毛細管電泳的基本原理及應(yīng)用

毛細管電泳的基本原理及應(yīng)用摘要：毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該技術(shù)可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等?？捎糜诜治龆喾N體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，比HPLC分析高效、快速、微量。關(guān)鍵詞：毛細管電泳原理分離模式應(yīng)用1概述毛細管電泳(CaillaryElectrophoresis)簡稱CE，是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流場為驅(qū)動力的新型液相分離分析技術(shù)。CE的歷史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直徑為3mm的毛細管中做自由溶液的區(qū)帶電泳(CapillaryZoneElectro-phoresis，CZE)。但他沒有完全克服傳統(tǒng)電泳的弊端[1]?，F(xiàn)在所說的毛細管電泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細管柱，用熒光檢測器對多種組分實現(xiàn)了分離。1984年Terabe將膠束引入毛細管電泳，開創(chuàng)了毛細管電泳的重要分支:膠束電動毛細管色譜(MEKC)。1987年Hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉(zhuǎn)移到毛細管內(nèi)進行。同年，Cohen發(fā)表了毛細管凝膠電泳的工作。近年來，將液相色譜的固定相引入毛細管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴大了電泳的應(yīng)用范圍。毛細管電泳和高效液相色譜（HPLC）一樣，同是液相分離技術(shù)，因此在很大程度上HPCE與HPLC可以互為補充，但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢毛細管電泳（CE）除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點外，其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜（HPLC）簡單。CE只需高壓直流電源、進樣裝置、毛細管和檢測器。毛細管電泳具有分析速度快、分離效率高、試驗成本低、消耗少、操作簡便等特點，因此廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料學(xué)以及與化學(xué)有關(guān)的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個領(lǐng)域[2]。2毛細管電泳的設(shè)備和基本原理毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法[3]。毛細管電泳儀的基本組成如圖1、1所示。熔融石英毛細管的兩端分別浸在含有電解緩沖液的貯液瓶中，毛細管內(nèi)也充滿同樣的電解緩沖液。在毛細管接收端之前安裝在線檢測系統(tǒng)。被分析樣品可以從進樣系統(tǒng)采用重力法、電遷移法、抽真空法等多種進樣方式引入到毛細管的進樣端。當(dāng)樣品被引入后,便開始在毛細管兩端施加電壓。樣品溶液中溶質(zhì)的帶電組分在電場的作用下根據(jù)各自的荷質(zhì)比向檢測系統(tǒng)方向定向遷移。CE中的毛細管目前大多是石英材料。當(dāng)石英毛細管中充入pH值大于3的電解質(zhì)溶液時,管壁的硅羥基(-SiOH)便部分解離成硅羥基負離子(-SiO-),使管壁帶負電荷。在靜電引力下,-SiO-會把電解質(zhì)溶液中的陽離子吸引到管壁附近，并在一定距離內(nèi)形成陽離子相對過剩的擴散雙電層(見圖2[4])。可直接監(jiān)測。蛋白被酶解或化學(xué)裂解成肽片斷，利用CZE的高分辨率分離后所得的電泳圖稱CE肽圖。肽圖是進行蛋白序列分析的第一步，隨后可用CE進行微量制備，再測定各片斷的氨基酸序列，即可得出整個蛋白的一級結(jié)構(gòu)。CE的制備總量比高效液相色譜低，只適用于微量制備。對擴散系數(shù)小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用來作為收集非常純的單一餾份的微量制備的手段。在有些情況下，CE定量線性范圍可達(3個數(shù)量級)。4.4CE用于糖類的分析近年來，毛細管電泳已成為分析單糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖類化合物的有力武器，在糖型分析。方面也取得了較大的成功單糖的pKa6值一般大于11，故需選用強堿性的緩沖液（pH>11），使糖基上的羥基去質(zhì)子而帶負電荷，直接進行電泳分離，用紫外（195nm）檢測。也可以選用硼酸鹽緩沖液，硼酸鹽與糖基絡(luò)合形成帶負電荷的絡(luò)合物以進行電泳分離，用紫外檢測。簡單單糖的分析方法也適于簡單寡糖的分析[12]。多糖一般利用酸解或酶解的方法將其轉(zhuǎn)化為寡糖后進行分析。糖蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的圖譜被認為是糖蛋白的指紋圖譜。糖肽的分離主要是基于其pKa值的不同而進行CE分離，并不是基于糖鏈結(jié)構(gòu)的不同，因此所選用的緩沖液的組成及其pH的選擇尤為重要，其檢測也是基于蛋白質(zhì)的檢測。糖脂既可以直接用CE分離，也可以用神經(jīng)酰胺聚糖酶將糖鏈釋放出來后進行分析。糖胺聚糖（GAG）類糖基的聚糖部分有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和肝素等，一般都含有重復(fù)的二糖單元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，這些寡糖既帶電荷又有紫外吸收（232nm），因此很適合用CE進行分析。另外，CE在糖型分析方面也取得了較大的成功。在糖的檢測方面，紫外分析是最早用于CE進行糖類檢測的，但它的靈敏度相對不高，檢出限一般只有10—6mol數(shù)量級。利用激光誘導(dǎo)熒光檢測對糖類進行柱前高效熒光標(biāo)記，可使檢出限達到10-9mol水平。在改進檢測系統(tǒng)的同時，中性糖類的極性標(biāo)記也在不斷改進與完善。其中一種極性標(biāo)記物為8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地對均一寡糖和復(fù)雜多糖進行分離分析，具有很高的分辨率。4.5CE在臨床化學(xué)上的應(yīng)用CE在臨床化學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛,所檢測樣品的來源可分為尿樣、血漿血清、腦脊液、紅細胞、其它體液或組織以及實驗動物活體(invivo)試驗。被分析的組分則包括肽類、各種蛋白、病毒、酶、糖類、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、離子、藥物及其代謝產(chǎn)物。具體應(yīng)用可分為:臨床疾病診斷臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物分析、DNA片斷及序列分析等。所應(yīng)用的CE模式包括CZE、MECC、CGE、CITP和毛細管等電聚焦(CIEF)[13.14]。4.6CE用于檢測非均一性(多樣性,Heterogeneity)許多純化蛋白,甚至在它們的天然狀態(tài),往往都不是單一分子片斷,而是由相關(guān)分子組成,稱為非均一性(多樣性)。產(chǎn)生多樣性的原因有:氨基酸(AA)的序列不同,如突變體的某位置AA改變或AA側(cè)鏈改變;后轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生不同長度的多肽鏈;糖蛋白不同程度的糖基化,如存在不同數(shù)量的寡糖鏈,寡糖鏈有不同的單糖組成、序列及單糖之間的異構(gòu)連接。采用CZE,MECC,CIEF,CE-MS可檢測這些非均一性。用于心臟病的重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtPA)含4個可能糖基。Yim[15]用CZE和CIEF研究了制備過程中rtPA不同糖基化程度引起的非均一性,結(jié)果表明,CIEF方法要比CZE的好。還有用CZE對人促紅細胞生成素(rHuEPO)[16]、用MECC對重組人C2干擾素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研究蛋白的多樣性。有關(guān)蛋白的非均一性在臨床中的一些應(yīng)用,如人鐵傳遞蛋白、血清蛋白的變異、異構(gòu)酶的分析等。4.7CE用于農(nóng)藥殘留量的分析對農(nóng)藥殘留物的測定國外研究的較多。Lazer等[19]將飛行時間質(zhì)譜和毛細管電泳儀聯(lián)用，采用樣品堆積技術(shù)進樣對Paraquat和Diquat兩種除草劑進行了分離，檢測限低至10-17mol/L。Farran等[20]采用φ(乙腈)=50%的磷酸-硼砂緩沖液分離出兩種苯氧羧酸類除草劑。Hinsmann等[21]通過自動在線濃縮樣品，采用固相微柱以十二烷基硫酸鈉(SDS)作膠束,添加少量乙腈,在13min內(nèi)分離測定了水中的7種不同種類的農(nóng)藥?；酋ｋ孱惢衔锸且活愊鄬^新的除草劑，因此這一類化合物在水和食品中的殘留量的測定十分重要。LipezAvila等[22]采用3μmODS硅膠填充柱來分離這一類化合物,線性范圍為1～100mg/L。Mayer等報道了農(nóng)藥Cinosulfuron及其副產(chǎn)物的毛細管電色譜的分離分析。游靜等[23]對毛細管電泳在農(nóng)藥手性拆分的進展做了綜述。4.8CE用于純度檢測CE在國外分子生物學(xué)實驗室及生物工程藥廠里已廣泛用作最有效的純度檢測手段。當(dāng)?shù)鞍椎氖杷韵嘟鼤r,它們在HPLC柱中往往同時流出,因此在對蛋白進行結(jié)構(gòu)研究(包括N端序列和肽譜)之前,必須監(jiān)測從HPLC所得肽片斷的純度?？焖貱E純度檢測可節(jié)約樣品和節(jié)省序列測定所需時間。因CE和RP2HPLC分離機理不同,所以當(dāng)用CE檢查由RP2HPLC純化制得的某一合成肽(一個峰,純度為99.12%)時,發(fā)現(xiàn)分出6個組分,主峰純度僅為50%?；蛟S這就是部分基因工程產(chǎn)品用HPLC檢測純度很高而實際生物活性卻各批差異很大的一個原因。至于用CE對藥廠生產(chǎn)及QC作純度檢測的應(yīng)用實例比比皆是,如對胰島素、白細胞介素、人生長激素、粒性巨噬細胞菌落刺激因子(用CIEF)等的檢測。純度檢測時用CE可檢測出多肽鏈上單個氨基酸的差異。CE用于純度檢測可用CZE,MECC,SDS2CGE,CIEF多種模式。還有文獻討論了用不同方法(包括RP2HPLC,IEC2HPLC,SDS2PAGE及CE)進行純度檢測的最有效的策略[24]。5結(jié)論作為一種蛋白質(zhì)、多肽、核酸及其他生物分子