細(xì)胞與分子生物學(xué)

ACPDDRT-PCR技術(shù)摘要：隨著基因組計(jì)劃的順利實(shí)施,大量的生物信息被解析,分離和鑒定差異表達(dá)基因已成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR)是目前有效篩選、分離差異表達(dá)基因的方法之一。就DDRT-PCR的基本原理簡(jiǎn)要概述，闡明了該技術(shù)在生物生長(zhǎng)發(fā)育、雜種優(yōu)勢(shì)、抗逆性基因研究中的應(yīng)用等。關(guān)鍵詞:：mRNA差異顯示技術(shù)雜種優(yōu)勢(shì)抗性ACP技術(shù)Abstract:WiththedevelopmentofGenomeProjectandanalysisofmassivebiologicalinformation,separationandidentificationofdifferenceexpressinggenehavebecomeahotissueinmolecularbiologyresearch1ThemRNAdifferentialdisplay(DDRT-PCR)isoneofeffectivemethodsforscreeningandisolatingdifferentiallyexpressedgenes.TheprinciplesofDDRT-PCRtechniquewereintroduced1.Theusabilityandachievedresearchresultsbyusingthismethodweresummarizedfromtheaspectsofricedevelopmentgene,heterosisgeneandtheresistancegene1TheprospectiveapplicationofDDRT-PCRinpaddyricemutantandresistancetoagriculturalchemicalsresearchwasalsoexploredinthepaper.Keywords:mRNAdifferentialdisplayHeterosisResistanceACP許多年以來(lái)，分離差異表達(dá)基因的方法僅限于差異篩選cDNA文庫(kù)，直到1992年Liang等發(fā)明了一種檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄模式的方法，即mRNA差異顯示技術(shù)(mRNADifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR,DDRT-PCR)[1]，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因，差別基因表達(dá)（differentialgeneexpress）是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)[2]。mRNA差別顯示技術(shù)正是對(duì)組織特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。它第一次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)快速靈敏地檢測(cè)到真核細(xì)胞中大部分的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄體的目的[3]。近些年來(lái)，在分離和克隆差異表達(dá)基因的功能基因組學(xué)研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又發(fā)展了多種分析方法，如，代表性差異分析、RNA指紋技術(shù)、RC4D、SAGE、抑制消減雜交技術(shù)、cDNA-AFLP、iAFLP及基因芯片技術(shù)等方法克隆差異表達(dá)基因[4]。這些方法的發(fā)明與應(yīng)用，取得了許多成就，克隆了一系列的差異表達(dá)基因。這些方法各具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有其自身不同的缺陷。這些技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較已有許多綜述總結(jié)。[5]引物退火時(shí)能否與其靶序列特異結(jié)合，是PCR能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素之一，因此引物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化非常重要。退火溫度的高低決定引物是否能與其互補(bǔ)鏈完全結(jié)合，還是有一個(gè)或多個(gè)堿基的錯(cuò)配，因此通過(guò)調(diào)整退火溫度就可以增加引物與模板結(jié)合的特異性[6]。許多研究者提出了各種辦法來(lái)提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環(huán)狀序列，以增加PCR擴(kuò)增的特異性和退火的穩(wěn)定性，但這些方法并不能消除初始反應(yīng)的非特異性退火[7]。作者將介紹一種在DDRT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)差異表達(dá)基因克隆的新方法，即引物退火控制技術(shù)(AnneallingControlPrimer,ACP）。該方法則可較好地消除初始反應(yīng)的非特異性[8]。1ACP技術(shù)的基本原理ACP技術(shù)通過(guò)一種特殊引物，使得特異性和靈敏度同時(shí)兼顧。具體的引物結(jié)構(gòu)是（圖1）:退火控制引物由獨(dú)特的三部分組成，3＇端和5＇端部分由中間的調(diào)節(jié)部分連接。3＇端部分是核心部分，是一段基因特異性結(jié)合段，能與模板完全互補(bǔ)，但長(zhǎng)度較短（10bp）左右，這個(gè)長(zhǎng)度的核酸退火溫度基本在37℃左右，也就是普通隨機(jī)引物的退火溫度；中間調(diào)節(jié)的部分為多聚脫氧次黃苷[poly(dI)]，一般由5個(gè)脫氧次黃苷(dI)組成，在控制引物的退火溫度時(shí)起著關(guān)鍵的作用[9]。ACP技術(shù)主要由以下三個(gè)部分組成：逆轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈和兩個(gè)不同階段的PCR反應(yīng)；5＇端部分是通用引物序列。這三部分的具體作用為：3＇端的核心序列用于第一、第二輪擴(kuò)增時(shí)，保證擴(kuò)增的靈敏度；中間的調(diào)節(jié)部分是ACP技術(shù)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵區(qū)域，作用主要有以下兩方面：①提高核心序列識(shí)別模板時(shí)的退火溫度，這是由于dI可以識(shí)別ATGC任意堿基，這樣就將核心序列的退火溫度提高到50℃左右，②連續(xù)的dI在較低溫度時(shí)，形成一個(gè)泡狀結(jié)構(gòu)，而使通用引物序列卷曲起來(lái)，不參與退火識(shí)別，而在較高溫度時(shí)形成線性分子，而使整條引物打開，參與退火識(shí)別；5＇端的通用調(diào)節(jié)序列是高溫識(shí)別的通用引物區(qū)。2ACP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)2.1假陽(yáng)性低假陽(yáng)性高是目前克隆差異表達(dá)基因的瓶頸問題之一，ACP技術(shù)可使引物在初始反應(yīng)與模板鏈特異結(jié)合，擴(kuò)增出真實(shí)可靠的產(chǎn)物，從而降低了PCR結(jié)果的假陽(yáng)性。[10]2.2不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳只需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳就足以進(jìn)行分析ACP技術(shù)顯著提高了PCR擴(kuò)增的特異性和敏感性，使得PCR產(chǎn)物的特異性大為增強(qiáng)。通過(guò)普通脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)PCR產(chǎn)物，且脂糖凝膠電泳顯示的條帶可以直接用于Northern雜交分析。[11]2.3不需要特別的技術(shù)納AC綁P核是基斧于踢PC斑R戲和普站通瓊好脂糖腿電泳黎的一枝種技島術(shù)，作簡(jiǎn)單返容易翻操作墻。調(diào)2.腎4拴重復(fù)支性高衡由于花AC企P厚采用緩簡(jiǎn)單判容易果的操兼作就桑可得甜到結(jié)劣果，側(cè)避免蹲了繁廣復(fù)步據(jù)驟引您入誤催差的傭機(jī)會(huì)浩，使筆得試蛇驗(yàn)結(jié)捷果的盾可重標(biāo)復(fù)性心大大疏提高隨。借[縣12減]慚2.亦5棗速度指快、你經(jīng)濟(jì)凡實(shí)惠你AC致P訂技術(shù)暴在較運(yùn)短時(shí)古間內(nèi)比就可識(shí)克隆鑒到可礙信的科差異夢(mèng)表達(dá)出基因樣，且遮不需庭要花肥大量很的時(shí)況間來(lái)姑排除侵假陽(yáng)燭性。腎2.副6晨PC凍R沙產(chǎn)物烈分布躁范圍哄廣惑產(chǎn)物渣條帶韻分布棍可為斯15譽(yù)0極bp束～筒2民kb孝，這授樣不線僅增尤加了脹鑒定朱差異老表達(dá)脹基因束的機(jī)諷會(huì)，磨也為域預(yù)測(cè)味基因陸的功懂能提舌供了旬更多提重要梨的序伍列信攔息病，樂足以蠶滿足狹分析毛所需燕。唱[磁13形]徐3裕AC尾P秋DD錘RT塑-P胸CR捏技術(shù)醒的應(yīng)耐用都AC垮P厚技術(shù)屯在差囑異表炊達(dá)基院因克寶隆中網(wǎng)的應(yīng)給用，其目前妙報(bào)道妄的主業(yè)要集收中于時(shí)哺乳裹動(dòng)物石（小哀鼠、悲牛和宅豬等兩）生以殖發(fā)速育相夠關(guān)的醬基因龜?shù)难袇s究隨[請(qǐng)14均]饒，通韻過(guò)該施技術(shù)沿克隆米了許爬多差含異表洽達(dá)基蟻因，廁為深址入了話解哺潑乳動(dòng)奪物早咽期生浙殖發(fā)堡育相根關(guān)的濁分子顛調(diào)控件機(jī)制償提供天了有顆利證懶據(jù)。賽4約、操芝作步放驟槍1歪．總箭RN孩A扎的提闖?。ㄐ┮娬f(shuō)No寇rt隨he神rn呢斯雜交純）翅2畫．第茂一鏈蹈合成達(dá)：終(1景)閑總豐RN恒A孔樣品縣2茫μg幸；械cD貸NA撓合成干引物兔1額μl運(yùn)；加棒dd院H弦2洪O游補(bǔ)至鴉5μ射l厭。將紙管標(biāo)朗號(hào)為雄1A賓,候2地A桶,P竭C碗A屑等。雨P(guān)C獨(dú)為陽(yáng)涌性對(duì)米照。餡(2居)訂混勻禽后稍驗(yàn)離心基。宣(3揮）炒70水℃蔑孵育遺3m豈in諒，冰移浴其2m濤in傻后稍楊離心親。魯(4緩）準(zhǔn)完備耳dN餡TP衫m(xù)會(huì)ix踐(土以毒5限管為懇例櫻)傳每管某蝦典順晌摸吊5日管膚吼5女×嘩第一秀鏈緩灣沖液倚2μ泉l劣拴改漲磨會(huì)雄10加μl感貞d專NT肝Pm準(zhǔn)ix柔（各暑5m他M懂）反恢武撐下漿2μ遙l螞呼騎俊蘭耕艦10文μl闊貸M譯ML開V逆付轉(zhuǎn)錄據(jù)酶（艱20些0u海/μ歐l）慕痕指1貢μl晌權(quán)險(xiǎn)撈之陵艦哥5μ蹄l列總暮芝副5哈μl尤圣透欄探自感2捆5μ篇l駁(5乎）每處管加態(tài)入5盟μl號(hào)，混頂勻后耍稍離控心。辣(6真）壽42壽℃至孵育液1h為。嗚(7定）饑75霞℃談1感0m炎in吸終止務(wù)反應(yīng)賓后置隱冰上界，稍盞離心動(dòng)。令(8測(cè))泊將財(cái)2μ神l襯反應(yīng)程液分住別轉(zhuǎn)霧至新貓管中剛（新屈管標(biāo)漏號(hào)為越1B護(hù),2添B,址PC旋B搶等）折。單(9逆)憤將隊(duì)78桑μl籍d忠d級(jí)H赤2遭O規(guī)分別根加入星B傳管中遞,臣混勻幟。頑(1挨0)定將坦72霜μl松d憤d輝H歷2幸O光分別次加入全A咐管中厚，混覆勻。論(1湊1紫）將均所有盤cD緞NA群稀釋偉液率-2惡0撈℃嘆保存鼠待用頂。排3朽．勢(shì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