農(nóng)殘分析12-農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定

農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定技術(shù)第一頁，共十六頁。整理ppt6.1酶抑制分析測定法

1951年,Giang與Hall應(yīng)用有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥在體外對膽堿酯酶具有抑制作用的機(jī)理來測定其含量.1968年Mendoza利用薄層-酶抑制技術(shù)測定10種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥,最小檢出量可達(dá)納克水平.1975年Kramer與Gamson用一種與靛酚乙酸酯相似的化合物,測定1~10μg的各種有機(jī)磷酸酯化合物,與此同時,Zweig等也測定了甲萘威等農(nóng)藥.進(jìn)入20世紀(jì)80年代,人們開始以來源豐富,取材和制備都十分方便的植物酶源,建立薄層-植物酯酶抑制方法,為酶抑制法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)造了條件.第二頁，共十六頁。整理ppt6.1.2酶法檢測原理有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對參與神經(jīng)生理傳遞過程的乙酰膽堿酯酶AChE具有抑制作用,使該酶的分解作用不能正常進(jìn)行,從而導(dǎo)致底物乙酰膽堿的積累,影響動物正常的神經(jīng)傳導(dǎo),引起中毒或死亡.可將這一昆蟲毒理學(xué)原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測中,如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥,酶的活性就不被抑制,試樣中參加的基質(zhì)就被酶水解,或少局部水解,水解產(chǎn)物與參加的顯色劑反響產(chǎn)生顏色;反之,如果試樣提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥,酶的活性就被抑制,試樣中參加的基質(zhì)就不被酶水解,從而不顯色或顏色很淺,用分光光度計(jì)測定吸光度值,計(jì)算出抑制率,就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況.第三頁，共十六頁。整理ppt6.1.3酶源選擇與提取酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的根底,其性質(zhì)的好壞,特異性大小,穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測的結(jié)果.在酶抑制檢測的技術(shù)中,既有應(yīng)用AChE的,也有應(yīng)用非特異性酯酶的,其來源既有動物的,也有植物的.6.1.4底物和顯色劑酶抑制劑顯色反響可使用的底物和顯色劑很多,大致可分為以下幾類:第四頁，共十六頁。整理ppt(1)乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)顯色;(2)乙酸-β-萘酯-固藍(lán)B鹽顯色反響;(3)乙酸羥基吲哚顯色法;(4)乙酸靛酯顯色法;6.1.5檢測方法(1)比色法:我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑制產(chǎn)生的顯色反響,通過分光光度計(jì)比色測定酶的抑制率,以測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量.第五頁，共十六頁。整理ppt(2)酶片法:酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類的濾紙或類似載體物質(zhì).(3)固相酶速測技術(shù)6.2免疫檢測技術(shù)6.2.1免疫分析概述當(dāng)細(xì)菌、病毒和有害物等病原入侵時,能產(chǎn)生抵御外來物的抗體，這就是動物的免疫反響，致病的外來物稱為抗原。免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反響為根底的分析技術(shù)。第六頁，共十六頁。整理ppt6.2.2酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)原理是在測定過程，樣品提取液中的農(nóng)藥與能看出數(shù)量的酶聯(lián)劑競爭有限數(shù)量的抗體吸附位點(diǎn)。為了觀察測定結(jié)果，往往參加底物和顯色劑，以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)顏色的吸光度之差就可計(jì)算出樣品中農(nóng)藥的含量.農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法等幾個步驟.第七頁，共十六頁。整理ppt(1)直接ELISA原理:是在抗原與抗體發(fā)生反響后，直接進(jìn)行顯色的非均相固相反響免疫分析方法。1類:首先將抗原固定在聚苯乙烯反響板孔內(nèi)壁，然后參加待測抗原和酶標(biāo)記抗體，固相抗原與待測游離抗原競爭有限量的酶標(biāo)記抗體，反響后洗去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，參加酶作用底物，測定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。酶反響活性與待測抗原的量呈負(fù)相關(guān).第八頁，共十六頁。整理ppt2類:首先固定抗體，然后同時參加待測抗原和酶標(biāo)記抗原，待測抗原與酶標(biāo)記抗原競爭有限量的固相抗體，反響后測定固相抗體與酶標(biāo)記抗原結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。酶活性強(qiáng)度與待測抗原呈負(fù)相關(guān)。(2)間接ELISA原理首先固定抗原，然后參加待測抗原和抗體，固相抗原與待測抗原競爭有限的第一輪抗體，反響后洗去游離的結(jié)合物，再參加酶標(biāo)記的第二抗體(以第一抗體為抗原的酶標(biāo)記抗體)，反響后吸取酶標(biāo)記的游離抗體，測定結(jié)合物上的酶活性。酶活性與待測抗原濃度呈負(fù)相關(guān)。第九頁，共十六頁。整理ppt(3)半抗原的制備抗原是指一切能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反響的物質(zhì)。

抗原具有免疫原性和反響原性。免疫原性是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反響；而反響原性是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行反響的特性。既具有免疫原性反又具有反響原性的抗原稱為完全抗原,而只具有反響原性而沒有免疫原性的抗原稱為不完全抗原,也稱半抗原.第十頁，共十六頁。整理ppt(4)人工免疫抗原的合成首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合。如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合酸酐法，如具有羥基活性基團(tuán)那么采用琥珀酸酐法.(5)農(nóng)藥抗體制備農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的復(fù)合物免疫動物使機(jī)體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免疫動物血清，然后進(jìn)行別離、鑒定其特異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑.第十一頁，共十六頁。整理ppt1)多克隆抗體技術(shù)

多克隆抗體是由許多B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的混合抗體.2)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗

單克隆抗體是指由一個B淋巴細(xì)胞分化增殖的漿細(xì)胞產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體.(6)ELISA方法的選擇分為五種類型:1)酶標(biāo)抗原直接競爭抑制法;2)酶標(biāo)抗體直接競爭抑制法;3)酶標(biāo)抗體間接競爭抑制法;4)抗體夾心法;5)間接夾心法第十二頁，共十六頁。整理ppt(7)實(shí)驗(yàn)條件的選擇必須注意以下幾個方面:1)確定酶結(jié)合的最適濃度.2)確定包被物質(zhì)的最適濃度.3)樣品往往會產(chǎn)生交叉反響.4)樣品前處理時,使用的溶液必須考慮其影響抗體對分析物識別的可能性.(8)ELISA法的特點(diǎn):1)適用現(xiàn)場快速篩選;2)適用常規(guī)方法難以檢測的農(nóng)藥;3)適用環(huán)境監(jiān)控.第十三頁，共十六頁。整理ppt6.3生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用6.3.1生物傳感器的原理生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合,對特定種類物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置.傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目標(biāo)分析物之間,如酶與底物,抗原與抗體,外源凝集素與糖,核酸與其互補(bǔ)片段之間的識別反響會產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號的變化,這些變化通過不同原理的傳感器轉(zhuǎn)換成第二信號,經(jīng)放大后顯示記錄.第十四頁，共十六頁。整理ppt6.3.2電化學(xué)生物傳感器測定農(nóng)藥殘留生物傳感器中信號的測量主要有電化學(xué)和光化學(xué)兩種.電化學(xué)生物傳感器可分為電位型和安培型兩種.6.3.3免疫傳感器是利用抗體與抗原之間的免疫化學(xué)反響.第十五頁，共十六頁。整理ppt內(nèi)容總結(jié)農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定技術(shù)。原理是在測定過程，樣品提取液中的