生化分離工程實(shí)驗(yàn)

生化分離工程實(shí)驗(yàn)第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三助教學(xué)生：趙有文zhaoyouwen1987@

劉舒liushude101@163.com

胡軼敏huyimin11@163.com

危雅樂yale.happy@163.com第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三1組李佳佳（組長）董奇峰吳婷婷楊后召2組范文瑾（組長）謝貽天熊雅琪羅文3組劉小翠（組長）張?bào)?/p>

鄭琦

孟慶4組羅云超（組長）劉浩宇黃瑋

李智5組唐清（組長）李斌

嚴(yán)楠峰

柴芝培6組白騰龍（組長）伍良偉

余樂

裴媛筠7組鄒錚錚（組長）劉娟

尹學(xué)琳

王海云8組趙鵬（組長）張靈芬

潘麗娜

余曉嵐第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三菌株的優(yōu)化培養(yǎng)總DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR擴(kuò)增目的基因乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達(dá)載體pET-28酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒(PCR及酶切驗(yàn)證)檢索感興趣的基因（hfq/fabz）直接優(yōu)化并合成連T載測(cè)序第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21挑取重組子,用菌落PCR方法驗(yàn)證IPTG誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達(dá)細(xì)胞破碎及蛋白抽提目標(biāo)蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測(cè)定--Bradford法目標(biāo)蛋白的鑒定—Westernbiotting結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析本次試驗(yàn)內(nèi)容第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三本次試驗(yàn)的主要內(nèi)容His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)無細(xì)胞體系第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三目的基因的背景資料HfqfabZHfq是一個(gè)高度保守的RNA結(jié)合蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)是作為大腸桿菌RNA噬菌體Qβ復(fù)制所必需的管家因子?，F(xiàn)在則被認(rèn)為是細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子，廣泛參與細(xì)菌多種生命活動(dòng)的調(diào)控。大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫水酶，是大腸桿菌中的必須基因，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）一，接種按1%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,做好標(biāo)記（寫清組號(hào)，菌株信息、抗性），統(tǒng)一放于第八組臺(tái)面。系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)菌株編號(hào)HAZJH022宿主菌大腸桿菌BL21大腸桿菌DH5α目的基因hfqfabZ培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基接種量1%（2ml）1%（2ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）將超凈臺(tái)內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200μl于1.5ml離心管中，10000rpm/min離心1min，棄上清，加入200μl的無菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基10000rpm/min離心1min，棄上清，然后重懸于40μl滅過菌的去離子水中，100℃煮15min，10000rpm/min離心1min，取上清9.2μl作為菌落PCR的模板。二，菌液PCR（驗(yàn)證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中）第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三PCR體系H2O9.2μl10XPCRbuffer2.5μldNTP2.0μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlTaq酶0.3μl模板10μl總體積25μlPCR程序95℃5min95℃35s56℃40s72℃60s72℃10min25℃10minCycle30注：用質(zhì)粒做陽性對(duì)照，水做陰性對(duì)照，不用重復(fù)，PCR管上做好標(biāo)記！第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三

ThepMAL-c2seriesofvectorshaveanexactdeletionofthemalEsignalsequence,resultingincytoplasmicexpressionofthefusionprotein.ThepMAL-p2seriesofvectorscontainthenormalmalEsignalsequence,whichdirectsthefusionproteinthroughthecytoplasmicmembrane,andthefusionproteinscanbeexportedtotheperiplasm第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三表達(dá)系統(tǒng)His-TagpMAL菌株HAZJH022培養(yǎng)溫度37℃37℃轉(zhuǎn)速200rpm/min200rpm/min適宜狀態(tài)OD600=0.6OD600=0.5所需時(shí)間2.5h2.5h加入IPTG的終濃度1.0mM(2ml)0.3mM(0.6ml)三，誘導(dǎo)注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1ml于1.5ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號(hào)，菌液名）記作“誘導(dǎo)前”，放于第八組桌面的離心管板中，于—20℃保存。第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三四，配試劑五，PCR結(jié)果依據(jù)每組發(fā)的紙條進(jìn)行第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期五）將加入誘導(dǎo)劑后的菌液再放入37℃200rpm/min的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5小時(shí)后收集菌體。菌株HAZJH022沉淀（離心管對(duì)應(yīng)配平）8000rpm/mim離心5min8000rpm/mim離心5min收菌棄上清，沉淀用10mlbindingbuffer重懸棄上清，沉淀用10mlcolumnbuffer重懸保存—20℃—20℃注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1ml于1.5ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號(hào)，菌液名）記作“誘導(dǎo)后”放在第八組的離心管板上。

離心時(shí)用天平嚴(yán)格配平，沉淀重懸后做好標(biāo)記放于第八組桌面上！六，收菌第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三組氨酸和Ni-NTAimidazole

第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三親和作用原理第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三6×His/Ni-NTA親和純化步驟第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三系統(tǒng)原理示意圖pMAL第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三Ni柱的清洗與保存第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）充電（裝滿NiSO4，溫和搖動(dòng)后自然沉降）洗滌（3次水洗，去掉游離的Ni)平衡（2次的bindingbuffer洗）1234His—Tag蛋白質(zhì)的純化步驟上樣（每次15ml，樣品要與柱子充分結(jié)合）加washingbuffer（用100%TCA檢測(cè)不出沉淀為止）加Elutionbuffer（一般收集8ml）重復(fù)第4~8步5678第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第1步：2倍體積6M鹽酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍體積水第3步：1倍體積2%SDS（注意低溫容易析出）第4步：1倍體積25%乙醇第5步：1倍體積50%乙醇第6步：1倍體積75%乙醇第7步：5倍體積100%乙醇第8步：1倍體積75%乙醇第9步：1倍體積50%乙醇第10步：1倍體積25%乙醇第11步：1倍體積水第12步：5倍體積100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍體積水由于EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時(shí)應(yīng)另換His·Bind樹脂。樹脂的再生當(dāng)柱流速明顯下降，或樹脂在使用離子化緩沖液處理之后沒能顯示深藍(lán)綠色，則樹脂需要更徹底的清洗處理。第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三直鏈淀粉柱的再生水3倍柱體積0.1%SDS3倍柱體積水1倍柱體積Columnbuffer3倍柱體積第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）一、裂解細(xì)胞將冷凍保存的細(xì)胞團(tuán)在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超聲6×10s-10s，約20min）,天平嚴(yán)格配平后10000*g，4℃，離心20min。上清取1ml于1.5ml離心管中，作標(biāo)記為“上清”，沉淀用1ml對(duì)應(yīng)的buffer（his-tag為bindingbuffer，pMAL為columnbuffer）重懸后，保存在1.5ml的離心管中，標(biāo)記為“沉淀”，做好組號(hào)和菌株標(biāo)記后，放于第八組臺(tái)面。第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三二，蛋白純化系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)柱子類型Ni-NTA柱支鏈淀粉柱操作方法3次bindingbuffer平衡3次columnbuffer平衡堵住下端后上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復(fù)三次上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復(fù)三次收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標(biāo)記“穿透”收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標(biāo)記“穿透”6次washbuffer水洗Columnbuffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管，做好標(biāo)記Elutionbuffer洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管，并做好標(biāo)記第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)操作步驟Elutionbuffer洗滌2次buffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后續(xù)反應(yīng)酶切去除標(biāo)簽注：收集到的蛋白做好標(biāo)記后須在冰上保存，避免其失活pMAL?系統(tǒng)MBP標(biāo)簽的切除從A595最大的幾管(一般是第一、二管)取100μl用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100μl洗脫液中取15ul保存在pcr管中，作為酶切對(duì)照，剩下的加入2ul的FactorXa后置于搖床上震蕩反應(yīng)，室溫下反應(yīng)18h，分別于第1h、3h、6h、17h取樣15μl。第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三三，SDS—PAGE樣品的制備將收集到的14管目的蛋白和之前保存的“上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20ul于對(duì)應(yīng)的已經(jīng)標(biāo)記的1.5ml離心管中，加入20ulSDSloadingbuffer，將先前保存的“誘導(dǎo)前”“誘導(dǎo)后”（共4管）于10000rpm/min離心1min，棄上清，沉淀用15ul對(duì)應(yīng)的buffer重懸，再加入15ulSDSloadingbuffer，沸水浴15min后，放于第八組臺(tái)面。第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三無細(xì)胞體系第二十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）四，Bradfordproteinassay1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1L。第三十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三管號(hào)1234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（ml）00.010.020.040.060.080.10蒸餾水（ml）0.10.090.080.060.040.020考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（ml）5555555A595每加完一管立即在漩渦振蕩器上混合，2~5min后以1號(hào)為對(duì)照調(diào)零測(cè)A595以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（ug）為橫坐標(biāo)，用吸光度A595為縱坐標(biāo)作標(biāo)曲注;震蕩過程中不要太劇烈，以免產(chǎn)生較多氣泡而無法消除第三十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三管號(hào)1234567HAZ和Fabz(ml）0.050.050.050.050.050.050.05蒸餾水（ml）0.050.050.050.050.050.050.05考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（ml）5555555HAZA595FabzA595五，未知蛋白濃度的測(cè)定將保存的純化的蛋白各取50ul，加50ul蒸餾水后再加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250染液試劑，漩渦震蕩后靜止2~5min，以0.1ml水加5.0ml的G-250試劑調(diào)零，測(cè)其在595nm處的吸光度。第三十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期六）六，

配制SDS試劑分離膠（12%)濃縮膠(5%)ddH2O9.0ml5.0ml40%丙烯酰胺6ml1.0ml分離膠-buffer5.0ml不加濃縮膠-buffer不加2ml10%APS100μl60μlTEMED20μl20μl總體積20ml8ml每組配兩塊，均采用15孔梳子注：在配膠前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）與膠板厚度的一致性第三十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實(shí)驗(yàn)（星期天）跑SDS點(diǎn)樣：所有的樣品和蛋白Marker點(diǎn)樣前都要沸水浴5分鐘使蛋白質(zhì)完全變性。一般的點(diǎn)樣量為10-20ul。(記錄點(diǎn)樣順序)點(diǎn)樣完畢后即可開始電泳，先以80伏電壓跑15-20分鐘，蛋白質(zhì)通過積層膠后