生化分離工程實驗

生化分離工程實驗第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三助教學生：趙有文zhaoyouwen1987@

劉舒liushude101@163.com

胡軼敏huyimin11@163.com

危雅樂yale.happy@163.com第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三1組李佳佳（組長）董奇峰吳婷婷楊后召2組范文瑾（組長）謝貽天熊雅琪羅文3組劉小翠（組長）張箐

鄭琦

孟慶4組羅云超（組長）劉浩宇黃瑋

李智5組唐清（組長）李斌

嚴楠峰

柴芝培6組白騰龍（組長）伍良偉

余樂

裴媛筠7組鄒錚錚（組長）劉娟

尹學琳

王海云8組趙鵬（組長）張靈芬

潘麗娜

余曉嵐第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三菌株的優(yōu)化培養(yǎng)總DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR擴增目的基因乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達載體pET-28酶連產(chǎn)物轉化E.coliDH5挑取轉化子并抽提質(zhì)粒驗證表達質(zhì)粒(PCR及酶切驗證)檢索感興趣的基因（hfq/fabz）直接優(yōu)化并合成連T載測序第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三重組表達質(zhì)粒轉化E.coliBL21挑取重組子,用菌落PCR方法驗證IPTG誘導促使目的大量蛋白表達細胞破碎及蛋白抽提目標蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測定--Bradford法目標蛋白的鑒定—Westernbiotting結晶結構解析本次試驗內(nèi)容第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三本次試驗的主要內(nèi)容His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)無細胞體系第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三目的基因的背景資料HfqfabZHfq是一個高度保守的RNA結合蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)是作為大腸桿菌RNA噬菌體Qβ復制所必需的管家因子。現(xiàn)在則被認為是細菌基因轉錄后調(diào)控的關鍵因子，廣泛參與細菌多種生命活動的調(diào)控。大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫水酶，是大腸桿菌中的必須基因，該基因的突變會導致細菌細胞的死亡。第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期五）一，接種按1%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,做好標記（寫清組號，菌株信息、抗性），統(tǒng)一放于第八組臺面。系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)菌株編號HAZJH022宿主菌大腸桿菌BL21大腸桿菌DH5α目的基因hfqfabZ培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基接種量1%（2ml）1%（2ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期五）將超凈臺內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200μl于1.5ml離心管中，10000rpm/min離心1min，棄上清，加入200μl的無菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基10000rpm/min離心1min，棄上清，然后重懸于40μl滅過菌的去離子水中，100℃煮15min，10000rpm/min離心1min，取上清9.2μl作為菌落PCR的模板。二，菌液PCR（驗證目的基因已轉入宿主菌中）第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三PCR體系H2O9.2μl10XPCRbuffer2.5μldNTP2.0μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlTaq酶0.3μl模板10μl總體積25μlPCR程序95℃5min95℃35s56℃40s72℃60s72℃10min25℃10minCycle30注：用質(zhì)粒做陽性對照，水做陰性對照，不用重復，PCR管上做好標記！第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三

ThepMAL-c2seriesofvectorshaveanexactdeletionofthemalEsignalsequence,resultingincytoplasmicexpressionofthefusionprotein.ThepMAL-p2seriesofvectorscontainthenormalmalEsignalsequence,whichdirectsthefusionproteinthroughthecytoplasmicmembrane,andthefusionproteinscanbeexportedtotheperiplasm第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三表達系統(tǒng)His-TagpMAL菌株HAZJH022培養(yǎng)溫度37℃37℃轉速200rpm/min200rpm/min適宜狀態(tài)OD600=0.6OD600=0.5所需時間2.5h2.5h加入IPTG的終濃度1.0mM(2ml)0.3mM(0.6ml)三，誘導注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1ml于1.5ml的離心管中，做好標記（組號，菌液名）記作“誘導前”，放于第八組桌面的離心管板中，于—20℃保存。第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三四，配試劑五，PCR結果依據(jù)每組發(fā)的紙條進行第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期五）將加入誘導劑后的菌液再放入37℃200rpm/min的搖床中誘導培養(yǎng)4-5小時后收集菌體。菌株HAZJH022沉淀（離心管對應配平）8000rpm/mim離心5min8000rpm/mim離心5min收菌棄上清，沉淀用10mlbindingbuffer重懸棄上清，沉淀用10mlcolumnbuffer重懸保存—20℃—20℃注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1ml于1.5ml的離心管中，做好標記（組號，菌液名）記作“誘導后”放在第八組的離心管板上。

離心時用天平嚴格配平，沉淀重懸后做好標記放于第八組桌面上！六，收菌第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三組氨酸和Ni-NTAimidazole

第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三親和作用原理第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三6×His/Ni-NTA親和純化步驟第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三系統(tǒng)原理示意圖pMAL第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三Ni柱的清洗與保存第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）充電（裝滿NiSO4，溫和搖動后自然沉降）洗滌（3次水洗，去掉游離的Ni)平衡（2次的bindingbuffer洗）1234His—Tag蛋白質(zhì)的純化步驟上樣（每次15ml，樣品要與柱子充分結合）加washingbuffer（用100%TCA檢測不出沉淀為止）加Elutionbuffer（一般收集8ml）重復第4~8步5678第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三第1步：2倍體積6M鹽酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍體積水第3步：1倍體積2%SDS（注意低溫容易析出）第4步：1倍體積25%乙醇第5步：1倍體積50%乙醇第6步：1倍體積75%乙醇第7步：5倍體積100%乙醇第8步：1倍體積75%乙醇第9步：1倍體積50%乙醇第10步：1倍體積25%乙醇第11步：1倍體積水第12步：5倍體積100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍體積水由于EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時應另換His·Bind樹脂。樹脂的再生當柱流速明顯下降，或樹脂在使用離子化緩沖液處理之后沒能顯示深藍綠色，則樹脂需要更徹底的清洗處理。第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三直鏈淀粉柱的再生水3倍柱體積0.1%SDS3倍柱體積水1倍柱體積Columnbuffer3倍柱體積第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期六）一、裂解細胞將冷凍保存的細胞團在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超聲6×10s-10s，約20min）,天平嚴格配平后10000*g，4℃，離心20min。上清取1ml于1.5ml離心管中，作標記為“上清”，沉淀用1ml對應的buffer（his-tag為bindingbuffer，pMAL為columnbuffer）重懸后，保存在1.5ml的離心管中，標記為“沉淀”，做好組號和菌株標記后，放于第八組臺面。第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三二，蛋白純化系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)柱子類型Ni-NTA柱支鏈淀粉柱操作方法3次bindingbuffer平衡3次columnbuffer平衡堵住下端后上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復三次上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復三次收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標記“穿透”收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標記“穿透”6次washbuffer水洗Columnbuffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管，做好標記Elutionbuffer洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管，并做好標記第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)操作步驟Elutionbuffer洗滌2次buffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后續(xù)反應酶切去除標簽注：收集到的蛋白做好標記后須在冰上保存，避免其失活pMAL?系統(tǒng)MBP標簽的切除從A595最大的幾管(一般是第一、二管)取100μl用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100μl洗脫液中取15ul保存在pcr管中，作為酶切對照，剩下的加入2ul的FactorXa后置于搖床上震蕩反應，室溫下反應18h，分別于第1h、3h、6h、17h取樣15μl。第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三三，SDS—PAGE樣品的制備將收集到的14管目的蛋白和之前保存的“上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20ul于對應的已經(jīng)標記的1.5ml離心管中，加入20ulSDSloadingbuffer，將先前保存的“誘導前”“誘導后”（共4管）于10000rpm/min離心1min，棄上清，沉淀用15ul對應的buffer重懸，再加入15ulSDSloadingbuffer，沸水浴15min后，放于第八組臺面。第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三無細胞體系第二十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期六）四，Bradfordproteinassay1、標準曲線的制作（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1L。第三十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三管號1234567標準蛋白質(zhì)（ml）00.010.020.040.060.080.10蒸餾水（ml）0.10.090.080.060.040.020考馬斯亮藍G-250試劑（ml）5555555A595每加完一管立即在漩渦振蕩器上混合，2~5min后以1號為對照調(diào)零測A595以標準蛋白質(zhì)量（ug）為橫坐標，用吸光度A595為縱坐標作標曲注;震蕩過程中不要太劇烈，以免產(chǎn)生較多氣泡而無法消除第三十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三管號1234567HAZ和Fabz(ml）0.050.050.050.050.050.050.05蒸餾水（ml）0.050.050.050.050.050.050.05考馬斯亮藍G-250試劑（ml）5555555HAZA595FabzA595五，未知蛋白濃度的測定將保存的純化的蛋白各取50ul，加50ul蒸餾水后再加入5ml考馬斯亮藍G-250染液試劑，漩渦震蕩后靜止2~5min，以0.1ml水加5.0ml的G-250試劑調(diào)零，測其在595nm處的吸光度。第三十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期六）六，

配制SDS試劑分離膠（12%)濃縮膠(5%)ddH2O9.0ml5.0ml40%丙烯酰胺6ml1.0ml分離膠-buffer5.0ml不加濃縮膠-buffer不加2ml10%APS100μl60μlTEMED20μl20μl總體積20ml8ml每組配兩塊，均采用15孔梳子注：在配膠前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）與膠板厚度的一致性第三十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期三生化分離工程實驗（星期天）跑SDS點樣：所有的樣品和蛋白Marker點樣前都要沸水浴5分鐘使蛋白質(zhì)完全變性。一般的點樣量為10-20ul。(記錄點樣順序)點樣完畢后即可開始電泳，先以80伏電壓跑15-20分鐘，蛋白質(zhì)通過積層膠后