秋季16內(nèi)分泌代謝課件

?β1?1ββ FACSFACS篩選出GFRAL實驗材料：NN6K平臺：HEK Ab：anti-Fab-PE，strepavidine-binding+/-。右上：40%的cell為hGFRAL(ECD)expression+GDF15binding+，證明了和GDF15receptor(ECDexpression+GDF15binding-FACSFACSSPR進一步證實GFRAL-GDF15bFACSHEK293轉(zhuǎn)染hGFRAL（ECD），biotin-GDF15bindingAb：anti-Fab-PE，strepavidine-APCc：SPR：純化的hGFRAL（ECD）蛋白，與GDF15，及其突變體GDF15V87R實驗結(jié)果：b：GDF15與GFRAL的結(jié)合是dose-responsec：GDF15與GFRAL的結(jié)合是dose-responseV87R不與GFRAL dFACSHEK293轉(zhuǎn)染hGFRAL（ECD），biotin-GDF15bindingAb：GDF15單抗（mAb26）anti-Fab-PEstrepavidine-APC 實驗結(jié)果：d：GDF15單抗能夠blockbiotin-GDF15與GFRALe：GDF15只與GFRAL結(jié)合，與GDNFligands及BMP9，TGFβSPRSPRBinding-cross實驗設(shè)計：f：SPR：純化的mGFRAL（ECD）蛋白，與humanGDF15g：Compensation：GDF15單抗（mAb實驗結(jié)果：f：humanGDF15可以與mouseGFRAL結(jié)合，所以humanGDF15可以用于g：Compensation實驗進一步證實了cross-speciesFig.1NN6K平臺screening，發(fā)現(xiàn)了GDF15受體GFRALFACS，SPRbinding實驗進一步證實了GDF15與GFRAL通過GDF15單抗（mAb26）block的compensation實驗證實了GDF15GFRAL最后又證實了hGDF15與mGFRAL的cross-speciesFACSFACSSPR進一步證實-RET-GFRAL-GDF15aFACSHEK293轉(zhuǎn)染RET（ECD），GFRAL,，biotin-GDF15bindingAb：strepavidine-APCb：SPR：純化的hGFRAL（ECD）蛋白，與GDF15，RET-b：GFRAL可以幫助GDF15結(jié)合RETSPRSPR進一步證實RETcross實驗設(shè)計：cGDF15-GFRAL-RETcomplexd：SPR：純化的RET（ECD）蛋白，與GDF15，GFRAL（ECD）-實驗結(jié)果：c：GDF15與GFRAL結(jié)合，再與RETd：hGDF15-hGFRAL不但能結(jié)合hRET，也能結(jié)合mRETFACSbinding驗證GFRAL與GDF15-RETeFACSHEK293轉(zhuǎn)染GFRAL（C1，C2，C3，C1-C2，C2-C3，fullRET/GDF15實驗結(jié)果：e：GFRAL(C1-C2)跟GDF15Fig.2FACS，SPRbinding實驗進一步證實了RET是GDF15與GFRAL解釋了GDF15-GFRAL-RETcomplex最后驗證了GFRAL與GDF15-RET的結(jié) 實驗設(shè)計：HEK293，共轉(zhuǎn)染hGFRAL和hRET10nMGDF15刺激15min實驗結(jié)果：和的ERK-phso-AlphaLisaERK-phso-AlphaLisa實驗設(shè)計：HEK293，共轉(zhuǎn)染hGFRAL和hRET，單獨轉(zhuǎn)染hGFRAL或hRET，GDF15dosecurve0.01nM~100nM，15min實驗結(jié)果：同時表達GFRAL和RET的HEK293cell，經(jīng)GDF15刺激后，ERKdosedependent；單轉(zhuǎn)染hGFRAL和hRET組，無ERKERK-phso-AlphaLisaERK-phso-AlphaLisa實驗設(shè)計：HEK293，共轉(zhuǎn)染hGFRAL和hRET51/9/43（3isoforms)，GDF15dosecurve0.01nM~100nM，15min實驗結(jié)果：與HEK293-GFRAL-RET9/43相比，HEK293-GFRAL-能激活更強的ERKERK-phso-AlphaLisaERK-phso-AlphaLisa實驗設(shè)計：HEK293，共轉(zhuǎn)染hGFRAL和hRETGDF15/GDF15V87Rdosecurve0.01nM~100nM，15min實驗結(jié)果：同時表達GFRAL和RET的HEK293cell，經(jīng)GDF15刺激后，ERKdosedependent；GDF15V87R刺激，無ERKRatRatFood實驗結(jié)果：GDF15突變體V87R喪失了GDF15Fig.3同時表達GFRAL和RET的HEK293cell，經(jīng)GDF15刺激后，ERK磷酸化呈doseRET的3個isoforms中，RET51能激活的ERKISH 實驗結(jié)果：GFRAL（red）和（blue）mRNA同時出現(xiàn)在Rat/mouse/monkeyCNS的AP和GFRALGFRAL實驗設(shè)計：c:NanoStringgeneexpressiond:Immunohistochemistry(IHC)

實驗結(jié)果：c：GFRALmRNA只在AP和NTSd：GFRAL在mousehindbrain GFRALICH&實驗設(shè)計：e:Immunohistochemistry(IHC)f:實驗結(jié)果：e：GFRALIHf：GFRAL蛋白和mRNAFig.4原位雜交（ISH），免疫組化（IHC），Nanostring分析證明：GFRALmRNA和蛋白均同時出現(xiàn)在Rat/mouse/monkeyCNS的AP和NTS；在S表達，但不進一步證明：GDF15對食欲的調(diào)節(jié)是作用是發(fā)生在hindbrainISHISH檢測GFRAL-KOmouseGFRAL在hindbrain實驗結(jié)果：GFRAL-KOmouse的hindbrain沒有檢測到GFRALGFRAL-KOmouse的GFRALGFRAL-KO與wtmousefoodintake,bodyweight,fatmass比較實驗設(shè)計：WTmice,heterozygousmice(HET),GFRAL-KOmiceb：高脂飲食（HFD）16c-e：高脂飲食 ，hGDF15每天給藥，28天fleanmicehGDF15每天給藥，28實驗結(jié)果：b：跟WT小鼠比較，GFRAL-KOmicec-f：對照組（沒有hGDF15給藥），WT，HET，GFRAL-KO3種小鼠的wtmousefoodintake,bodyweight,fatmass無明顯差異；c-f：hGDF15給藥組，GFRAL缺失小鼠失去了GDF15降體重，降fatmassGFRAL-KO與WT小鼠經(jīng)GDF15/Vehicle刺激后，血漿insulin，GDF15實驗設(shè)計：WTmice,heterozygousmice(HET),GFRAL-KOmiceg-i：高脂飲食（HFD）16，hGDF15每天給藥。j：leanmice，Leptin刺激后。實驗結(jié)果：g-h：GDF15刺激后，WT和HET小鼠的血漿Leptin和Insulin水平明顯降低；j：WT和GFRAL-KO小鼠經(jīng)Leptin急性刺激后，foodintakeFig.5GFRAL缺失小鼠失去了GDF15誘導(dǎo)的降食物攝取，降體重，降fatmassWT和HET小鼠經(jīng)GDF15刺激后，血漿Leptin和Insulin水平明顯降低；而GFRAL-GDF15的控制肥胖作用是通過調(diào)節(jié)LeptinGDF15GDF15實驗設(shè)計：a：Leanrat，ICVinjection，GDF155ul/ratb：Leanrat（SDA/sham），實驗結(jié)果：a：腦側(cè)室注射GDF15，F(xiàn)oodintake迅速顯著降低，且具有doseresponse。b：行膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)（SDA）的大鼠，GDF15降低foodintake的GDF15對機體的作用：FIGDF15對機體的作用：FI，RER，physical實驗設(shè)計：d-f：Energy Obesitymice（20weeks）invivoindirect 實驗結(jié)果：c：小鼠經(jīng)GDF15刺激，foodintake下降約30%。：小鼠經(jīng)GDF15刺激，RERe-f：GDF15刺激，不影響機 GDF15GDF15實驗設(shè)計：ObesityratGDF15/Vehicleinjectiondailyg：D