血細(xì)胞分析儀維修與開發(fā)技術(shù)

血細(xì)胞分析儀維修與開發(fā)技術(shù)1第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四血液是維持人體正常生理活動的重要物質(zhì)，它向全身各組織供應(yīng)氧氣，調(diào)節(jié)各器官的生理活動，抵御有害物質(zhì)和病菌的侵害，常稱為“生命之河”。人類生理和病理的變化，往往會引起血液組份的變化，可為醫(yī)生提供診斷與治療疾病的重要依據(jù)。血細(xì)胞計數(shù)與分析就是了解血液組份的一種方法，它已成為各級醫(yī)院進(jìn)行血液常規(guī)檢驗的必做項目之一。2第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四1、血液的組成、特點及血細(xì)胞計數(shù)參數(shù)血液由血漿和血細(xì)胞組成，血漿是血液的液體部分，除了水分之外，還有許多化學(xué)物質(zhì)。血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中紅細(xì)胞的數(shù)量最多。血漿的基本組成如下表3第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四人類生理或病理的變化與血液組份的變化息息相關(guān)，及時了解血液組份的變化，可為疾病的診斷、治療提供重要依據(jù)。血液由血細(xì)胞和血漿組成，血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中血細(xì)胞計數(shù)是指計數(shù)單位容積中紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的數(shù)量，是了解血液組份的方法之一。所謂血細(xì)胞計數(shù)主要是指計數(shù)單位容積中紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的個數(shù)。紅細(xì)胞在人體內(nèi)的主要功能是攜帶氧氣和部分二氧化碳，參與人體的氣體交換。紅細(xì)胞的數(shù)量最多，4第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四成人男子紅細(xì)胞的個數(shù)為舊制4.2×6.2×106個/μl，新制4.2×6.2×1012個/L；成人女子紅細(xì)胞的個數(shù)為舊制4.2×5.4×106個/μl，新制4.2×5.4×1012個/L；紅細(xì)胞的直徑在6－9μm之間，平均為7.2μm血紅蛋白存在于紅細(xì)胞內(nèi)，是紅細(xì)胞的主要成分，其功能是結(jié)合氧氣或部分二氧化碳，正常參考值成年男性為：120一160g／L，成年女性為：110－150g／L。5第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四白細(xì)胞：被成為人體衛(wèi)士，它可以防止外來微生物的侵害及其他感染。白細(xì)胞分5類：中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。正常人的白細(xì)胞數(shù)目為舊制4.0×10.0×103個/μl，新制4.0×10.0×109個/L；血小板有凝血和止血的功能。正常人的血小板數(shù)目為舊制1.0×3.0×105個/μl，新制1.0×3.0×1011個/L；平均直徑2－3μm。6第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四機(jī)體的某些病變，可通過血細(xì)胞計數(shù)反映出來。如貧血時，紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白濃度會低于正常參考值；化膿感染、急性炎癥、組織壞死、腫瘤、急性失血時白細(xì)胞計數(shù)會高于正常參考值；病毒感染、某些藥物或經(jīng)常接觸放射性物質(zhì)會使白細(xì)胞計數(shù)低于正常參考值。又如，血小板低于（20－50）×109／L會引起出血性疾病，而大于1.0×1012／L又易形成血栓?？傊嫈?shù)血細(xì)胞顯得非常重要，臨床上稱之為血液常規(guī)。7第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四傳統(tǒng)的人工計數(shù)是將血液稀釋后滴在血細(xì)胞計數(shù)盤，在顯微鏡下肉眼觀察。這種方法效率低，計數(shù)精度低，誤差因人而異，通常在（5－10％）之間。隨著檢驗工作量的增加和對精度要求的提高，這種傳統(tǒng)方法遠(yuǎn)不能滿足實際工作需要。50年代，隨電子工業(yè)和計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞計數(shù)器便應(yīng)運(yùn)而生，細(xì)胞計數(shù)器是實現(xiàn)細(xì)胞計數(shù)的一種儀器。初期的計數(shù)器只計數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞，稱細(xì)胞計數(shù)器（CellCounter），后來增加了一個光電比色系統(tǒng)測定血紅蛋白。8第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四隨著電子計算機(jī)的普及、發(fā)展和應(yīng)用，細(xì)胞計數(shù)器的分辨能力進(jìn)一步提高，除了紅細(xì)胞、白細(xì)胞計數(shù)外還可以對血小板進(jìn)行計數(shù)，還能計算出紅細(xì)胞指數(shù)，共可得到8個參數(shù)，稱全血計數(shù)（Completebloodcount,CBC）。隨著特殊溶血劑的應(yīng)用，能將白細(xì)胞按體積分為2－3分群，即淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和中間細(xì)胞群。這樣，細(xì)胞計數(shù)檢測的項目可多達(dá)18項，甚至在實現(xiàn)白細(xì)胞五分類后，細(xì)胞分析的參數(shù)多達(dá)20多項，由以前簡單的細(xì)胞計數(shù)器成為名符其實的血細(xì)胞分析儀（hematologyanalyzer）。9第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四近年隨著激光技術(shù)的應(yīng)用，令血細(xì)胞分析的工作原理從單純的電阻法得到突破性的進(jìn)展，出現(xiàn)了能進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)測量的流式細(xì)胞儀，它可測量細(xì)胞多項生化成分，如核酸、蛋白質(zhì)、膜成分、酶活性等等，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用。2、細(xì)胞計數(shù)器人們研究血細(xì)胞的計數(shù)問題時，其計數(shù)原理曾采用過變阻脈沖法、光電計數(shù)法、激光計數(shù)法等，10第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四現(xiàn)在，因前者簡單實用而被普及。儀器測量的細(xì)胞數(shù)量比手工方法在顯微鏡下測量的細(xì)胞數(shù)量要多約100倍，統(tǒng)計誤差減少了約90％，提高了計數(shù)的精確度。3、變阻脈沖法原理1．變阻脈沖法血細(xì)胞計數(shù)原理變阻脈沖法血細(xì)胞計數(shù)原理簡稱電阻法原理，是美國科學(xué)家?guī)鞝柼兀╓．H．Coulter）1947年首先提出來的，故又稱庫爾特原理。電阻法計數(shù)在大多數(shù)細(xì)胞計數(shù)器中是利用小孔管換能器裝置來實現(xiàn)的，如圖1-1所示11第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四12第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四小孔管是在一塊25—50μm厚的紅寶石或藍(lán)寶石上打一小孔，然后將其粘接在一支玻璃管上而制成。小孔直徑多為100μm或75μm，單獨用來測試血小板的小孔管，其孔徑還要再細(xì)些。小孔多位于管底的側(cè)面，所能測試的顆粒大小為小孔直徑的2％－40％。這樣，100μm的小孔可以測2－40μm大小的顆粒。小孔管內(nèi)外各置一根鉑金電極，兩電極間施加一個恒定的電流。當(dāng)小孔管里加入電解液，并將其置入裝有相同電解液的樣品杯中時，兩電極之間便產(chǎn)生一個恒定的電流。13第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四測試時，先將待測血液用潔凈的電解液充分稀釋，使血細(xì)胞在電解液中成為游散狀態(tài)，然后在小孔管上端加上負(fù)壓，在負(fù)壓的抽吸下，混有血細(xì)胞的電解液便被均勻地抽進(jìn)小孔管。血細(xì)胞為電的不良導(dǎo)體，當(dāng)它通過小孔的瞬間，取代了同體積的電解液，從而改變了2個電極之間的電阻，如圖1－2為單個細(xì)胞通過小孔時引起電路中電阻變化的情況。14第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四15第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四在電流恒定的情況下，電阻的改變會引起電壓的變化。在前一個血細(xì)胞通過小孔，下一個血細(xì)胞還未靠近小孔時，電極間的電阻又恢復(fù)正常。這樣血細(xì)胞連續(xù)地通過小孔，就在電極的兩端產(chǎn)生一連串電壓脈沖，脈沖的個數(shù)與通過的細(xì)胞個數(shù)相當(dāng)。體積不同的細(xì)胞其電阻率不同，產(chǎn)生脈沖的大小也不同，幅度與細(xì)胞體積成正比，如圖1－3給出不同體積細(xì)胞通過小孔時產(chǎn)生的電壓脈沖。將這些脈沖加以放大、鑒別、整形以后送到計數(shù)電路計數(shù)，便可計得細(xì)胞的個數(shù)。16第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四17第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四2．血細(xì)胞的分別計數(shù)原理細(xì)胞的分別計數(shù)是指分類計數(shù)各種血細(xì)胞，血液中各種細(xì)胞的體積是不同的，白細(xì)胞體積范圍在120－1000μm3，紅細(xì)胞在85－95μm3，血小板在2－30μm3，血細(xì)胞的分別計數(shù)便是利用它們的體積及數(shù)量的不同。由前述可知，體積不同的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板，其產(chǎn)生的脈沖幅度也不同，排列順序以白細(xì)胞最大，紅細(xì)胞次之，血小板最小。在計數(shù)紅、白細(xì)胞時，可利用一個幅度鑒別電路將血小板篩選掉，這個鑒別電路叫閾值選擇電路。如圖1－4所示，閾值電壓選擇在U1時，只有紅、白細(xì)胞產(chǎn)生的脈沖參與計數(shù)；閾值電壓選在U2時，血小板產(chǎn)生的電壓脈沖才能參加計數(shù)；最下面的小信號為干擾脈沖。18第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四19第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（1）紅細(xì)胞計數(shù)：正常人體外周血紅細(xì)胞的數(shù)目為白細(xì)胞的1000倍左右，當(dāng)閾值電壓選在U1時，白細(xì)胞產(chǎn)生的脈沖個數(shù)較紅細(xì)胞產(chǎn)生的脈沖個數(shù)少得多，幾乎可以完全忽略，紅、白細(xì)胞數(shù)可視為紅細(xì)胞數(shù)。（2）血小板計數(shù)：將閾值電壓選在U2時，可以去掉干擾計數(shù)，并計出紅、白細(xì)胞和血小板的總數(shù)。最后從總數(shù)中減去紅、白細(xì)胞數(shù)，即為血小板數(shù)。20第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（3）白細(xì)胞計數(shù)：在計數(shù)白細(xì)胞時，先在稀釋血液中加入一種溶血劑，使紅細(xì)胞溶解破碎，其碎片體積分散到不影響白細(xì)胞計數(shù)的程度，紅細(xì)胞破碎后，將閾值電壓選在U1，再對剩下的白細(xì)胞產(chǎn)生的脈沖個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，便可以求得白細(xì)胞數(shù)。紅細(xì)胞破碎溶解后，其內(nèi)部的血紅蛋白便釋放出來，與溶血劑中的轉(zhuǎn)化劑反應(yīng)進(jìn)而轉(zhuǎn)化為顏色穩(wěn)定的氰化血紅蛋白，通過光電比色法可求出血紅蛋白的含量。21第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四3、細(xì)胞直方圖與白細(xì)胞分類目前三分類以上細(xì)胞計數(shù)器均在給出各細(xì)胞參數(shù)的數(shù)據(jù)結(jié)果時，同時提供3種細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板）的細(xì)胞體積分布圖。并以體積為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞的相對數(shù)量為縱坐標(biāo)，把細(xì)胞在一個個很小的體積范圍（又稱通道、頻道）內(nèi)的數(shù)量分布情況表達(dá)出來，我們稱之為直方圖（histogram）。通過細(xì)胞直方圖我們可形象直觀地獲得細(xì)胞體積分布的特征，另外白細(xì)胞直方圖尚可用于白細(xì)胞亞群的分類。直方圖是由測量通過感應(yīng)區(qū)的每個細(xì)胞脈沖積累得到的，在計數(shù)的同時進(jìn)行分析測量，如圖1－5為典型紅、白細(xì)胞及血小板直方圖。22第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四23第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四24第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四25第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四直方圖的X軸以fl為體積單位，其數(shù)值設(shè)定與該細(xì)胞的大小有關(guān)，以血小板的設(shè)定最小，白細(xì)胞最大。Y軸以細(xì)胞相對數(shù)量為單位，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過少而引起直方圖曲線偏低時，計數(shù)器會自動在Y軸方向按比例放大、抬高曲線。（1）紅細(xì)胞直方圖：紅細(xì)胞直方圖如圖1－5a，體積分布曲線的顯示范圍從24－360fl，計數(shù)器把大于36fl的顆粒計數(shù)為紅細(xì)胞，可得到2個細(xì)胞群體：紅細(xì)胞主群，從50fl偏上開始有一個呈正態(tài)分布曲線，又稱“主峰”；小細(xì)胞群，位主群右側(cè)，又稱“足趾部”，是一些多聚體細(xì)胞、白細(xì)胞、小孔殘留物等。26第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（2）血小板直方圖：血小板直方圖如圖1－5b，典型血小板直方圖呈對數(shù)正態(tài)分布，顯示范圍0－36fl，計數(shù)范圍為2－20fl（3）白細(xì)胞直方圖與白細(xì)胞分類：如圖1－5C，白細(xì)胞體積分布曲線的顯示范圍是30－450fl。如前述，白細(xì)胞計數(shù)時先加溶血劑將紅細(xì)胞溶解后再計數(shù)，溶血劑不僅破壞紅細(xì)胞，還作用于白細(xì)胞，使其膜表面產(chǎn)生小孔，致細(xì)胞失水皺縮，此時細(xì)胞大小實際上是細(xì)胞核與胞漿中顆粒成分之和。經(jīng)過溶血劑的化學(xué)處理，各群白細(xì)胞體積有所改變27第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四，大小大致為：淋巴細(xì)胞＜單核細(xì)胞＜粒細(xì)胞。在直方圖上表現(xiàn)為3個白細(xì)胞亞群：35－90fl范圍的淋巴細(xì)胞群（LY），可以包括淋巴細(xì)胞；91－160fl范圍的單核細(xì)胞群（MO），可以包括單核細(xì)胞、幼稚細(xì)胞；161—450fl范圍的粒細(xì)胞群（GR），可以包括嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。計數(shù)器根據(jù)3個體積范圍內(nèi)的顆粒數(shù)與總顆粒數(shù)之比例，便可計算出白細(xì)胞三分類，即：LY（％）=（35－90fl范圍的顆粒數(shù)）／（3—450fl范圍的顆粒數(shù)），MO（％）=（91—160fl范圍的顆粒數(shù)）／（3—450fl范圍的顆粒數(shù)），GR（％）=（161～450fl范圍的顆粒數(shù)）／（3－450fl范圍的顆粒數(shù)），28第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四這種分類方法叫直方圖分類法。計數(shù)器直方圖分類與人工染色顯微鏡分類比較，相關(guān)系數(shù)為：LY＞0.9，MO=0.7，GR＞0.9，正常細(xì)胞分類的可信度達(dá)95％，不需人工復(fù)查。白細(xì)胞直方圖除顯示分類外，還顯示4個報警區(qū)域，如果某個報警區(qū)域里的計數(shù)值異常增多，就在此區(qū)域出現(xiàn)“R”報警：R1為直方圖上淋巴峰左側(cè)區(qū)域有異常，可能有血小板凝塊、巨大血小板、有核紅細(xì)胞、不溶性紅細(xì)胞和冷凝集素等因素的影響；R2為直方圖上淋巴峰和單核峰之間的區(qū)域有異常，可能有異型淋巴細(xì)胞、幼稚淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞或嗜堿性細(xì)胞等因素的影響；29第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四R3為直方圖上單核峰和中性粒峰之間的區(qū)域有異常，可能有不成熟粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等因素的影響；R4為直方圖上中性粒峰右側(cè)區(qū)域有異常，粒細(xì)胞數(shù)量過多；RM為以上區(qū)域2個或2個以上同時有異常。分類報警的實驗前因素有：試劑污染、試劑不配套、樣品沒有混勻、血樣存放時間太長和電噪聲等。4、定量原理定量裝置是為了對一定容積的血細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)而設(shè)計的，可確保被計量樣品液容積的精度。30第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四4、定量原理定量裝置是為了對一定容積的血細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)而設(shè)計的，可確保被計量樣品液容積的精度。（1）定量裝置分類：定量裝置可分為有水銀壓力計式和無水銀的光電檢測式2種。前者系早期產(chǎn)品，由于水銀的揮發(fā)性和毒性，使用不當(dāng)易造成污染和公害。80年代后逐漸采用光電檢測式定量裝置。光電檢測式定量裝置常用的有多種形式，圖1－6是其中的一種31第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四32第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四計數(shù)時，樣品液在負(fù)壓吸引下通過小孔進(jìn)入小孔管。當(dāng)液面沿管路上升到P3點時，彎曲的液面使發(fā)光管發(fā)出的光線折射，電檢測器便產(chǎn)生一個脈沖信號去控制電路令計數(shù)開始；當(dāng)液面上升到P1點時，又產(chǎn)生一個脈沖信號令計數(shù)停止。P1和P3之間的容量便等于進(jìn)入小孔管被計數(shù)的樣品液容量。（2）定量裝置中的特殊部件：定量裝置中的特殊部件主要有負(fù)壓泵、壓力調(diào)節(jié)器和廢液瓶。33第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四負(fù)壓泵：是管路系統(tǒng)中的動力部件，樣品液、電解液、清洗液等均靠負(fù)壓抽吸流動。在計數(shù)時，尤其要求穩(wěn)定而適當(dāng)?shù)呢?fù)壓以避免計數(shù)誤差。負(fù)壓泵常以電磁感應(yīng)原理為設(shè)計基礎(chǔ)，故又稱為電磁泵。結(jié)構(gòu)有多種種形式。圖1－7是其中的一種34第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四35第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四圖1-7它由電磁鐵、永久磁鐵、氣囊等組成。波紋管的左端有一塊永久磁鐵，永久磁鐵左邊是電磁鐵。當(dāng)電磁鐵的極性與永久磁鐵的極性相反時，便對永久磁鐵產(chǎn)生吸力，即將永久磁鐵吸引過去。永久磁鐵帶動波紋管舒張，使得進(jìn)氣閥打開，排氣閥門關(guān)閉，波紋管向氣囊內(nèi)抽氣。當(dāng)電磁鐵的極性和永久磁鐵的極性相同時，在電磁鐵的排斥和波紋管本身收縮力作用下，氣囊壓縮，使排氣閥門打開，進(jìn)氣閥門關(guān)閉，抽進(jìn)氣囊里的氣體被排出去。36第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四由以上工作原理可知，當(dāng)抽氣口接負(fù)壓瓶時，便可以組成負(fù)壓泵；當(dāng)排氣口接壓力瓶時，它便成為正壓泵。壓力調(diào)節(jié)器各種細(xì)胞計數(shù)器所需要的最佳負(fù)壓范圍有所不同，即使同一臺儀器因使用環(huán)境不同，管路狀況不同也可能造成負(fù)壓偏離，因此需要負(fù)壓調(diào)節(jié)器給予一定的調(diào)節(jié)。常見的負(fù)壓調(diào)節(jié)器有手動和自動式2種。自動式壓力調(diào)節(jié)器之一的工作原理如圖1－8所示。37第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四38第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四1只壓敏電阻和一只可調(diào)電阻與2只普通電阻構(gòu)成橋式電路的4只臂，其中壓敏電阻與負(fù)壓相通作為工作臂，可調(diào)電阻用以調(diào)節(jié)負(fù)壓的大小。當(dāng)電橋平衡時R1/R2=R3/R4，橋路不輸出信號（即輸出為零電平）。當(dāng)負(fù)壓變化時，R1的阻值發(fā)生變化，橋路失衡，將有信號輸出。這個信號可正可負(fù)，接到控制電路后便將負(fù)壓控制在額定范圍之內(nèi)。廢液瓶廢液瓶的作用有3，一是使負(fù)壓泵產(chǎn)生的壓力通過它作用到小孔管內(nèi)的液體上；二是對負(fù)壓泵產(chǎn)生的負(fù)壓有緩沖作用；三是存貯廢液，不讓廢液進(jìn)人負(fù)壓泵。如圖1－9所示。39第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四40第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四廢液瓶可用玻璃或塑料制成，瓶蓋和瓶體需緊密接觸，因為廢液瓶是負(fù)壓的容器，氣密不良便不能正常工作。瓶蓋上有2根管子，分別連接定量管和負(fù)壓泵。瓶蓋上還設(shè)計了廢液報警裝置。當(dāng)廢液將滿時，浮動開關(guān)上浮，驅(qū)動報警信號燈閃爍。當(dāng)廢液報警時，操作者必須及時將廢液倒掉，否則將可能損壞泵體。有的機(jī)器具有自鎖功能，即廢液瓶將滿時不但發(fā)出警告信號，而且鎖住機(jī)器不能進(jìn)行任何操作。41第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四5、計數(shù)器上的一些重要技術(shù)為保證計數(shù)的準(zhǔn)確性，許多計數(shù)器應(yīng)用了以下重要技術(shù)。（1）燃燒電路：該電路能灼燒小孔，自動清潔屯積在計數(shù)孔的蛋白質(zhì)，防止計數(shù)孔堵塞。（2）重合損失補(bǔ)償：細(xì)胞計數(shù)時，理想狀態(tài)是讓細(xì)胞一個個地通過寶石微孔。但是紅細(xì)胞直徑平均為7－10μm，白細(xì)胞直徑平均為25μm左右，而微孔直徑有75-100μm。實際計數(shù)時會有2個或2個以上的細(xì)胞重疊一起進(jìn)入小孔“感應(yīng)區(qū)”，這種情況產(chǎn)生的脈沖幅度會比單個細(xì)胞要高，但只能產(chǎn)生一個信號脈沖，使計數(shù)有所丟失，也即計數(shù)假性降低而體積會假性升高，這種現(xiàn)象稱為重合損失。42第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四出現(xiàn)重疊的概率與細(xì)胞濃度、液體流速和孔徑有關(guān)，為了彌補(bǔ)這種損失，電路中設(shè)有重合校正電路或用軟件校正。通常是按伯桑（Poisson）分布規(guī)率加以校正，校正規(guī)律是：計數(shù)值在8000一下不校正，計數(shù)值在8000－38000時，每計數(shù)1000個含補(bǔ)充的100個數(shù)。即在這個范圍內(nèi)，計數(shù)電路每計數(shù)900個便向千位進(jìn)1。在38000以上時，每計1000含補(bǔ)充的200個，即在38000以上，計數(shù)電路每計數(shù)800個便向千位進(jìn)1，經(jīng)重合校正后的計數(shù)結(jié)果更接近真實值。43第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（3）3次計數(shù)：計數(shù)器在計數(shù)細(xì)胞時，對主要參數(shù)如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及細(xì)胞體積均作3次計數(shù)，若3次計數(shù)結(jié)果的離散度在一定范圍內(nèi)則取3次計數(shù)的平均值報出；若有其中一次計數(shù)與另2次相差偏大，則該次計數(shù)被賦予警報，只報告另兩次計數(shù)的平均值；若3次計數(shù)結(jié)果均相差大，則無結(jié)果報出。（4）延長計數(shù)：當(dāng)所計數(shù)的細(xì)胞少于界定的數(shù)量時，計數(shù)器會自動延長計數(shù)時間，即重復(fù)計數(shù)，以保證相當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計量，減少統(tǒng)計學(xué)誤差，確保報告結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。44第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（5）脈沖編輯：當(dāng)細(xì)胞通過小孔的電阻感應(yīng)區(qū)時，由于所經(jīng)途徑不同，產(chǎn)生的脈沖幅度會有所變化，對體積測量有一定影響，可通過脈沖編輯技術(shù)修正這種影響。（6）高頻道分析：為達(dá)到高分辨和高精度，計數(shù)器在25－450fl范圍內(nèi)，分256個體積段（頻道）分析白細(xì)胞；在36－360fl范圍內(nèi)分256個頻道分析紅細(xì)胞；在2－20fl范圍內(nèi)分64個頻道分析血小板，使細(xì)胞分析達(dá)到最佳效果。新型的計數(shù)器不但計數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、且計數(shù)血小板，為保證計數(shù)準(zhǔn)確，精密，除應(yīng)用上述技術(shù)外還增加了以下的一些技術(shù)：45第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（7）擬合曲線：血小板計數(shù)時，為了排除2fl以下電子噪聲與雜質(zhì)干擾和2fl以上小紅細(xì)胞與其他小細(xì)胞的干擾，計數(shù)器設(shè)定在2—20fl范圍內(nèi)計數(shù)血小板，然后再根據(jù)正常人血小板體積分布符合對數(shù)正態(tài)分布的理論，通過0－70fl的電子擬合曲線將沒有被直接計入的血小板間接計入總數(shù)內(nèi)．以減少血小板計數(shù)時所受的干擾。（8）掃流技術(shù)：血小板和紅細(xì)胞在同一個計數(shù)池計數(shù)，若紅細(xì)胞經(jīng)過小孔后發(fā)生回流，只要稍微觸及小孔感應(yīng)區(qū)，電極就可能感應(yīng)到相當(dāng)于血小板大小的小脈沖，使血小板計數(shù)假性升高。計數(shù)器在小孔后側(cè)安裝一個液流裝置，可隨時將經(jīng)過小孔后的細(xì)胞沖走，消除紅細(xì)胞可能的回流對血小板計數(shù)的影響。46第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（9）血小板延長計數(shù)：細(xì)胞計數(shù)時，當(dāng)血小板濃度小于6.7×1010／L，而紅細(xì)胞濃度大于10×1012／L時，儀器會自動延長計數(shù)時間，以保證達(dá)到一定的血小板統(tǒng)計量，提高計數(shù)準(zhǔn)確度，減少統(tǒng)計學(xué)誤差。4、血紅蛋白測定原理在稀釋血液中加入定量的溶血劑，快速溶解紅細(xì)胞，并將釋放出來的血紅蛋白全部轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的氰化血紅蛋白，后者對540nm波長的光吸收量與血紅蛋白濃度成正比，即血紅蛋白含量愈高，吸光性愈強(qiáng)，通過比色，用光電器件檢測透射光強(qiáng)度，即可得到該樣品血紅蛋白濃度。很多計數(shù)器的光路系統(tǒng)為了防止光散射和外來光干擾，常用雙波長法測量，光路如圖1－10所示47第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四48第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四光源發(fā)出的光經(jīng)透鏡和狹縫到達(dá)流動比色皿上，透過流動比色皿再到達(dá)一個半透半反鏡上分成一束透射光和一束反射光。透射光經(jīng)過690nm濾光片到達(dá)一光電池，被光電池轉(zhuǎn)換為參考信號。另一束反射光經(jīng)過540nm的濾光片到達(dá)另一光電池，被光電池轉(zhuǎn)換為樣品信號。在540nm的吸光度為:A540＝K540·C·L＋A540干擾式中，A540為在540nm時的吸光度，K540為在540nm時的吸光系數(shù)，C為待測物質(zhì)濃度，L為吸收池厚度，49第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四A540干擾為光散射和背景吸光度。同樣，對于690nm的吸光度也有：A690＝K690·C·L＋A690干擾因參比信號和樣品信號是在相同的環(huán)境下獲得的，因此可以把A540干擾和A690干擾視為相等。因此透過比色皿的參考信號和樣品信號的吸光度之差⊿A為：⊿A＝（K690－K540）·C·L即樣品中待測組分的濃度與兩波長的吸光度之差成正比。故在電路中求出參考和樣品兩信號之差，便可以求得相應(yīng)的血紅蛋白濃度，并有效消除和減少了光散射、背景吸收以及混濁樣品等因素對測定的影響。50第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四5、細(xì)胞計數(shù)器的配置5．1試劑系統(tǒng)細(xì)胞計數(shù)器的生產(chǎn)廠家都有配套的試劑系統(tǒng)，包括有稀釋劑、溶血劑、清潔劑、質(zhì)控品、定標(biāo)液等。（1）稀釋劑作用：①稀釋血液并保持細(xì)胞的生物學(xué)特性、完整性和原有體積；②維持小孔導(dǎo)電；③沖洗管道及標(biāo)本流程。51第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（2）溶血劑作用：①快速溶解紅細(xì)胞，使其釋放出血紅蛋白；②將血紅蛋白全部轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的氰化血紅蛋白；③使白細(xì)胞一定程度的皺縮，控制分類。為進(jìn)行正確的白細(xì)胞分類，溶血劑必須與配套的稀釋劑配合使用。以上2種試劑若受震蕩（如將剩余試劑合并一起或試劑在運(yùn)輸后）會激起大量微小氣泡，影響空白計數(shù)結(jié)果，應(yīng)靜置3天以上再使用。（3）清潔劑作用：去除計數(shù)管道中的血液殘余成分。52第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四5．2儀器安裝放置與保養(yǎng)血細(xì)胞計數(shù)器屬精密電子儀器，安裝放置及日常的維護(hù)保養(yǎng)十分重要。（1）安裝放置：安裝時一般有廠家工程師來，注意儀器應(yīng)安裝在近電源、有排水處。安裝時應(yīng)斷開電源，儀器四周留有空間便于維護(hù)和檢修，試劑、廢液桶要置于低于儀器的水平面，以免液體回流到真空管損壞儀器，各種試劑（稀釋劑、溶血劑和清潔劑）及廢液桶與儀器的管道連接無誤，且廢液排放應(yīng)遵守當(dāng)?shù)匾?guī)定。儀器安裝好，應(yīng)用定標(biāo)液校正后方可開展日常工作。儀器在維修或搬動后應(yīng)用質(zhì)控液、定標(biāo)液加以調(diào)校。53第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四（l）放置環(huán)境要求：①室溫15－35℃，濕度10％－90％，避免陽光直射；②由于計數(shù)器為顆粒計數(shù)，故放置環(huán)境應(yīng)十分潔凈，避免灰塵影響計數(shù)及造成電路板短路；③防電磁、噪聲干擾，計數(shù)器應(yīng)遠(yuǎn)離冰箱、離心機(jī)、X線機(jī)、CT機(jī)、磁共振等強(qiáng)磁干擾的儀器；并建議加裝UPS輔助電源，同時要求電源接地線良好，地線電壓小于0.5伏。（2）保養(yǎng)：一般要求專人保養(yǎng)，使用人員上機(jī)前要仔細(xì)閱讀儀器說明書及接受良好的培訓(xùn)，做到對儀器的原理、操作規(guī)程、使用注意事項、54第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四報告的含義、維修保養(yǎng)、及引起實驗誤差的因素有充分了解。嚴(yán)格執(zhí)行儀器的每日、每周、每月保養(yǎng)規(guī)定。計數(shù)細(xì)胞最重要的部件為小孔管，血液中某些物質(zhì)及細(xì)胞碎片常因小孔管不常清洗而附于小孔管壁上，時間長了易發(fā)生堵孔?，F(xiàn)在許多計數(shù)器均設(shè)有“燃燒”電路，啟動后可自行消除小孔上的蛋白質(zhì)，但小孔管還須每日清潔保養(yǎng)?？墒褂煤鞍酌傅那鍧崉┙?，一般每日應(yīng)浸泡0.5h以上，但不超過48h以免損傷管道。長時間（2天以上）停機(jī)應(yīng)在浸泡清潔劑后用稀釋劑沖洗干凈管道，再以稀釋劑浸泡。每周、每月用10％次氨酸鈉溶液浸泡小孔管、沖洗管道。55第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四5．3標(biāo)本采集標(biāo)本的采集可分末梢采血和靜脈采血2種，分別用于半自動及全自動的計數(shù)器。（1）末梢采血：一般先準(zhǔn)備好定量的稀釋劑，采微量手指血于稀釋劑中混勻，稱預(yù)稀釋。采血時用棉球消毒應(yīng)注意棉花纖維不要混入稀釋劑中，以免上機(jī)測試時發(fā)生堵孔。（2）靜脈采血：可用專用抗凝試管或自備試管，前者用于自動進(jìn)樣系統(tǒng)；后者用于手動進(jìn)樣。6、細(xì)胞計數(shù)器的發(fā)展56第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四現(xiàn)代科技一日千里，細(xì)胞計數(shù)器得益于各種新技術(shù)的介入發(fā)展很快，主要表現(xiàn)如下。（1）測試原理的發(fā)展：主要表現(xiàn)在對白細(xì)胞分類的改進(jìn)。細(xì)胞計數(shù)器研制初期，是無細(xì)胞分類的，后來先后出現(xiàn)過二、三分群，都基于電阻法測量細(xì)胞大小這一分類原理，但這不能將嗜酸、嗜堿性細(xì)胞與其他細(xì)胞分開，不能實現(xiàn)5項分類。如中性粒細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞在二維的直方圖上就有許多重疊，必須增加新的方法以資鑒別。增加的新方法主要有激光散射法、高頻電磁波法（又稱射頻法）及細(xì)胞化學(xué)染色計數(shù)等。57第五十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期四激光散射法（lightscatter）：細(xì)胞經(jīng)過激光區(qū)域時，由于不同細(xì)胞其表面特性、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及顆粒均不同，對光的散射各異，從不同角度（如以00,10o和90o）測得散射光強(qiáng)度會因細(xì)胞不同而有差異。射頻法（ratio