實驗六網(wǎng)織紅血小板計數(shù)

實驗六網(wǎng)織紅血小板計數(shù)第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo要求熟悉網(wǎng)織紅細胞染色的原理及形態(tài)學特點，掌握計數(shù)方法，了解注意事項和臨床應用。學會鏡下辨認血小板的形態(tài)，掌握血小板計數(shù)的方法和參考值，了解注意事項及臨床應用。第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo紅系祖細胞原紅早幼紅中幼紅晚幼紅網(wǎng)織紅紅細胞一、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)骨髓外周血網(wǎng)織紅細胞（reticulocyte,Ret）是有核紅細胞轉向無核到完全成熟紅細胞的過度型細胞，其胞質中尚殘留部分嗜堿性物質(核糖體和核糖核酸)，能被煌焦油藍、燦爛甲酚藍、中性紅等活體染料染色。根據(jù)網(wǎng)織紅細胞的形態(tài)特征和成熟程度將其分為四型：

I型(絲球型)，沉淀顆粒呈致密結塊的網(wǎng)織紅細胞；Ⅱ型(網(wǎng)型)，沉淀顆粒呈疏松結構；Ⅲ型(破網(wǎng)型)，沉淀顆粒呈散在結構；在外周血中僅占0.15%Ⅳ型(點粒型)，沉淀顆粒呈少數(shù)散在分布。多見于外周血，60%以上第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo(一)染色原理

網(wǎng)織紅細胞內RNA的磷酸基（帶負電荷）能與溴甲酚藍、新亞甲藍等堿性染料的有色反應基（帶正點荷）結合，形成核酸與堿性染料復合物的藍黑色多聚顆粒，其顆粒又聯(lián)綴成線狀甚至網(wǎng)狀。凡含有兩個以上深染顆粒（或具有線網(wǎng)狀結構）的無核紅細胞，即為網(wǎng)織紅細胞。第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo(二)試劑煌焦油藍染液（1%）煌焦油藍1g枸櫞酸鈉0.4g氯化鈉0.85g蒸餾水加到100ml，充分溶解過濾備用。第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（三）操作

顯微鏡計數(shù)法

2d染料+2d全血（1：1）混勻后染15min，傾少許玻片上，制備薄膜片，晃動玻片使迅速干燥，低倍鏡瀏覽全片，選細胞分布均勻無重疊染色良好部位，油鏡下觀察1000個紅細胞中網(wǎng)織紅細胞數(shù)目。參考范圍成人：0.008~0.02新生兒：0.02~0.06其它方法：網(wǎng)織紅細胞計數(shù)儀熒光激活細胞術流式細胞術第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（四）注意事項1、紅細胞必須含兩個或兩個以上藍色顆粒，且無需微調顯微鏡即可見。顆粒必須遠離細胞邊緣，以免與變性珠蛋白小體混淆。2、染色時間必須充分，當室溫較低時，需適當延長染色時間或置37℃水浴箱內。3、制片應厚薄適宜，否則會造成網(wǎng)織紅細胞分布不均。4、網(wǎng)織紅細胞體積較大，常在血膜尾部和兩側較多，計數(shù)應該兼顧。5、復染會使網(wǎng)織紅數(shù)值降低，因此不采用瑞氏染料復染，用二甲苯擦涂片也會使結果降低。6、染料配制必須祛除沉渣。第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo方法學評價顯微鏡法可直接觀察細胞形態(tài)，不需特殊儀器，其中試管法操作簡便，重復性較好，被列為手工網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的參考方法但工作效率不高，實驗精密度低。受主觀因素影響較多，且耗時費力。儀器法測定快速，重復性好，避免主觀因素，易于標準化，測量細胞多，精確性高。根據(jù)熒光強度可反映網(wǎng)織紅細胞幼稚程度，并計算出網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)但幼稚白細胞、晚幼紅細胞及巨大血小板等可干擾計數(shù)結果，儀器價格貴，試劑成本較高。第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo臨床應用網(wǎng)織紅細胞計數(shù)是反映骨髓紅細胞造血功能的重要指標網(wǎng)織紅細胞計數(shù)增多①溶血性貧血②放療化療后，造血恢復③貧血治療有效時④脾功能亢進⑤紅細胞生成素治療后⑥骨髓移植功能良好的指標網(wǎng)織紅細胞計數(shù)降低①再生障礙性貧血②慢性病性貧血，如惡性腫瘤、慢性腎衰、內分泌疾病等第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo二、血小板計數(shù)（一）原理將血液用適當?shù)南♂屢合♂尯?，充入計?shù)池中，計數(shù)一定體積內血小板的數(shù)目，再換算成每升血液中的血小板數(shù)。（二）試劑與器材分為破壞紅細胞稀釋液：如草酸銨溶液不破壞紅細胞稀釋液：如紅細胞稀釋液血細胞計數(shù)板第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（三）操作步驟1、2ml紅細胞稀釋液2、采集10ul末梢血，充分混勻3、混勻的血小板懸液充池，靜置10min，高倍鏡下計數(shù)中央大方格的血小板數(shù)。4、計算：N*10*200*106/L參考范圍

（100-300）*109/L第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（四）注意事項1、針刺應稍深，保證采血順暢，忌擠壓，操作要迅速，無需擦掉第一滴血，若同時做其他實驗時，先做血小板計數(shù)。2、所用器材和稀釋液必須清潔，無菌無塵。器材應標準化3、血小板易聚集，充池前應充分混勻但不能用力太大，會破壞血小板4、待血小板下沉后再計數(shù)，否則結果偏低5、應在1h內計數(shù)完畢，否則結果偏低6、注意血小板與雜質、結晶等區(qū)別。7.檢查前，應避免服用影響到血小板功能的藥物第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（五）方法學評價目視顯微鏡法不需特殊儀器，操作簡便，成本低，但影響因素較多，耗時費力。血細胞分析儀法重復性好，測定速度快，適用于臨床應用。目前血細胞分析儀逐步普及，一般均以全血作為標本。但由于血細胞分析儀不能完全將血小板與其他類似大小的物質(如紅細胞或白細胞碎片、灰塵等雜物)區(qū)別開來，因此計數(shù)結果有時仍需顯微鏡目視計數(shù)法來作校正。第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo（六）臨床意義1．生理性正常人血小板數(shù)1d內可有6%～10%的變化，表現(xiàn)為早晨較低，午后較高；春季較低，冬季略高；平原較低，高原較高；月經(jīng)前較低，月經(jīng)后較高；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；運動后升高，休息后恢復；靜脈血比毛細血管血高10%。第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo

2．病理性

（1）

血小板減少：血小板數(shù)量低于100×109/L，原因：①血小板生成障礙：如再障、巨幼貧、急白、骨髓纖維化、放射線損傷；②血小板破壞增加：如ITP、脾亢；③血小板消耗增多：如DIC、TTP、SLE、輸血后血小板減少癥④血小板分布異常：如脾腫大（肝硬化）、血液被稀釋（輸入大量庫存血或血漿）

第十八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo

（2）血小板增多：數(shù)量超過400×109/L。原因：①骨髓增生性疾病