保健功效及檢測方法

一、多糖的檢測方法（1）粗多糖的苯酚-硫酸分光光度測定法（2）葡聚糖的分光光度測定法（3）硫酸軟骨素的分光光度測定法二、皂苷類化合物的檢測方法（1）總皂苷的分光光度測定法（2）絞股藍(lán)皂苷的分光度測定法三、黃酮及苷類化合物的檢測方法（1）總黃酮的風(fēng)光光度測定法（2）原花青素的分光光度測定法（3）原花青素的鐵鹽催化比色測定法四、酶、激素及內(nèi)源性物質(zhì)的檢測方法（1）超氧化物歧化酶的氮藍(lán)四唑測定法（2）超氧化物歧化酶的連苯三酚自氧化測定法（3）氯化高鐵血紅素的分光光度測定法五、其他類化合物的檢測方法（1）總蒽醌的分光光度測定法（2）幾丁胺糖的脫乙酰度滴定法（3）總?cè)频姆止夤舛葴y定法六、第一章概論(第3頁)表1-1常見的保健食品的功效成分（標(biāo)志性成分）、保健功能及主要來源功效成分（標(biāo)志性成分）保健功能主要來源黃酮類銀杏黃酮、山楂黃酮輔助降血脂、提高缺氧耐受力、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)腦神經(jīng)系統(tǒng)銀杏葉、山楂、蜂膠、葛根、沙棘、紅花、荷葉、甘草、桑葉、陳皮、花粉、桑葚、黃芪、淫羊藿、魚腥草多糖類靈芝多糖、香菇多糖緩解體力疲勞、增強(qiáng)免疫力、輔助降血糖、輔助降血脂靈芝、香菇、枸杞、銀耳、灰樹花、人參、西洋參、昆布、木耳、山藥、黃芪、茯苓、豬苓、黃精、苦瓜皂苷類紅景天苷、人參皂苷緩解體力疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗輻射、提高缺氧耐受力、輔助降血糖、保護(hù)心血管系統(tǒng)人參、西洋參、紅景天、絞股藍(lán)、三七、山藥、黃芪、酸棗仁、桔梗、遠(yuǎn)志、知母、甘草、大豆、蒺藜、太子參蒽醌類通便、美容、減肥、增強(qiáng)免疫力蘆薈、大黃、決明子、何首烏花青素抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)葡萄子、葡萄皮、越橘、黑加侖、玫瑰茄、甘藍(lán)、桑葚、紫甘薯、茶葉三萜類靈芝三萜、角鯊烯抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗輻射、緩解體力疲勞、輔助降血脂、輔助保護(hù)化學(xué)性肝損傷、改善睡眠、改善記憶靈芝、赤芝、紫芝（孢子粉）、甘草、黃芪、人參、澤瀉、積雪草、山楂、女貞子、苦丁茶、五味子、深海魚油（金槍魚、沙丁魚、鯊魚、鮭魚）殼聚糖（幾丁聚糖）增強(qiáng)免疫力、輔助降血脂、輔助降血糖、輔助保護(hù)骨粘膜蝦、蟹殼的提取物硫酸軟骨素輔助降血脂、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)骨關(guān)節(jié)、參與制造骨骼動物的軟骨（第73頁）第三章保健食品中功效成分的檢測方法第一節(jié)多糖的檢測方法粗多糖的苯酚—硫酸分光光度測定法方法提要多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，再與苯酚—硫酸作用成橙紅色化合物，其呈色度與溶液中的糖的濃度成正比，在485nm波長下比色定量。4、測定步驟樣品提?。悍Q取混合均勻的固體樣品1.0~2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，與沸水浴中加熱1小時（如保健食品添加的已是多糖提取物，則加熱15min），冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度線（V1）,混勻后過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀粗多糖。在這里必須強(qiáng)調(diào)的是不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相應(yīng)的處理，否則結(jié)果偏高。添加淀粉的樣品需加α-淀粉酶及糖化酶（如葡萄糖苷酶）處理。添加糊精的樣品需加糖化酶（如葡萄糖苷酶）處理。處理的原則是將這類非活性多糖的碳水化合物全部酶解成單糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需的活性多糖以達(dá)到分離的目的。添加淀粉或淀粉+糊精的樣品：可取50mL樣品提取液置于100mL具塞錐形瓶中，冷卻至60℃以下，加1mL10%淀粉酶液（Singma公司的液狀淀粉酶可直接加0.1~0.2mL）和0.5mL0.2M磷酸鹽緩沖液，加塞，至55℃~60℃萄糖及2倍量得淀粉、糊精，不影響樣品中粗多糖的測定結(jié)果。但在測定過程中應(yīng)避免糖和其他碳水化合物的污染，因為苯酚—硫酸與糖和碳水化合物起反應(yīng)。某些保健食品中功效成分為醇溶性多糖，可參照本方法進(jìn)行測定，但樣品預(yù)處理時將乙醇改為丙酮即可。液體樣品中粗多糖含量低時，可取樣50.0mL加熱濃縮至5.0mL后，再依法操作測定。洗滌粗多糖沉淀時，一定要將離心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗凈，否則結(jié)果偏高。8、關(guān)于保健食品粗多糖測定方法分光光度法的說明多糖因單體組成、結(jié)構(gòu)、聚合度、物化性質(zhì)等各異，故測定方法不同，此法適用于測定高分子量的糖類物質(zhì)（>10000Da）多糖的定義是聚合度大于9的糖（第110頁）十一、硫酸軟骨素的分光光度測定法本方法硫酸軟骨素的檢出限為0,01mg/L。方法提要結(jié)晶紫是一種陽離子染料，在酸性條件下帶正電荷，易與帶酸性基團(tuán)的生物大分子發(fā)生靜電作用而形成離子配合物，已用于脫氧核糖核酸、干擾素等的分光光度法分析。結(jié)晶紫結(jié)構(gòu)中的氨基帶正電荷，硫酸軟骨素的磺酸基和羧基帶負(fù)電荷，兩者通過靜電引力和輸水作用力形成絡(luò)合物，產(chǎn)生變色效應(yīng)，吸光度降低。吸光度的降低量與硫酸軟骨素含量線性相關(guān)。4、測定步驟（1）樣品處理：精密稱取內(nèi)容物25mg，置于100mL量瓶中，加水適量，超聲處理10min，加水定容至100mL,過濾，取續(xù)濾液4mL,置于100mL量瓶中，加水至刻度，得樣品溶液。（2）分光光度法測定：取供試品溶液1mL，置于10mL具塞刻度試管中，加入pH5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液1.0mL和結(jié)晶紫并粗三溶液0.6mL，加水至10.0mL，搖勻，30℃水浴保溫20min,放至室溫。以水為參比，于588nm6注釋硫酸軟骨素是提取于動物軟骨的黏多糖類物質(zhì)，在心血管疾病、關(guān)節(jié)病的防治等方面具有重要作用。硫酸軟骨素除了作為藥用品外，大量的是作為改善關(guān)節(jié)病的補(bǔ)充品，作為健康食品應(yīng)用，在美國已經(jīng)風(fēng)行多年，經(jīng)過多年的應(yīng)用，已經(jīng)證明硫酸軟骨素對改善老年退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的效果。（第113頁）第二節(jié)皂苷類化合物的測定方法總皂苷的分光光度測定法方法提要樣品中總皂苷經(jīng)提取、PT—大孔吸附樹脂柱預(yù)分離后，在酸性條件下，香草醛與人參皂苷生成有色化合物，以人參皂苷Re為對照品，于560nm處比色測定。4、測定步驟（1）樣品處理1）固體樣品：稱取1.0g左右樣品置于100mL燒杯中，加入20~40mL85%乙醇，超聲波振蕩30min，再定容至50mL,搖勻，放置，吸取上清液1.0mL,揮干后以水溶解殘渣，進(jìn)行柱分離。2)液體樣品：含乙醇的酒類樣品：準(zhǔn)確吸取1.0mL樣品放于蒸發(fā)皿中，蒸干，用水溶解殘渣，用此液進(jìn)行柱層析。非乙醇類液體樣品：準(zhǔn)確吸取1.0mL樣品（如濃度高或顏色深，需稀釋一定體積后再取1.0mL）,直接進(jìn)行柱分離。（2）柱層析：以PT—大孔吸附樹脂柱進(jìn)行層析分離，準(zhǔn)確吸取上述已處理好的樣品溶液1.0mL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性雜質(zhì)，棄去洗脫液，再用20mL85%乙醇洗脫總皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干，以此作顯色用。（3）顯色：在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入0.2mL5%香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿，使殘渣溶解，再加入0.8mL高氯酸，混勻后移入10mL比色管中，塞緊蓋子，于60℃以下水浴加溫15min取出，冷卻后準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0mL，搖勻后以1.0cm比色皿與560nm處與人參皂苷Re（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：人參總皂苷濃度在40~200μg/mL之間與吸光度值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）0.999.6、注釋回收率：90%~105%。（第122頁）第三節(jié)黃酮類及苷類化合物的檢測方法總黃酮的分光光度測定法本方法總黃酮檢出限為3.5μg/mL。方法提要黃酮類化合物是具有苯駢吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，一般都具有4位羰基，且呈黃色。黃酮類化合物多分布于植物中，大多數(shù)以苷的形式存在。黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基或5-羥基或鄰二位酚羥基與鋁鹽進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物。4、測定步驟（1）樣品處理1）固體樣品：稱取1~2g干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于平底燒瓶中加入50~100mL70%乙醇溶液，浸潤后，在80℃水浴下回流2h，至黃酮類化合物基本提取完全。粗提取液冷卻后，減壓抽濾，并用少量70%乙醇溶液洗滌殘渣，合并濾液。在50℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至燒瓶內(nèi)溶液呈無醇味。倒數(shù)燒瓶內(nèi)溶液，并用30mL熱水分3次洗滌燒瓶，抽濾后，將濾液導(dǎo)入分液漏斗中，以75mL氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集下層水溶液并定容至稱取1~2g經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹脂粉末，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液1~2mL，沿層析柱慢慢滴入柱內(nèi)，放置一定時間，待測液被充分吸附后，用70%乙醇或甲醇洗脫，流速為1.0mL/min,至流出液基本無色，一般收集10mL即可。上述洗出液用洗脫劑（70%乙醇或甲醇）定容后即可用于測定。2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品3.0mL，定容至50mL后，直接以75mL氯仿分3次萃取脫脂，其余步驟同上。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL（相當(dāng)于蘆丁0μg、75μg、150μg、300μg、450μg、600μg），分別移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇液至5mL,各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振搖后放置5min，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻后放置60min，加1.0mol/L氫氧化鈉溶液2mL,用30%乙醇定容至刻度，以零管為空白，搖勻后用1cm的比色皿，在510nm處測定吸光度，繪制蘆丁含量（μg）與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）樣品測定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟與510nm處進(jìn)行吸光度的測定（樣品如有沉淀，應(yīng)過濾后測定）。蘆丁濃度在0.0075~0.060mg/mL范圍內(nèi)呈直線關(guān)系。6、注釋（1）方法精密度：對同一樣品在相同條件下，重復(fù)測定6次，其相對標(biāo)準(zhǔn)差為4.4%。（2）方法回收率：對總黃酮含量為1.52%的減肥茶加入相似濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗，其平均回收率為103.2%。（3）對于以葡萄、山楂等有色水果味原料的樣品，可用未加鋁鹽試劑的樣液為空白或采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測定，以避免樣液顏色對測定干擾而引起結(jié)果偏高。（第131頁）六、原花青素的分光光度測定法本法適用于各種植物組織、器官及其制劑（如葡萄子與松樹皮提取物）中原花青素含量的測定。方法提要原花青素（也稱縮合單寧）是黃烷—3—醇的寡聚體與多聚體，屬多份類化合物。與其他酚類化合物不同，黃烷醇（縮合單寧、單體、雙體等）在酸性介質(zhì)中可與香草醛反應(yīng)，生成在500nm處有最大吸收的有色物質(zhì)，可通過比色測其含量。如無提純的原花青素，可用兒茶素代替4、測定步驟（1）樣品中原花青素液的制備：植物材料經(jīng)4倍體積丙酮+水（7+3，體積比）或者經(jīng)60%甲醇提取，40℃冰凍干燥的固體原青花素制劑，直接溶于水中（先加少量甲醇助溶），制成原青花素液。原青花素液與5℃（2）樣品測定：用錫箔將試管（14mm*120mm）包裹嚴(yán)，僅留試管口用于加樣。向管內(nèi)加入試樣0.5mL，再加3.0mL4%香草醛甲醇液混合，然后加入1,5mL濃鹽酸，徹底混勻，室溫下顯色15min，也可在暗環(huán)境下進(jìn)行以上操作。最后在500nm處比色。（0.1mg原花青素在500nm處的吸收值為0,55）6、注釋（1）本方法的檢測范圍為（5~500）*10-3mg/0.5mL樣液。精密度與準(zhǔn)確度大于1*10-3mg。（2）反應(yīng)試管應(yīng)用清潔劑浸泡24小時，徹底洗滌干凈。（3）進(jìn)行比色時，用水作空白對照。（4）500nm處的OD值應(yīng)控制在3以下。（5）試樣中花青素含量較高時，應(yīng)從香草醛存在下所測A500nm值中減去無香草醛時所測值。（6）顯色液應(yīng)避光放置。（第133頁）七、花青素的鐵鹽催化比色測定法方法提要原花青素氧化后能生成紅色的花青素。通常用鐵鹽催化比色法測定總量，利用硫酸高鐵銨的催化作用，以鹽（OD550）,與原花青素化學(xué)對照品比較，便可定量計算出樣品中原花青素的含量。4、測定步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別移取上述不同濃度系列使用液1.00mL置于10mL刻度試管中，加入9mL上述反應(yīng)混合液，置于沸水與中加熱，待水浴溫度恢復(fù)至（99+1）℃時開始計時，并塞緊塞子（勿搖勻），準(zhǔn)確加熱40min后，立即取出，用冰水快速冷卻至室溫，以正丁醇定容至刻度線，塞緊后充分搖勻，在550nm處以空白管調(diào)零扣除背景，測定吸光度值OD550，并以最小二乘法繪制原青花素濃度（μg）—吸光值OD550曲線。（2）待測樣品液的制備：準(zhǔn)確稱取膠囊內(nèi)容物0.5~1.0g，加污水乙醇（遇醇溶性較差的樣品，可加入少量的蒸餾水促進(jìn)溶解），溶解（對于軟膠囊取整粒稱重后再用小刀割破，用超聲波以乙醇多次提?。?定容至100mL,搖勻，即得到樣品儲備液。再移取0.5~1mL儲備液（根據(jù)提取物濃度高低確定具體的量，使待測液原花青素濃度在0.05~0.20mg/mL范圍內(nèi)）定容至50mL,搖勻得到待測樣品液。（3）樣品測定：移取1.00mL待測液依照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同樣操作，測定OD550，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算原花青素的含量。6注釋線性范圍：本法原花青素濃度在26.00~416.0μg范圍內(nèi)，最低檢出限為4μg。準(zhǔn)確性：添加濃度為52.00~208.0μg的標(biāo)準(zhǔn)（OD550在0.157~0.520范圍內(nèi)），3次測定平均回收率在90.64%~109.5%。精密度（重現(xiàn)性）：同一樣品液8次測定，相對標(biāo)準(zhǔn)差為2.13%~2.98%。干擾物質(zhì)：常見的維生素，蘆丁、類胡蘿卜素、食品抗氧化劑、各類油脂基體未見明顯干擾，由于多糖、蛋白質(zhì)不溶于無水乙醇，故不會干擾測定。（第151頁）第四節(jié)酶、激素及內(nèi)源性物質(zhì)的檢測方法七、氯化高鐵血紅素的分光光度測定法本方法氯化高鐵血紅素的最低檢出濃度為0.15μg/mL。方法提要氯化高鐵血紅素是以新鮮豬血經(jīng)冰醋酸法提取加工而成的動物性補(bǔ)鐵劑，能被人體黏膜上皮細(xì)胞分解為原卟啉及二價鐵，從而進(jìn)入血液被機(jī)體吸收和利用。氯化高鐵血紅素制品以氫氧化鈉溶液溶解和定容后，以1cm比色皿于波長385nm處進(jìn)行檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定量。4、測定步驟（1）樣品處理1）固體樣品（膠囊或片劑）：準(zhǔn)確稱取一定量樣品，一邊研磨，一邊加入0.1mol/L氫氧化鈉，使氯化高鐵血紅素充分溶解（注意不能加熱溶解，否則引起結(jié)果偏高），定容后備檢測。2）液體樣品：搖勻后準(zhǔn)確吸取一定量樣品，用0.1mol/L氫氧化鈉稀釋后待測定。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的氯化高鐵血紅素標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用0.1mol/L氫氧化鈉充分溶解并定容至100mL,容量瓶中。吸取此儲備液10mL，加于100mL容量瓶中，加入0.1mol/L氫氧化鈉定容至刻度，搖勻，配成10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL至10mL比色刻度試管中，加0.1mol/L氫氧化鈉至刻度，以零管作空白調(diào)零，于385nm處測定吸光度，并繪制氯化高鐵血紅素含量—氯化高鐵血紅素濃度在1.2~7.0μg/mL范圍內(nèi)吸光度與濃度呈直線關(guān)系（3）樣品測定：取上述樣品處理液依照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟測定385nm處的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得氯化高鐵血紅素含量。（第201頁）第九節(jié)、其他化合物的檢測方法四、總蒽醌的分光光度測定法1、方法提要蒽醌類化合物經(jīng)酸水解用氯仿提取后，再用稀堿液萃取，與1,8二羥基蒽醌對照品比較，在分光光度計530nm處比色定量。4、測定步驟（1）樣品處理：準(zhǔn)確稱取均勻的樣品粉末0.5~2g或適量，液體樣品可取10mL左右（視含量而定），置于200mL帶冷凝管的錐形瓶中，加5mol/L硫酸40mL，加熱回流水解2小時，稍冷后加氯仿30mL，水浴加熱回流1小時，分離出氯仿液，再加氯仿30mL，加熱回流水解30min，分離出氯仿液，再加氯仿20mL，如此反復(fù)，提取至氯仿無色位置，收集氯仿提取液過濾，將濾液移至容量瓶中，用氯仿定容至刻度（V1）,搖勻，精密吸取一定量（10mL左右）（V2）置分液漏斗中，用混合堿液（每次5mL）萃取至無色，將萃取液移至50mL量瓶中，用混合堿液調(diào)至刻度。6、注釋（1）總蒽醌包括游離蒽醌和結(jié)合蒽醌，游離蒽醌測定，樣品直接用氯仿提取至無色，再用混合堿液多次萃取氯仿提取液制得供試品溶液，而結(jié)合蒽醌測定系先用5mol/L的硫酸水解，再用氯仿提取，再用混合堿液多次萃取氯仿提取液質(zhì)的供試品溶液。（2）本方法線性范圍為0.116~0.580mg/mL（3）本方法的平均回收率為97.0%（n=3）。（4）精密度RSD=1.2%（n=5）。（5）比色時注意比色液中是否混有氯仿微粒的干擾，而影響測定結(jié)果。（第224頁）十四、幾丁胺醣的脫乙酰度滴定法方法提要幾丁胺醣又稱殼聚糖、脫乙酰甲殼素、甲殼胺，由甲殼素在80℃~120℃下經(jīng)強(qiáng)堿長時間脫去乙?；玫?，化學(xué)名稱為（1,4）-2-氨基-2-脫氧-β4、測定步驟準(zhǔn)確稱取0.25g幾丁胺醣樣品，置于100mL燒杯中，加入0.1mol/L鹽酸40mL，在室溫下用平頭玻棒搗碎試樣，并攪拌使其充分溶解，放置2小時，加一滴0.1%甲基橙作指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉滴定至紅色剛好消失，保持1min，計算消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。注：平行測定結(jié)果不大于0.2%，計算結(jié)果精確至小數(shù)點(diǎn)后一位。（第231頁）十八、總?cè)频姆止夤舛葴y定法本方法適用于靈芝制品（靈芝孢子粉、靈芝孢子油）中總?cè)坪繙y定。方法提要靈芝孢子中含有一百二十多種三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，要分離獲得高純度具有代表性的三萜化合物對照品技術(shù)難度大，因此，對于總?cè)苹衔锖康某Ｒ?guī)測定方法，目前仍以在自然界廣泛存在的三萜化合物熊果酸為對照品，以分光光度法測定。由于熊果酸與三萜類化合物的分子結(jié)構(gòu)中均有相似的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，在特定的顯色劑作用下，在548nm處顯示相同的吸收特征，本法測得的含量實(shí)際為總?cè)苹?/p>