非靶向蛋白組學(xué)定量技術(shù)

安必奇生物科技有限公司非K向蛋白組學(xué)定量技術(shù):SILAC,iTRAQTMT定量蛋白組學(xué)的研究意義人類基因組完整圖譜于2003年正式公布，這標(biāo)志著生命科學(xué)的里程碑性事彳——人類基因組計(jì)劃的順利完成，生命科學(xué)研究也進(jìn)入了后基因組時(shí)代。這一計(jì)劃的初始目的是在基因?qū)用嫜芯咳祟惣膊C(jī)制，設(shè)計(jì)基因藥物，進(jìn)行精準(zhǔn)醫(yī)療。但是時(shí)隔十多年年過(guò)去了，效果遠(yuǎn)沒(méi)預(yù)期的理想。其中主要原因可能是，我們現(xiàn)有的研究工作和背景知識(shí)不足以將龐雜的基因組數(shù)據(jù)直接同人類疾病聯(lián)系起來(lái)。而蛋白組學(xué)能更直觀的將基因與疾病聯(lián)系起來(lái)，逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。定量蛋白組學(xué)是將某一基因組或者某一復(fù)雜體系表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和精準(zhǔn)定量的學(xué)科，是蛋白組學(xué)研究的重要分支。基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量20實(shí)際80年代中期出現(xiàn)了MALD（基質(zhì)輔助激光解吸附電離）和ESI（電噴霧電離）兩種軟電離方法，可以將蛋白質(zhì)或者多肽離子化，從而引入質(zhì)譜儀種進(jìn)行定性和定量分析，從此生物質(zhì)譜技術(shù)成為蛋白組學(xué)最重要的分析工具之一。圖1.生物質(zhì)譜儀器。利用生物質(zhì)譜技術(shù)，主要有兩種蛋白組學(xué)研究策略：Top-downstrategy:Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二維凝膠電泳分離蛋白，再將完整蛋白直接離子化后引入質(zhì)譜分析，借助生信分析工具和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的鑒定。Bottom-叩strategy:Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先將樣品用酶進(jìn)行處理，多維色譜分離后引入質(zhì)譜分析，再借助生信分析工具和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，最后實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的鑒定。蛋白定量分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量，由于電泳技術(shù)具有重復(fù)性差等缺點(diǎn)，而多維色譜能將樣品酶解物穩(wěn)定分離，因此蛋白的絕對(duì)定量多采用自下而上的方法。雖然絕對(duì)定量似乎更為理想，但是絕對(duì)定量更為復(fù)雜和昂貴，而相對(duì)定量在很多時(shí)候就能滿足科研需求，因此，相對(duì)定量更為常用。利于質(zhì)譜技術(shù)，可根據(jù)特定質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定蛋白質(zhì)含量，主要的方法又分為非靶向定量蛋白組學(xué)（標(biāo)記定量和非標(biāo)記定量）和靶向定量蛋白組學(xué)。標(biāo)記定量標(biāo)記定量主要分為體內(nèi)標(biāo)記（SILAC）和體外標(biāo)記（iTRAQ,TMT）。1SILACSILAC（StableIsotopeLabelingByAminoAcidsInCellCulture）的基本原理是通過(guò)培養(yǎng)，利用天然同位素（輕型）或者穩(wěn)定同位素（中型/重型）取代相應(yīng)氨基酸。經(jīng)過(guò)5-6次傳代后，穩(wěn)定同位素可以完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中。不同標(biāo)記的細(xì)胞或者蛋白等比例混合后，引入質(zhì)譜鑒定。如果峰值呈現(xiàn)為1：1，則表示此蛋白的含量無(wú)差異。如果含有重型氨基酸的峰值偏高，說(shuō)明重型氨基酸標(biāo)記的組中此蛋白含量更高。SILAC的優(yōu)點(diǎn)是蛋白標(biāo)記效率高，傳代6-8代后，可達(dá)到90%以上，靈敏性高?？蓹z測(cè)水平極低的蛋白含量變化和翻譯后修飾，且樣本需求量小，每個(gè)樣本僅需幾十微克，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)。2iTRAQ律TMT呈血ac'nnxsc<hraq(isobaricTaggingformu-iip-exedre-auveandabso-uieproieinquans-ad-.on)sTMT(iandemmassErg)湖皿殍目曲ar浦sMmaaMmK講NI。ffi-HH時(shí)F粵回(hraqs時(shí)F醐苛苛ABSdex、TMTS時(shí)「醐苛Therm。Fisher)、8W?阿瀏善K講曰曲渲EE畝卅湖sMm-fsbsmss、Adp廠EAdlpL苫8--nlgs一CLm-HbQn085皿rhMIysis'W=HMslKDcolnfH2SILAC河蜩mlHn?？赏瑫r(shí)處理多個(gè)樣本，鑒定和定量的結(jié)果同時(shí)得出且準(zhǔn)確，特別適用比較蛋白組分析,鑒定差異蛋白。表1.iTRAQ和TMT標(biāo)簽的差異。標(biāo)簽生產(chǎn)商標(biāo)簽規(guī)格iTRAQABSciex4標(biāo)，8標(biāo)TMTThermoFisher2標(biāo)，6標(biāo)，10標(biāo)iTRAQ原理:首先蛋白質(zhì)被裂解形成多肽，然后利用iTRAQ試劑進(jìn)行差異標(biāo)記。iTRAQ標(biāo)簽包含報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)基團(tuán)。不同標(biāo)簽的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)重量有差異，以4標(biāo)為例，報(bào)告基團(tuán)重量分別是：114，115，116，117Da，而平衡基團(tuán)重量分別為31，30，29，28Da。因此，標(biāo)簽的總重是一致的。同一肽段由不同標(biāo)簽標(biāo)記后具有相同的質(zhì)荷比。串聯(lián)質(zhì)譜中，碰撞誘導(dǎo)質(zhì)量平衡集團(tuán)丟失，因此同一多肽由于標(biāo)簽不同，產(chǎn)生不同的報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的信號(hào)強(qiáng)度從而推斷不同樣品間相同肽段的含量。M5/U5Frayinenlafcri圖3iTRAQ技術(shù)流程。非標(biāo)記定量非標(biāo)記(Labelfree)蛋白質(zhì)定量利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將蛋白質(zhì)酶解形成多肽后進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)計(jì)算蛋白肽段的鑒定數(shù)目和色譜峰面積進(jìn)行蛋白質(zhì)相對(duì)定量。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需昂貴的標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，且樣本制作過(guò)程簡(jiǎn)單，由于操作步驟少，可盡量減少人為和系統(tǒng)誤差。但是數(shù)據(jù)分析相對(duì)標(biāo)記定量而言難度更大更復(fù)雜，且重復(fù)性較差，對(duì)儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求高。通過(guò)在樣本中添加已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白還可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

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