地中海貧血的研究進(jìn)展

地中海貧血診斷和治療的進(jìn)展中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科李文益整理ppt第一頁(yè)，共五十八頁(yè)。

發(fā)病率(含雜合子)：

●全世界約1.5億人攜帶血紅蛋白病基因

全國(guó)：異常血紅蛋白0.33%α-地貧2.64%β-地貧0.66%

廣東：α-地貧7.3%(9.64%)β-地貧1.83～3.36%(3.54%)

廣西：α-地貧14.9%●繼發(fā)性α-地貧

整理ppt第二頁(yè)，共五十八頁(yè)。

遺傳學(xué)

·

α珠蛋白基因簇位于16號(hào)染色體上

·

β珠蛋白基因簇位于11號(hào)染色體上整理ppt第三頁(yè)，共五十八頁(yè)。

IVSI

IVSⅡ

16號(hào)染色體5’

3’

13132991001415’3’

ζФζФα1α2α1

Kb0102030

整理ppt第四頁(yè)，共五十八頁(yè)。

IVSⅠ

IVSⅡ

11號(hào)染色體5’3’

13031104105146

5’

3’ψβ2εGγAγψβ1δβkb0102030405060

整理ppt第五頁(yè)，共五十八頁(yè)。缺失型α-地貧◆全世界缺失型已達(dá)31種◆其中－α4.2(左側(cè)缺失)和－α3.7(右側(cè)缺失)缺失型是遍布全世界的類型，其余突變那么隨地理和人群分布的不同而異。◆在我國(guó)，除上述二種缺失外，尚有－SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失30～34kb)和－α2.7等。整理ppt第六頁(yè)，共五十八頁(yè)。

非缺失型α-地貧◆目前已報(bào)道42種◆包括啟動(dòng)子突變、剪接點(diǎn)突變、移碼突變、無(wú)義突變、終止密碼子突變、核苷酸信號(hào)位點(diǎn)改變等◆中國(guó)人非缺失型：HbCS終止密碼子突變?chǔ)?TAA→CAAHbQOα2CD125(Lcu→Pro)◆其他：HbDuan，Hbwestmead,HbHekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59

整理ppt第七頁(yè)，共五十八頁(yè)。獲得性α-地中海貧血●繼發(fā)于惡性血液病/MDS●機(jī)制：◆acquireddeletionofthe-globingeneclusterlimitedtotheneoplasticclone◆morecommonly,inactivatingsomaticmutationsofthetrans-actingchromatin-associatedfactorATRX,whichcausedramaticdown-regulationof-globingeneexpression.整理ppt第八頁(yè)，共五十八頁(yè)。

β-地貧◆以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎贁?shù)為缺失所致◆全世界報(bào)告突變類型>170，中國(guó)28種◆中國(guó)常見(jiàn)類型：(9省區(qū)檢測(cè)資料)CD41-42(41.6%)、IVS-Ⅱ-654(21.8%)CD17(18.0%)、TATA-nt-28(8.0%)CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%)CD26(HbE)整理ppt第九頁(yè)，共五十八頁(yè)。診斷※臨床表現(xiàn)★β地貧：◆輕型常無(wú)臨床病癥或輕微貧血?！糁匦突颊咴趮雰浩诔霈F(xiàn)慢性進(jìn)行性貧血、輕度黃疸〔間歇性〕、肝脾腫大；常有發(fā)育不良和骨骼改變，出現(xiàn)地中海貧血面容?！糁虚g型多在幼兒期出現(xiàn)貧血，其病癥比重型輕。整理ppt第十頁(yè)，共五十八頁(yè)?！铴恋刎殻骸綮o止型無(wú)臨床病癥，◆輕型常無(wú)臨床病癥或輕微貧血?！糁虚g型〔HbH〕多在幼兒期或以后出現(xiàn)貧血、黃疸、肝脾腫大；感染常使貧血加重甚至出現(xiàn)溶血危象?！糁匦投喑霈F(xiàn)死胎或胎兒水腫綜合征。整理ppt第十一頁(yè)，共五十八頁(yè)?！鶎?shí)驗(yàn)室檢查★血象：貧血為小細(xì)胞低色素性，MCV＜80fl，MCH＜28pg，MCHC＜32%。網(wǎng)織紅細(xì)胞正?；蛟龈摺Ｍ庵苎?xì)胞涂片染色示紅細(xì)胞大小不等，中央淺染色區(qū)擴(kuò)大，出現(xiàn)異型、靶形、碎片紅細(xì)胞和有核紅細(xì)胞、點(diǎn)彩紅細(xì)胞、嗜多染性紅細(xì)胞、豪-周小體等。整理ppt第十二頁(yè)，共五十八頁(yè)?！锏刎毢Y查：◆地貧5項(xiàng)：①溶血度〔脆性〕，正常值：＞60%；②HbF；③Hb電泳：HbA2,HbH；④紅細(xì)胞形態(tài)〔參見(jiàn)上〕；⑤ZPP，以排除缺鐵性貧血◆地貧6項(xiàng)：：①溶血度〔脆性〕；②Hb電泳；③HbF；④HbA2；⑤MHb；⑥G6PD活性。整理ppt第十三頁(yè)，共五十八頁(yè)。

※α-地貧的基因診斷★缺失型：◆

Southern印跡雜交—限制性酶譜分析法：

主要用于較大片段缺失◆PCR法：

▲跨越斷裂點(diǎn)的PCR擴(kuò)增法(gap-PCR)：

可診斷、區(qū)分α地貧1純合子和雜合子▲由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR擴(kuò)增能夠明確缺失突變形成的各種α地貧基因型或臨床類型。整理ppt第十四頁(yè)，共五十八頁(yè)。★非缺失型◆Southern印跡雜交診斷法◆PCR-酶解法：◆擴(kuò)建酶切點(diǎn)法：◆PCR-ASO◆其他方法：聚合酶鏈反響結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析〔PCR-SSCP〕和變性梯度凝膠電泳〔DGGE〕也曾用于α地貧點(diǎn)突變的基因分析，一般多用于點(diǎn)突變的研究而不是基因診斷和產(chǎn)前診斷。整理ppt第十五頁(yè)，共五十八頁(yè)。※β-地中海貧血的基因診斷◆PCR結(jié)合ASO探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)◆擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng)法〔ARMS法〕◆DNA芯片技術(shù)〔DNAchip〕◆反向點(diǎn)雜交〔Reversedotblot,RDB〕整理ppt第十六頁(yè)，共五十八頁(yè)。β-地貧的鑒別診斷

與小細(xì)胞低色素性貧血的鑒別●缺鐵性貧血●感染或炎癥性貧血●肺含鐵血黃素沉著癥●鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血●鉛中毒●銅缺乏●先天性轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥整理ppt第十七頁(yè)，共五十八頁(yè)?！辫F性貧血

●多于6月~2歲發(fā)病，無(wú)家族史●不當(dāng)喂養(yǎng)史●無(wú)溶血證據(jù)，網(wǎng)織紅N/↓●SI、TS、SF↓TIBC、FEP↑●骨髓內(nèi)、外鐵減少整理ppt第十八頁(yè)，共五十八頁(yè)?！愿腥拘载氀?/p>

●有感染、炎癥史及相應(yīng)臨床表現(xiàn)

●貧血有時(shí)僅為小細(xì)胞性

●無(wú)溶血，網(wǎng)織紅N/↓

●SI、TIBC、TS↓，SF、FEP↑

●鐵粒幼細(xì)胞↓，外鐵↑

整理ppt第十九頁(yè)，共五十八頁(yè)?！F粒幼紅細(xì)胞性貧血

●頑固貧血，鐵劑治療無(wú)效，個(gè)別病例母系B6治療有效

●無(wú)溶血，網(wǎng)織紅N/↓

●BM、外鐵↑，鐵粒幼紅↑，可見(jiàn)環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞●SI、SF、FEP↑、TIBCN/↓整理ppt第二十頁(yè)，共五十八頁(yè)。※肺含鐵血黃素沉著癥●發(fā)作性蒼白，無(wú)力，咳嗽，痰中帶血●X線胸片肺野中可見(jiàn)網(wǎng)點(diǎn)狀陰影●痰和胃液中可找到含鐵血黃素細(xì)胞●小細(xì)胞低色素性貧血，網(wǎng)織紅↑●SI、TS↓、TIBC↑●SR↑整理ppt第二十一頁(yè)，共五十八頁(yè)?！U中毒

●紅細(xì)胞中可見(jiàn)嗜堿性點(diǎn)彩

●長(zhǎng)骨X線改變

●FEP↑↑※銅缺乏性貧血

●脂溢性皮炎，皮膚毛發(fā)色素少淺表靜脈擴(kuò)張，自發(fā)性骨折精神障礙

●貧血、WBC↓，血銅藍(lán)蛋白↓整理ppt第二十二頁(yè)，共五十八頁(yè)?！D(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥●自幼貧血，1歲時(shí)貧血嚴(yán)重●肝脾輕度大，鐵劑治療無(wú)效●網(wǎng)織紅↓，BM內(nèi)、外鐵↓●SI、TIBC、TS、SF↓※其他：Coombs陰性自溶整理ppt第二十三頁(yè)，共五十八頁(yè)。

*

地中海貧血的預(yù)防

?

人群普查

?

遺傳咨詢

?

產(chǎn)前診斷整理ppt第二十四頁(yè)，共五十八頁(yè)。

治療

★紅細(xì)胞輸注和去鐵治療●本療法仍是最根本治療方法●高、中量輸血配合鐵螯合劑●能活到成年并到達(dá)正常人的生活能力缺點(diǎn)：需終身治療，費(fèi)用昂貴易出現(xiàn)輸血副反響，尤其是輸血傳染病等整理ppt第二十五頁(yè)，共五十八頁(yè)。紅細(xì)胞輸注①低量輸血法：目前已不用此法

②中量輸血法(moderatetransfusion)維持輸血之前的Hb濃度＞90～105g/L

③高量輸血法(hypertransfusion):維持輸血前Hb＞100g/L

④超量輸血法(supertransfusion)：維持輸血前Hb＞120g/L整理ppt第二十六頁(yè)，共五十八頁(yè)。紅細(xì)胞輸注

●每次輸濃縮紅細(xì)胞10～20ml/kg,每2～4周1次●使輸注后Hb濃度達(dá)130～135g/L●無(wú)論何種方法，每次輸注之后Hb不能超過(guò)150g/L●濃縮紅細(xì)胞輸注速度應(yīng)＜4～5ml/〔kg·h〕●重度貧血者輸注的速度應(yīng)更慢＜2ml/kg·h〕整理ppt第二十七頁(yè)，共五十八頁(yè)。去鐵治療

鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)過(guò)早使用〔＜１歲〕可產(chǎn)生骨骼畸形、生長(zhǎng)抑制等副作用，在規(guī)那么輸血１年或輸紅細(xì)胞10～20單位之后進(jìn)行鐵負(fù)荷的評(píng)估整理ppt第二十八頁(yè)，共五十八頁(yè)。鐵負(fù)荷的評(píng)估方法：

①測(cè)定血清鐵蛋白(SF),簡(jiǎn)便可行，但影響因素較多；②肝穿刺后測(cè)定肝組織的鐵含量，此法較準(zhǔn)確,但屬損傷性檢查，一般醫(yī)院難于實(shí)行；③

影像學(xué)方法如MRI，此法雖簡(jiǎn)便但準(zhǔn)確度不夠且費(fèi)用高如有鐵超負(fù)荷，那么開(kāi)始使用鐵螯合劑(>3.2mg/g干肝組織或血清鐵蛋白＞整理ppt第二十九頁(yè)，共五十八頁(yè)。DFO劑量

●20～60mg/kg.d，每周應(yīng)用5～6天●長(zhǎng)期應(yīng)用以控制鐵蛋白在1000～2000μg/L之間為理想，采用連續(xù)皮下注射12小時(shí)，或持續(xù)靜脈滴注8～12小時(shí)等方法●缺點(diǎn)是使用較麻煩,病兒依從性差，如使用不當(dāng)(鐵負(fù)荷輕而用大劑量DFO〕,可致白內(nèi)障、聽(tīng)力喪失、長(zhǎng)骨生長(zhǎng)障礙等副作用整理ppt第三十頁(yè)，共五十八頁(yè)。口服鐵螯合劑※deferiprone(L1)●化學(xué)名羥基吡啶1，二齒狀分子結(jié)構(gòu)●以3:1與Fe3+結(jié)合，結(jié)合效率差些●吸收快，迅速轉(zhuǎn)化成活性形式，排泄快●1984年臨床實(shí)驗(yàn)，1995年上市(卬度)●常用量75mg/kg.d●短期療效較差，長(zhǎng)期療效仍有爭(zhēng)議●副作用：關(guān)節(jié)痛、(常見(jiàn))粒細(xì)胞減少(嚴(yán)重)、鋅缺乏、胃腸反響、肝功能異常整理ppt第三十一頁(yè)，共五十八頁(yè)?！鵌CL670●三齒狀分子結(jié)構(gòu)三氮唑化合物●以2:1與Fe3+結(jié)合●吸收快，在血循環(huán)中存活幾小時(shí)●效果為DFO的5倍，L1的10倍●劑量20mg/kg.d●副作用：胃腸反響，皮疹。肝腎功能無(wú)影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)I小管上皮細(xì)胞有改變(非鐵超負(fù)荷)整理ppt第三十二頁(yè)，共五十八頁(yè)。造血干細(xì)胞移植〔HSCT〕●是目前能夠根治重型β地貧的一種治療方法●HSCT分為骨髓移植(BMT)、臍血移植(UCBT)和外周血干細(xì)胞移植〔PBSCT〕●胎兒期予HSCT:宮內(nèi)造血干細(xì)胞移植(IUSCT)整理ppt第三十三頁(yè)，共五十八頁(yè)。BMT治療重型β地貧

●1982年首例成功●至今全世界應(yīng)用已達(dá)1000余例●長(zhǎng)期生存率達(dá)80％●供體來(lái)源困難，費(fèi)用昂貴血整理ppt第三十四頁(yè)，共五十八頁(yè)。UCBT治療重型β地貧

●1989年首例UCBT治療范可尼貧血成功●1995年泰國(guó)治療HbE／β地貧獲得成功●1998年1月中山二院在內(nèi)地開(kāi)展首例●不少醫(yī)院開(kāi)展，總數(shù)已超過(guò)100例●由血緣相關(guān)開(kāi)展至無(wú)血緣相關(guān)●HLA位點(diǎn)由全相合開(kāi)展至1～3個(gè)位點(diǎn)不合整理ppt第三十五頁(yè)，共五十八頁(yè)。異基因外周血干細(xì)胞移植(Allo-PBSCT〕

●1989年治療1例慢性白血病取得成功，血細(xì)胞別離機(jī)從外周血可采到足夠的造血干細(xì)胞供者無(wú)需麻醉，平安●PBSCT治療地貧國(guó)外從1996年開(kāi)始，香港1998報(bào)告３例，內(nèi)地1999年中山二院首例，各地陸續(xù)開(kāi)展整理ppt第三十六頁(yè)，共五十八頁(yè)。宮內(nèi)造血干細(xì)胞移植

●國(guó)外于1996年開(kāi)始報(bào)告，但至目前僅數(shù)例●國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)展整理ppt第三十七頁(yè)，共五十八頁(yè)?；蛑委?/p>

★根治性基因治療〔基因矯正治療〕●基因矯正治療是把正常的目的基因?qū)塍w內(nèi)，并到達(dá)適當(dāng)、有效、持久的表達(dá)，以完全取代原來(lái)的病態(tài)基因●β地貧是β珠蛋白基因的單基因缺陷遺傳病，理論上是基因治療最理想的模型●1984年開(kāi)始基因治療的研究，進(jìn)展緩慢，其原因之一是載體問(wèn)題，二是轉(zhuǎn)導(dǎo)的β珠蛋白基因片段的大小。整理ppt第三十八頁(yè)，共五十八頁(yè)?！铴轮榈鞍谆蜃濉穹浅｝嫶?，調(diào)控也非常復(fù)雜●β珠蛋白基因組●上游基因調(diào)節(jié)元件即位點(diǎn)調(diào)控區(qū)(locuscontrolregion,LCR)的DNase敏感〔hypersensitive,HS〕片段〔包括HS2、HS3、HS4〕對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達(dá)非常重要。整理ppt第三十九頁(yè)，共五十八頁(yè)?！锬孓D(zhuǎn)錄病毒載體●常用癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒〔onco-retroviralvector〕攜帶β珠蛋白基因及其調(diào)節(jié)元件●將人珠蛋白基因?qū)胄∈蠹t白血病(MEL)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可成功表達(dá)β珠蛋白●在小鼠動(dòng)物模型上將β基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染鼠造血干細(xì)胞,在受體紅細(xì)胞中獲得表達(dá)。將人β珠蛋白基因?qū)毽碌刂泻Ｘ氀∈篌w內(nèi),其病癥可獲得局部改善整理ppt第四十頁(yè)，共五十八頁(yè)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有如下缺點(diǎn)：①載體的容量有限〔僅7kb左右〕，無(wú)法完全包含β珠蛋白基因組及其上游LCR片段，因而表達(dá)效價(jià)低和不穩(wěn)定；②不能轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞；③病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞的基因組中可使插入點(diǎn)附近的基因表達(dá)失控，插入的基因也有可能不恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；④病毒可能感染宿主；⑤致癌作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)淋巴瘤發(fā)生。整理ppt第四十一頁(yè)，共五十八頁(yè)。慢病毒〔lentivirus〕載體●優(yōu)點(diǎn)是：①載體容量大，能包含大片段的β珠蛋白基因組及其上游調(diào)節(jié)元件，保證β珠蛋白基因的高效、穩(wěn)定表達(dá)；②可以轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞,并能永久表達(dá)?！癯Ｓ玫氖荋IV-1為根底的慢病毒載體。整理ppt第四十二頁(yè)，共五十八頁(yè)。2000年MayC等首次應(yīng)用攜帶有大片段的調(diào)節(jié)序列的人的β珠蛋白基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞，人的β珠蛋白基因有效、準(zhǔn)確的整合到宿主DNA中，并能高效表達(dá)，合成正常血紅蛋白可達(dá)17-24%，到達(dá)治療β地中海貧血小鼠的目的。文章發(fā)表在Nature整理ppt第四十三頁(yè)，共五十八頁(yè)。Pawlin等〔2001〕、Imrens等〔2002〕、Persons等〔2003〕、Levasceur等〔2003〕、Rivella等〔2003〕報(bào)告采用同樣載體，在中間型β地貧鼠〔Hbbth3/+〕模型中顯示每拷貝載體可使Hb增加1.1～2.3g/dl，血液參數(shù)明顯糾正,紅細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。整理ppt第四十四頁(yè)，共五十八頁(yè)?！褚陨嫌玫腍bbth3/+鼠為中間型鼠●為了更接近人重型β地貧，Rivella等建立了重型β地貧鼠模型。這種鼠如不治療將在6～8周內(nèi)死于嚴(yán)重貧血〔Hb2～3g/dl〕●用上述載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后那么轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g型地貧鼠。由此提示治療人重型β地貧時(shí)，采用這些載體轉(zhuǎn)導(dǎo)β或γ珠蛋白基因還需要更高的表達(dá)。整理ppt第四十五頁(yè)，共五十八頁(yè)。位點(diǎn)獨(dú)立性表達(dá)〔positionindependentexpression〕：在鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)特征，盡管包含了β或γ珠蛋白基因的調(diào)節(jié)元件，但β或γ珠蛋白的表達(dá)在不同的鼠之間差異很大雞HS4(cHS4)具染色質(zhì)隔離成分〔chromatininsulatorelement〕，在癌瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中已發(fā)現(xiàn)可減少位點(diǎn)作用差異〔positioneffectvariegation,PEV〕cHS4元件具有阻斷增強(qiáng)子活性作用，可能有較好的載體生物平安性，對(duì)克服載體的致癌作用很重要。整理ppt第四十六頁(yè)，共五十八頁(yè)。Puthenveetil等報(bào)告采用慢病毒載體，所包含的β珠蛋白基因族中參加cHS4染色質(zhì)隔離成分,修正后的人β地貧CD34＋細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中得到一致的紅系分化和糾正異常的β地貧特征，移植入免疫缺陷鼠后，3～4個(gè)月后仍是紅系正常分化。整理ppt第四十七頁(yè)，共五十八頁(yè)。基因調(diào)控治療

●是廣義的基因治療●機(jī)理是根據(jù)β地貧的病理生理根底是α鏈和非α鏈合成速率的不平衡，藥物來(lái)激活非α鏈珠蛋白基因的功能，增加非α鏈珠蛋白的合成速率；或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的成速率的合成速率；減輕α和非α珠蛋白的失衡程度減輕臨床病癥整理ppt第四十八頁(yè)，共五十八頁(yè)?；蛘{(diào)控治療主要有：

①

藥物基因調(diào)控治療；②

反義核酸性基因調(diào)控治療；③

造血生長(zhǎng)因子治療。④中藥治療整理ppt第四十九頁(yè)，共五十八頁(yè)。藥物基因調(diào)控治療1982年首先報(bào)告應(yīng)用５-氮胞核苷許多藥物，如羥基脲、丁酸鹽、阿糖胞苷、馬利蘭、雷米封等都有研究報(bào)告羥基脲〔HU〕的研究報(bào)告最多，效果也較好整