如何閱讀質(zhì)粒圖譜

如何閱讀質(zhì)粒圖譜?、載體主有病毒和?病毒兩?類，其中質(zhì)粒DNA是?種新的?病毒轉(zhuǎn)基因載體。?、?個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素復(fù)制起始位點(diǎn)Ori，即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核?物DNA分?中只有?個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。?真核?物DNA分?有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)?？?素抗性基因：可以便于加以檢測(cè)，如Amp+，Kan+多克隆位點(diǎn)：MCS克隆攜帶外源基因?段P/E：?jiǎn)?dòng)?/增強(qiáng)?Terms：終?信號(hào)加poly（A）信號(hào)：可以起到穩(wěn)定mRNA作??、如何閱讀質(zhì)粒圖譜第?步：?先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）Ori的箭頭指復(fù)制?向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄?向（正向）。第?步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使?什么篩選標(biāo)記：（1）Ampr：?解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr：可以阻?四環(huán)素進(jìn)?細(xì)胞。（3）camr：?成氯霉素羥?酰基衍?物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍?物）失活。（5）hygr：使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單?切點(diǎn)，便于外源基因的插?。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插?，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，?便于篩選。決定能不能放?的基因以及如何放置?的基因。第四步：再看外源DNA插??段??。質(zhì)粒?般只能容納?于10Kb的外源DNA?段。?般來說，外源DNA?段越長，越難插?，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)?－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終?信號(hào)。這是?來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加??些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選?那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?的為準(zhǔn)繩。相關(guān)概念：?jiǎn)?dòng)?－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終?信號(hào)啟動(dòng)?－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱?編碼順序的上游，是DNA分?上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)?本?不被轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)?/沉默?－為真核λ基因組（包括真核病毒基因組）中的?種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作?與增強(qiáng)?所在的位置或?向?關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作?。沉默?－負(fù)增強(qiáng)?，負(fù)調(diào)控序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核??是AUG（起始密碼）和SD序列。λ轉(zhuǎn)錄終?順序（終??）/翻譯終?密碼?：結(jié)構(gòu)基因的最后?個(gè)外顯?中有?個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有?段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后?個(gè)外顯?中有?個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有?段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。三、載體及其分類

載體：即要把?個(gè)有?的基因（?的基因——研究或應(yīng)?基因）通過基因?程?段送到?物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載?具（交通?具）攜帶外源基因進(jìn)?受體細(xì)胞，這種運(yùn)載?具就叫做載體（vector）。P.S.基因?程所?的vector實(shí)際上是DNA分?，是?來攜帶?的基因?段進(jìn)?受體細(xì)胞的DNA。載體的分類按功能分成：（1）克隆載體：都有?個(gè)松弛的復(fù)制?，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是?來克隆和擴(kuò)增DNA?段（基因）的載體。（所以有時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)擴(kuò)增效率低下，要注意是不是使?的嚴(yán)謹(jǐn)型載體）（2）表達(dá)載體：具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。按進(jìn)?受體細(xì)胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttlevector）指在兩種宿主?物體內(nèi)復(fù)制的載體分?，因?可以運(yùn)載?的基因（穿梭往返兩種?物之間）。P.S.穿梭質(zhì)粒含原核和真核?物2個(gè)復(fù)制?，以確保兩類細(xì)胞中都能擴(kuò)增。基因?程載體的3個(gè)特點(diǎn)：（?）都能獨(dú)??主的復(fù)制：載體DNA分?中有?段不影響它們擴(kuò)增的?必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA?段，能被動(dòng)的跟著載體?起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分?樣。（?）都能便利的加以檢測(cè)：如載體的藥物抗性基因，多是抗?素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗?素培養(yǎng)板上培養(yǎng)?長時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分?的受體細(xì)胞才能存活。（三）都能容易進(jìn)?宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。四、載體的選擇和制備選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的?的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的?的是要表達(dá)?個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：1、構(gòu)建DNA重組體的?的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。2、載體的類型：（1）克隆載體的克隆能?－據(jù)克隆?段??（?選?，?選?）。如<10kb選質(zhì)粒。（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。（3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點(diǎn)：①選擇合適的啟動(dòng)?及相應(yīng)的受體菌；②?于表達(dá)真核蛋?質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；③表達(dá)天然蛋?質(zhì)或融合蛋?作為相應(yīng)載體的參考。3、載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成?向因載體不同?異，適應(yīng)?的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)?閱讀框架錯(cuò)位。選?質(zhì)粒（最常?）做載體的4點(diǎn)要求：①選分?量?的質(zhì)粒，即?載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌??拷貝數(shù)也多（也有?載體）；

②?般使?松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌?擴(kuò)增不受約束，?般10個(gè)以上的拷貝，?嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。③必需具備?個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗?素的抗性基因，不特指多位Ampr（試?試）。?論選?哪種載體，?先都要獲得載體分?，然后采?適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)?切割，獲得分?，以便于與?的基因?段進(jìn)?連接。?、pET32a(+)??載體表達(dá)的?段??TheexpectedfusionproteinexpressedencodedbyjustthepET-32a(+)vectoralonewouldbearound20.4kDa.TheTrx-tagbyitselfwouldcontribute12kDa.TherestisduetothetwoHis-tags(0.8kDaeach)andtheS-tag(1.7kDa).Theremaining5.1kDaisduetotheintervening（?）54aminoacidsbetweenthetagsanduntilthestopcodon.三、pET32系列載體的載體序列地址pET-32a(+)VectorSequencehttp://www.embl-hamburg.de/~geer...ET/pET-32a_seq.htmlpET-32b(+)VectorSequencehttp://www.embl-hamburg.de/~geer...ET/pET-32b_seq.htmlpET-32c(+)VectorSequencehttp://www.embl-hamburg.de/~geer...ET/pET-32c_seq.html四、pET系列載體閱讀?法ori是復(fù)制起始點(diǎn)，細(xì)的?箭頭是?個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄區(qū)，其箭頭?向不同，說明每個(gè)表達(dá)產(chǎn)物（如kan抗性基因、LacI等）都有獨(dú)?的promoter，有時(shí)與T7promoter?向相反。粗的?箭頭是MCS，?于?的基因的插?，箭頭?向表明?的基因的轉(zhuǎn)錄?向，它的轉(zhuǎn)錄?向可以與其它?個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄區(qū)相同，也可以不同，如Kan抗性基因、LacI的?向是?樣的，可能與調(diào)控相關(guān)，不同的載體是不?樣的。?個(gè)載體可只看它的啟動(dòng)?到終??那?段，其它的可以考慮少些。五、pET表達(dá)菌株的相關(guān)信息（DE3）指宿主為λDE3溶原菌，其染?體上帶有?拷貝由lacUV5啟動(dòng)?控制的T7RNA聚合酶基因。這類菌株適?于從克隆到pET載體的?標(biāo)基因?產(chǎn)蛋?。命名為pLysS和pLysE的宿主菌帶有編碼T7溶菌酶（為T7RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性質(zhì)粒。帶有pLysS的細(xì)胞產(chǎn)?少量溶菌酶，?pLysE宿主菌產(chǎn)?更?量酶。這些菌株?于在誘導(dǎo)前抑制T7RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞?長和活?的?標(biāo)蛋?的pET重組體。帶有pLacI的宿主菌產(chǎn)?額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的lac阻遏蛋?。λDE3溶原化試劑盒?于制備其它遺傳背景的新表達(dá)宿主菌。AD494菌株為硫氧還蛋?還原酶(trxB)突變菌株，能夠在胞漿內(nèi)形成?硫鍵，提供了?產(chǎn)正確折迭的活性蛋?的潛?。TrxB突變可?卡那霉素選擇，因此該菌株建議?于帶氨芐抗性標(biāo)記bla的質(zhì)粒。B834為BL21的親本菌株。這些蛋?酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型，可?35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對(duì)?標(biāo)蛋?進(jìn)??特異活性標(biāo)記，從??于結(jié)晶學(xué)研究。BL21應(yīng)?最?的宿主菌來源，具有l(wèi)on和ompT蛋?酶缺陷的優(yōu)點(diǎn)。BL21TrxB菌株在蛋?酶缺陷BL21背景上具有與AD494菌株相同的硫氧還蛋?還原酶突變(trxB)。由于trxB宿主有利于胞漿內(nèi)?硫鍵形成，它們的使?可增加正確折迭的蛋?組分。TrxB突變可?卡那霉素選擇，因此該菌株建議?于帶氨芐抗性標(biāo)記bla的質(zhì)粒。BLR為BL21的recA-衍?菌株，能夠改善質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列或其產(chǎn)物能夠引起DE3噬菌體丟失的?標(biāo)質(zhì)粒。HMS174菌株在K-12背景上提供了recA突變。與BLR?樣，這些菌株能夠穩(wěn)定其產(chǎn)物能夠引起DE3噬菌體丟失的某些?標(biāo)基因。NovaBlue適合?作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有?轉(zhuǎn)化效率、藍(lán)/?斑篩選能?（與合適質(zhì)粒）和導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒DNA?產(chǎn)的recAendA突變。由于存在F附加體編碼的lacIq阻遏蛋?，NovaBlue的DE3溶原菌是?個(gè)?常有?的嚴(yán)緊型宿主菌。Origami為K-12衍?的宿主菌，硫氧還蛋?還原酶突變(trxB)和?胱?肽還原酶(gor)基因均為突變，能夠??增強(qiáng)胞漿內(nèi)?硫鍵的形成。研究表明即使總體表?平相似，Origami（DE3）表達(dá)的活性蛋??其它宿主菌?10倍以上。Origami宿主菌與氨芐抗性質(zhì)粒相容，可?于pET-32載體，硫氧還蛋?標(biāo)簽?zāi)軌蜻M(jìn)?步增強(qiáng)在胞漿內(nèi)形成?硫鍵。TrxB和gor突變可分別?卡那霉素和四環(huán)素選擇，因此該菌株建議?于帶氨芐抗性標(biāo)記bla的pET質(zhì)粒。OrigamiB宿主菌來源于BL21lacZY突變株，還帶有與原始Origami菌株相同的TrxB/gor突變。OrigamiB菌株集BL21、Tuner和Origami宿主菌的優(yōu)點(diǎn)于?體。TrxB和gor突變可分別?卡那霉素和四環(huán)素選擇，因此該菌株建議?于帶氨芐抗性標(biāo)記bla的pET質(zhì)粒。Rosetta宿主菌從BL21衍??來，可增強(qiáng)帶有?腸桿菌稀有密碼?的真核蛋?的表達(dá)。該菌株通過?個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密碼?AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。這樣Rosetta菌株提供了“萬能”的翻譯，從?避免因?腸桿菌密碼?使?頻率導(dǎo)致的表達(dá)限制。tRNA基因由它們的天然啟動(dòng)?驅(qū)動(dòng)。在Rosetta（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）pLacI中，稀有tRNA基因存在于分別帶有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同?質(zhì)粒上。Tuner菌株為BL21的lacZY缺失突變株，能夠調(diào)整培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的蛋?表?平。l