第7章食藥用菌與酶

一、酶與食藥用菌的生長發(fā)育（一）酶(Enzyme)的定義：酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的蛋白質(zhì)。BeadleCenter,UniversityofNebraska1當(dāng)前第1頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（二）食藥用菌的生長特點(diǎn)：利用樹木（包括樹枝、樹葉）、秸稈、棉籽殼等；這些原料的主要成分是纖維素、木質(zhì)素、半纖維素和果膠質(zhì)等。2當(dāng)前第2頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)原料名稱纖維素半纖維素木質(zhì)素木材40-6010-3020-30秸稈30-3615-3518-32棉籽殼37-4822-2529-32稻草20-2535-369-15不同原料的木質(zhì)纖維素含量（%）3當(dāng)前第3頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)圖1木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)示意圖4當(dāng)前第4頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)圖2纖維素的結(jié)構(gòu)示意圖纖維素（cellulose）、是由許多葡萄糖基相互以糖甙鍵連接而成的線性高分子，纖維素的重復(fù)單元是纖維素二糖（cellobiose）5當(dāng)前第5頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)圖3半纖維素的結(jié)構(gòu)示意圖半纖維素（hemicelluloses）是由木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等多糖基組成的一種聚合物。具有多而短的支鏈，主鏈上一般不超過150－200個(gè)糖基。6當(dāng)前第6頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)圖4木質(zhì)素的基本組成單元木質(zhì)素（lignin）是一種具有芳香族特性，以苯丙烷為結(jié)構(gòu)單元，非結(jié)晶性的，三維高分子網(wǎng)狀化合物。重復(fù)結(jié)構(gòu)單元缺乏規(guī)律性和有序性。7當(dāng)前第7頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)果膠(Pectin)是一組聚半乳糖醛酸。它具有水溶性,工業(yè)上即可分離,其分子量約5萬一30萬。在適宜條件下其溶液能形成凝膠和部分發(fā)生甲氧基化（甲酯化，也就是形成甲醇酯）,其主要成分是部分甲酷化的a(l,4)一D一聚半乳糖醛酸。殘留的羧基單元以游離酸的形式存在或形成銨、鉀鈉和鈣等鹽。

8當(dāng)前第8頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（三）食藥用菌的酶系統(tǒng)：纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶9當(dāng)前第9頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)二、纖維素酶cellulase(1)組分：

纖維素酶內(nèi)切β-1.4葡聚糖水解酶，俗稱Cx酶——隨機(jī)內(nèi)切纖維素大分子中的β-1.4糖苷鍵，產(chǎn)物為纖維糊精，纖維寡糖外切β-1.4葡聚糖水解酶，俗稱C1酶β-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶——作用于纖維素分子非還原性末端的β-1.4糖苷鍵，產(chǎn)物為葡萄糖β-1.4葡聚糖纖維二糖水解酶——作用于纖維素分子非還原性末端的β-1.4糖苷鍵，產(chǎn)物為纖維二糖β-1.4葡萄糖苷酶，俗稱C1酶——水解纖維二糖，纖維寡糖的β-1.4糖苷鍵，產(chǎn)物為葡萄糖10當(dāng)前第10頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)11當(dāng)前第11頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)cellobioseCellulosecrystal12當(dāng)前第12頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（2）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)：13當(dāng)前第13頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

胞外酶pH：酸性纖維素酶：木腐菌。堿性纖維素酶：鬼傘、草菇等。pH7-10溫度：40-60℃分子量：45000-76000；14當(dāng)前第14頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（3）作用方式：各組分酶協(xié)同作用結(jié)晶纖維素可反應(yīng)的纖維素=[葡萄糖]n[葡萄糖]n纖維二糖葡萄糖圖4纖維素的作用機(jī)理β-葡萄糖苷酶內(nèi)切葡聚糖酶內(nèi)切葡聚糖酶外切葡聚糖酶15當(dāng)前第15頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（4）纖維素酶活力的測定方法酶活力單位（國際單位）：在特定條件下，每1min催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。濾紙?zhí)腔Ψǎ簻y定總纖維素酶活力CMC糖化法：測定外切β-1，4-葡聚糖的活力和內(nèi)切酶活力的總和。CMC液化力法：測定內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的活力。祥見：《酶制劑生產(chǎn)技術(shù)》，科學(xué)出版社，孫俊良，2007年1月16當(dāng)前第16頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（5）纖維素酶的生產(chǎn)菌株：綠色木霉、康氏木霉成分主要為內(nèi)切β-1.4葡聚糖水解酶Cx和C1外切β-1.4葡聚糖水解酶，俗稱C1酶

(6)纖維素酶的應(yīng)用大豆加工中作用：促進(jìn)大豆脫皮，增加水溶性蛋白的得率；淀粉加工中的作用：縮短加工時(shí)間，增加得率；果汁加工中的作用：促進(jìn)汁液澄清；飼料添加劑：提高飼料的利用率；17當(dāng)前第17頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)半纖維素酶hemicellulase（1）半纖維素的組成：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖和糖醛酸等混合組成的雜多糖；木聚糖是主要成分；（2）半纖維素酶主要酶種：內(nèi)切1，4-β-木聚糖酶、外切β-1，4木糖苷酶等；（3）作用方式：多種酶協(xié)同作用。先由內(nèi)切1，4-β-D-木聚糖酶切成木寡糖，再由外切β-木糖苷酶分解成木糖；同時(shí)需要α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶、乙酸酯酶和阿魏酸酯酶等的參與木糖與側(cè)鏈取代基之間的糖苷鍵，以提高降解效率。18當(dāng)前第18頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（4）木聚糖酶(xylanase)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)木聚糖的結(jié)構(gòu)19當(dāng)前第19頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)20當(dāng)前第20頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)性質(zhì)Xylanasestruction21當(dāng)前第21頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)內(nèi)切1，4-β-木聚糖酶：單亞基蛋白質(zhì)pH值最適反應(yīng)溫度等電點(diǎn)值分子量4-740-60℃3.6-10.38-145KD22當(dāng)前第22頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)β-木糖甘酶：單體、二聚體或四聚體；分子量：26000-360000；等電點(diǎn)：；是一種多功能酶，可酶切木糖苷鍵、α--阿拉伯糖苷鍵、β-葡萄糖糖苷鍵和β-半乳糖糖苷鍵，還具有1，4-木糖苷轉(zhuǎn)移酶和1，3-木糖苷轉(zhuǎn)移酶活性。木聚糖的完全降解需要各種酶與底物分子有完全的立體配位才能高效進(jìn)行23當(dāng)前第23頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（5）木聚糖酶活力的測定方法1）DNS法：常用2）Somogyi-Nelson法：試劑有一定毒性，少用3）RBB-Xylan法：簡單、靈敏度高、較準(zhǔn)確，但價(jià)格貴。（6）生產(chǎn)菌株：木霉和曲霉，固體發(fā)酵24當(dāng)前第24頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)(7)木聚糖酶的應(yīng)用造紙工業(yè)：紙漿用木聚糖酶預(yù)處理后，減少漂白過程中有毒化學(xué)藥品的使用量，并且改善漂白效果；食品行業(yè)：作為食品增稠劑、脂肪替代物或冷凍食品添加劑。低聚木糖是很好的腸道保健品；飼料行業(yè)：提高飼料的利用率。25當(dāng)前第25頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)木質(zhì)素酶ligninase木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)（1）26當(dāng)前第26頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（2）木質(zhì)素酶系：主要有：木質(zhì)素過氧化物酶（ligninperoxidase,Lip)；錳過氧化物酶（Manganeseperoxidase,MnP）；

√漆酶（laccase,Lac)

。其他：芳醇氧化酶(aryl-alcoholoxidase,AAO);乙二醛氧化酶（gyoxaloxidase,GLOX）；葡萄糖氧化酶（glucose-L-oxidase）；酚氧化酶、過氧化氫酶等。27當(dāng)前第27頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)漆酶（laccase,Lac)

（1）基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì)漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(polyphenoloxidase)，與植物抗壞血酸氧化酶和哺乳動(dòng)物血漿銅藍(lán)蛋白同屬于銅藍(lán)蛋白家族。是一類細(xì)胞外的糖蛋白。

28當(dāng)前第28頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)分子量：60-100KDa;存在多種同工酶，如從平菇中分離的漆酶至少有3種同工酶；催化底物：各種酚類化合物，如：1）簡單的二酚，包括對(duì)苯二酚、鄰苯二酚等；2）甲氧基取代酚，包括愈創(chuàng)木酚、2，6-二甲基苯酚等；3）氨基酚、多酚等；4）ABTS（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic,2，2’-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）；5）各種染料；來源：大型真菌、木霉、細(xì)菌。29當(dāng)前第29頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)（2）漆酶菌株的篩選30當(dāng)前第30頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)漆酶菌株的初篩31當(dāng)前第31頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

漆酶高產(chǎn)菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化32當(dāng)前第32頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

搖瓶和靜止培養(yǎng)對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響33當(dāng)前第33頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

銅離子對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響不同銅離子濃度對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶活性的影響34當(dāng)前第34頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

銅離子對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響銅離子加入時(shí)間對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響35當(dāng)前第35頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

氮源對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響不同氮源對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響36當(dāng)前第36頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

碳源對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響不同碳源對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響37當(dāng)前第37頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

碳源對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響不同淀粉添加量對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響38當(dāng)前第38頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)

誘導(dǎo)劑對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株產(chǎn)漆酶的影響誘導(dǎo)劑對(duì)靈芝TR6號(hào)菌株漆酶分泌的影響39當(dāng)前第39頁\共有42頁\編于星期六\13點(diǎn)靈芝TR6號(hào)漆酶分離純化

DEAESepharoseFastFlow柱層析

靈芝TR6號(hào)漆酶的DEAESepharos