微生物限度和無菌檢查法驗(yàn)證

微生物限度和無菌檢查法驗(yàn)證第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二微生物限度和無菌檢查法驗(yàn)證意義：

中國藥典2000年版及以前的版本雖然收載了微生物限度檢查法和無菌檢查法，但在如何保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性及檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性方面存在一些問題，與國外藥典的相關(guān)要求比較有一定差距，關(guān)鍵是未明確對檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的方法學(xué)驗(yàn)證。以前品種的申報(bào)資料中一般僅提供微生物限度檢查或無菌檢查的檢查結(jié)果，無方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容。但從保證藥品安全性的實(shí)際出發(fā)，不同品種需要選擇建立各自適當(dāng)?shù)臋z查方法，即使是仿制藥，由于不同生產(chǎn)企業(yè)采用的工藝、輔料等的不同，其產(chǎn)品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性，進(jìn)行微生物限度檢查或無菌檢查時(shí)，具體的檢查方法也不能簡單地照搬，需要通過試驗(yàn)驗(yàn)證核實(shí)已有的試驗(yàn)方法和檢測系統(tǒng)是否適用，因此，也需要進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。

第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二中國藥典2005年版對微生物限度檢查法和無菌檢查法進(jìn)行了修訂完善，明確規(guī)定進(jìn)行藥微生物限度和無菌檢查法驗(yàn)證目的是確認(rèn)試驗(yàn)中應(yīng)選擇藥典收載的何種供試液制備方法、何種測定方法，以及驗(yàn)證確定的檢測系統(tǒng)是否適用于該藥品的檢驗(yàn)。如果供試品有抑菌性，影響測定結(jié)果，則應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ┰囈旱囊志钚院笤龠M(jìn)行檢查。也就是說，只有通過方法驗(yàn)證，才能確定針對具體品種的具體的檢驗(yàn)方法，保證采用的方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二方法驗(yàn)證的思路

首先了解供試品是否有抑菌性、抑何種菌，再考慮選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蚪档凸┰嚻返囊志?，然后用試?yàn)驗(yàn)證所采用的方法已經(jīng)消除了抑菌性（能使人工加入的各種試驗(yàn)菌生長良好），特別是能滿足對產(chǎn)品最敏感菌的生長；最后將所作的試驗(yàn)記錄在案，形成確認(rèn)該供試品在該檢驗(yàn)量及該檢驗(yàn)條件下，已充分消除抑菌性，能確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的驗(yàn)證報(bào)告。

第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二微生物限度和無菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)可概括描述為：在采用的檢驗(yàn)方法和過程中，通過分別加入規(guī)定量的代表性微生物，以驗(yàn)證供試品是否在規(guī)定的檢驗(yàn)量、在所采用的檢驗(yàn)條件下無抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作系統(tǒng)中可能對微生物生長有影響的各種因素），并且所用方法對微生物生長無不良影響，從而確認(rèn)檢驗(yàn)方法的有效性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。整個(gè)試驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明，保證其對結(jié)果的判斷沒有影響。

第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二方法驗(yàn)證的重點(diǎn)

1、驗(yàn)證制成適宜供試液的前處理方法，證明方法對微生物生長、檢出無影響。

2、驗(yàn)證樣品有無抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那一個(gè)？其結(jié)果將直接影響后續(xù)檢驗(yàn)方法的選擇和操作步驟的進(jìn)行，同時(shí)是最終所選檢驗(yàn)方法和操作步驟合理性的證明。

3、驗(yàn)證消除樣品抑菌性的方法，證明方法的有效性及方法對污染菌生長無影響；如何選擇合理、適宜、簡單有效的消除抑菌性的方法是當(dāng)前驗(yàn)證工作的關(guān)鍵。

第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二方法驗(yàn)證的步驟與內(nèi)容

1、制備驗(yàn)證試驗(yàn)用菌液

按藥典無菌檢查法中培養(yǎng)基靈敏度檢查項(xiàng)中試驗(yàn)用菌液的制備方法將規(guī)定需用的試驗(yàn)菌分別制成每毫升中含10～100個(gè)菌（CFU）的供試菌液。

2、樣品的前處理方法

樣品的前處理方法是驗(yàn)證試驗(yàn)的一部分，需證明所用的處理方法對各試驗(yàn)菌的生長無影響。

根據(jù)供試品的性狀，選用以下適宜的方法，或幾種方法聯(lián)合使用：

溶解：驗(yàn)證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對微生物的生長無影響。

第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二乳化：驗(yàn)證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對微生物的生長無影響。

破乳：驗(yàn)證所用破乳劑的有效性、使用量及對微生物的生長無影響。

萃取：驗(yàn)證有機(jī)相選擇的合理性、有效性及對微生物的生長無影響。

稀釋：驗(yàn)證降低供試品相對抑菌濃度的有效稀釋倍數(shù)。

離心：驗(yàn)證所用轉(zhuǎn)速、時(shí)間和微生物的分布情況。

應(yīng)說明采取某種前處理方法的原因，如樣品不需要特別的前處理就能制成均勻的供試液，這一步可以省掉，直接進(jìn)入確定樣品有無抑菌性的步驟。

第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二確定供試品是否有抑菌性、抑什么菌？

通過文獻(xiàn)資料或申報(bào)資料中的藥效學(xué)資料，了解其對不同細(xì)菌的MIC，參考已經(jīng)驗(yàn)證過的品種、抗菌藥物可根據(jù)抗菌譜確定敏感菌、中成藥抗菌譜不清楚，至少需選擇一株細(xì)菌和一株真菌來試驗(yàn)。也可以直接通過驗(yàn)證試驗(yàn)確定抑菌性。

試驗(yàn)確定抑菌性的方法：在規(guī)定量的供試液中加入試驗(yàn)用微生物10～100個(gè)，如微生物生長良好，說明供試品對該種微生物無抑菌活性。如已用藥典規(guī)定的各試驗(yàn)菌進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果均能生長良好，說明供試品無抑菌性，可用常規(guī)方法檢驗(yàn)。如加入的微生物不生長或生長緩慢，說明供試品有抑菌性；如加入的微生物中有某一種菌最不能生長或生長最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。

第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛴行Ы档凸┰嚻返囊志?/p>

根據(jù)供試品的特性選擇藥典規(guī)定的消除其抑菌性的方法（一種或幾種方法聯(lián)合），或根據(jù)藥物的化學(xué)特性，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑；并通過模擬試驗(yàn)（驗(yàn)證試驗(yàn)）對消除或降低抑菌性的效果進(jìn)行檢驗(yàn)。

無菌檢查可采用：①薄膜過濾法；②中和法（目前藥典僅收載β-內(nèi)酰胺酶處理法）。

①薄膜過濾法適用于液體供試品和可溶于水的固體供試品（只要許可，應(yīng)首先采用）。驗(yàn)證的重點(diǎn)是確定濾膜的適用性、確定沖洗的方法和沖洗液的用量。

第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二中和法適用于能充分被其滅活抑菌活性的樣品（如β-內(nèi)酰胺酶滅活β-內(nèi)酰胺類、對氨基苯甲酸滅活磺胺類）。驗(yàn)證的重點(diǎn)是確定中和劑有效、證明對污染微生物的生長無毒性，以及加入的方法和加入量。

檢驗(yàn)供試品是否已消除或降低抑菌性的驗(yàn)證試驗(yàn)：每種試驗(yàn)菌為一組，每組兩管，其中一管為供試品加試驗(yàn)菌管，另一管為試驗(yàn)菌對照管。

結(jié)果判斷：如平行3次獨(dú)立試驗(yàn)，各管微生物均生長良好，說明供試品已消除了抑菌活性；可以進(jìn)行該品的無菌檢查。如有供試品管的微生物生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品仍有抑菌性；應(yīng)考慮進(jìn)一步增加沖洗量或中和劑的用量，以消除抑菌性，并重新進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證證明已充分消除或有效降低供試品的抑菌性為止。

第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二微生物限度檢查可采用：①培養(yǎng)基稀釋法；②離心沉淀法；③薄膜過濾法；④中和法。

①培養(yǎng)基稀釋法：取規(guī)定量的供試品/供試液加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品濃度降低至不顯抑菌作用。該方法適用于不能采用薄膜過濾法且抑菌活性較弱的樣品。驗(yàn)證的重點(diǎn)是確定培養(yǎng)基量增加至多少才能使供試品/供試液不顯抑菌活性。

②離心沉淀法：利用沉降系數(shù)差異分離去掉藥渣、含抑菌活性的部分，留下含微生物的部分。該方法適用于不能采用薄膜過濾等方法的樣品。驗(yàn)證的重點(diǎn)是確定能將藥渣、抑菌部分分離掉而留下微生物的有效的離心率。

③薄膜過濾法：同無菌檢查法，?？膳c離心沉淀法聯(lián)合使用。

④中和法：同無菌檢查法。

實(shí)踐證明幾種方法聯(lián)合使用效果更好。薄膜過濾法和中和法是最有效的消除抑菌性的方法。但是應(yīng)對樣品采取某種消除抑菌性的方法的原因進(jìn)行說明。

第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二由于微生物限度檢查由菌數(shù)計(jì)數(shù)和控制菌檢查兩部分組成，所以，在檢驗(yàn)是否已消除或有效降低抑菌性的試驗(yàn)中也應(yīng)分別進(jìn)行驗(yàn)證。

微生物限度檢查中的菌數(shù)計(jì)數(shù)屬定量試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)是通過對加入的各種規(guī)定微生物的回收率試驗(yàn)進(jìn)行。驗(yàn)證中可以僅選用已確定的敏感菌，這樣可減少工作量，因?yàn)?，能滿足敏感菌生長的條件必然能滿足其他菌的生長。也可以完全按照藥典規(guī)定，逐一進(jìn)行每種試驗(yàn)菌的驗(yàn)證：對每種試驗(yàn)菌均建立（1）試驗(yàn)組（供試液加菌液組）菌數(shù)計(jì)數(shù)測得CFU1；（2）菌液組菌數(shù)計(jì)數(shù)測得CFU2；（3）供試液本身對照組菌數(shù)計(jì)數(shù)測得CFU3；（4）稀釋劑對照組?菌數(shù)計(jì)數(shù)測得CFU4。驗(yàn)證試驗(yàn)和對驗(yàn)證結(jié)果的判斷：應(yīng)符合CFU4÷CFU2≥70%、（CFU1－CFU3）÷CFU2≥70%。如兩個(gè)回收率均≥70%，則說明所用方法已消除了供試品的抑菌性；可以按該方法進(jìn)行該品種的菌數(shù)計(jì)數(shù)檢查。如回收率小于70%，則說明供試品仍有抑菌性，應(yīng)進(jìn)一步考慮采取適宜的措施以消除其抑菌性，并重新進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證的回收率均≥70%，證明已充分消除或有效降低供試品的抑菌性為止。

第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二微生物限度檢查中的控制菌檢查屬定性試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)置：（1）目標(biāo)菌陽性對照管；（2）供試品＋目標(biāo)菌管；（3）陰性對照管；（4）非目標(biāo)菌對照管。驗(yàn)證試驗(yàn)和對驗(yàn)證結(jié)果的判斷：（1）目標(biāo)菌陽性對照管菌必須生長良好；（2）供試品＋目標(biāo)菌管生長良好；（3）陰性對照管必須無菌生長；（4）陰性菌對照必須無菌生長。上述試驗(yàn)成立，則說明所用方法已消除或充分減低了供試品的抑菌性；可以按該方法進(jìn)行該品種的控制菌檢查。如出現(xiàn)（2）供試品＋目標(biāo)菌管生長緩慢、或不生長，則說明供試品仍有抑菌性，應(yīng)進(jìn)一步考慮采取適宜的措施以消除其抑菌性，并進(jìn)行重新驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果中（2）供試品＋目標(biāo)菌管與（1）目標(biāo)菌陽性對照管相同，證明已充分消除或有效降低供試品的抑菌性為止。如出現(xiàn)（3）陰性對照管有菌生長；（4）陰性菌對照管有菌生長；則說明試驗(yàn)不成立，所用方法不專屬，應(yīng)尋找原因并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二方法驗(yàn)證中應(yīng)注意的問題與評價(jià)要求

1、驗(yàn)證試驗(yàn)的完整性

驗(yàn)證試驗(yàn)的完整性與方法的科學(xué)性密切相關(guān)，驗(yàn)證工作不完整，就不能全面體現(xiàn)供試品和試驗(yàn)過程對微生物的影響情況，則很可能影響或干擾對最終試驗(yàn)結(jié)果的判斷。故應(yīng)按照中國藥典2005年版的要求進(jìn)行方法驗(yàn)證。特別是對某些具有抑菌性的供試品，需采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛴行Ы档凸┰嚻返囊志?。在對供試品進(jìn)行特殊處理時(shí)，既要考察供試品的抑菌性，還要考察在供試液制備過程中微生物受影響的程度（稀釋劑對照組）。

第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二試驗(yàn)操作方法

中國藥典2005年版無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，微生物限度檢查法包括平皿法和薄膜過濾法。薄膜過濾法采用大取樣量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作簡單；全封閉的過濾系統(tǒng)，避免了操作過程中外源性細(xì)菌的污染，對試驗(yàn)結(jié)果可信性影響較小。故盡量采用全封閉的薄膜過濾法。

3、樣品的前處理

樣品的前處理可采用溶解、乳化、破乳、稀釋、離心等方法，也可幾種方法聯(lián)用，但需說明采用的處理方法的理由，并證明所用處理方法對各試驗(yàn)菌的生長無影響。

對非水溶性的供試品，如果溶解沖洗不完全，會影響試驗(yàn)結(jié)果；故應(yīng)注意使用加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑和稀釋劑，或用十四烷酸異丙酯處理油類供試品等。

第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二05版藥典微生物限度檢查法操作要點(diǎn)細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證所用的菌株：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]：代表革蘭陰性菌；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]：代表革蘭陽性球菌；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]：代表革蘭陽性桿菌；霉菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證所用的菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98001]：代表酵母菌；黑曲霉[CMCC（F）98003：代表霉菌；由于每個(gè)菌株代表不同類型的菌，所以只有這五個(gè)菌株的回收率均達(dá)到要求，才表明樣品中污染的各種類型的菌都可能檢出來，否則，所得的結(jié)果是不能真實(shí)地反映樣品的污染情況的。

第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二菌液的制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～l00cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出胞子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管)至無菌試管內(nèi)，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～l00cfu的孢子懸液。第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二方法的驗(yàn)證所有驗(yàn)證方法的操作均應(yīng)在陽性接種間。（一）、細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證驗(yàn)證方法取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級供試液進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌株每次試驗(yàn)的回收率。1．常規(guī)法就是取1:10的供試液1ml和50~100個(gè)試驗(yàn)菌株加入到1個(gè)平皿中，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，培養(yǎng)，計(jì)算各菌株的回收率。常規(guī)法做一個(gè)樣品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，需要多少個(gè)平皿呢？試驗(yàn)組：5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株做2ml共需10個(gè)；菌液組：5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株的加菌量，每株2個(gè)皿。共24個(gè)本底菌組：2個(gè)細(xì)菌計(jì)數(shù)，2個(gè)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證所用的平皿共14個(gè)，其中6個(gè)用于試驗(yàn)組計(jì)數(shù)，6個(gè)用于菌液組計(jì)數(shù)，2個(gè)用于細(xì)菌本底菌計(jì)數(shù)，傾倒?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)所用的平皿共10個(gè)，其中4個(gè)用于試驗(yàn)組計(jì)數(shù)，4個(gè)用于菌液組計(jì)數(shù)，2個(gè)用于霉菌本底菌計(jì)數(shù)，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）?；厥章?[(試驗(yàn)組菌數(shù)-本底菌組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)]當(dāng)大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌3個(gè)菌株的回收率均達(dá)到70%以上時(shí)，細(xì)菌計(jì)數(shù)用該驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)。當(dāng)白色念珠菌和黑曲霉2個(gè)菌株的回收率均達(dá)到70%以上時(shí)，霉菌計(jì)數(shù)用該驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)。第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二2．培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級的供試液2ml，每lml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每lml供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為lml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。具體操作：（以1ml分至5個(gè)皿為例）就是取1:10的供試液1ml均勻分注到5個(gè)平皿中，每個(gè)皿0.2ml，每株試驗(yàn)菌平行制備2ml的平皿數(shù)，然后加入相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計(jì)算各菌株的回收率。用該法做一個(gè)樣品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，需要多少個(gè)平皿呢？試驗(yàn)組：5×10=50個(gè)，即每個(gè)菌株做2ml共需50個(gè)；菌液組：5×2=10個(gè)，即每個(gè)菌株的加菌量，每株2個(gè)皿。共80個(gè)本底菌組：10個(gè)細(xì)菌計(jì)數(shù)，10個(gè)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。3．離心沉淀集菌法取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心),棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。然后用此稀釋液進(jìn)行檢驗(yàn)。第二十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二4．薄膜過濾法取相當(dāng)于每張濾膜含1g或lml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g或lml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液lml，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或真菌瓊脂培養(yǎng)上。每種菌株至少制備一張濾膜。即每個(gè)驗(yàn)證樣品至少制備7個(gè)膜。（5個(gè)試驗(yàn)組和2個(gè)本底菌）第二十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二控制菌檢查方法的驗(yàn)證驗(yàn)證時(shí)，依各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。菌種對試驗(yàn)菌種的要求同細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證。大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]金