光檢測器。

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缺點：靈敏度低；對溫度敏感；不能用于梯度洗脫。21第二十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（三）、熒光檢測器—專用型檢測器基本原理：在一定的條