藥物毒理學(xué)-長期毒性試驗(yàn)

長期毒性

(chronictoxicity)

/重復(fù)給藥毒性

(repeateddosetoxicity)

北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部毒理學(xué)系姚碧云

Tel：82801531藥物長期毒性試驗(yàn)的必要性

藥物在長期重復(fù)給藥時可產(chǎn)生與急性毒性試驗(yàn)完全不同的毒作用。隨著動物的衰老，有些因素如組織易感性改變、代謝和生理功能的改變，以及自發(fā)性疾病等均可影響毒作用的性質(zhì)和程度。某些重要的疾病例如心臟病、慢性腎衰、腫瘤等均與年齡增長有關(guān)?；靖拍?/p>

長期毒性/重復(fù)給藥毒性(repeateddosetoxicity)：實(shí)驗(yàn)動物反復(fù)多次接觸藥物所引起的毒性反應(yīng)

長期的期限主要取決于藥物臨床擬用的期限，一般

為臨床擬用期限的2～3倍。還應(yīng)有適當(dāng)?shù)幕謴?fù)期?！?/p>

長期毒性試驗(yàn)包含了不同給藥周期的毒性試驗(yàn)，即28

天毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性(1-3個月)、慢性（6-12個月)毒性試驗(yàn)?！镄罘e作用（accumulation)：外源化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化排出體外。當(dāng)其連續(xù)地、反復(fù)地進(jìn)入機(jī)體，而且吸收速度超過代謝轉(zhuǎn)化與排泄速度時化學(xué)物在體內(nèi)的量逐漸增加，稱為化學(xué)物的蓄積作用。如洋地黃、依米丁、溴化物或含汞、砷、鉛中藥等代謝緩慢而毒性較高、物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：實(shí)驗(yàn)動物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠測得機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物效應(yīng)/損傷蓄積(damage/effectaccumulation)

：有的化學(xué)物在長期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。二、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的目的

確定受試藥物長期毒性的效應(yīng)譜。預(yù)測其可能對人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床受試者及使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)研究藥物長期毒性的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其LOAEL和NOAEL，提出受試藥物的安全限量參考值★研究受試藥物長期損害的可逆性確定物種間的毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。長期毒性試驗(yàn)方法TheMethodsofChronicToxicityStudy

實(shí)驗(yàn)動物的選擇和染毒期限

染毒途徑

試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)

觀察指標(biāo)一般選擇兩種實(shí)驗(yàn)動物，一種為嚙齒類動物，另一種為非嚙齒類動物。常用的實(shí)驗(yàn)動物：大鼠、狗、猴一、實(shí)驗(yàn)動物選擇和染毒期限實(shí)驗(yàn)動物的選擇

1-3個月長期毒性試驗(yàn)

年齡：大鼠80~100g（6-8

周齡）

狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：嚙齒類≥20

犬≥6~8性別：雌雄各半

6~12個月長期毒性試驗(yàn)?zāi)挲g：大鼠:初斷乳

50~70g

狗<8月數(shù)量：嚙齒類≥40

犬≥8性別：雌雄各半

如果設(shè)計(jì)要求在染毒受試物期間處死一部分動物，進(jìn)行某些指標(biāo)動態(tài)觀察，則在試驗(yàn)開始時應(yīng)相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動物數(shù)。實(shí)驗(yàn)動物的選擇在藥物臨床前毒性研究中，長期毒性試驗(yàn)與上述的亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的概念不同。長期毒性試驗(yàn)的期限主要取決于藥物臨床擬用的期限，一般為臨床擬用期限的2～3倍。還應(yīng)有適當(dāng)?shù)幕謴?fù)期。臨床用藥時間動物染毒期限最多3次10天1個月未限制2周1個月3個月6個月(嚙齒類)9個月(非嚙齒類)臨床用藥時間重復(fù)給藥試驗(yàn)一次給藥2～4周≤2周2～4周≤1個月1個月≤3個月3個月≤6個月6個月>6個月6個月（嚙齒類）9個月（非嚙齒類）實(shí)驗(yàn)動物染毒期限

中國SFDA

ICH亞慢性毒性試驗(yàn)期限：期限一般為3個月。

慢性毒性試驗(yàn)的期限;取決于試驗(yàn)物的具體要求和所

選動物的物種。工業(yè)毒理學(xué)：6Ｍ食品、環(huán)境毒理學(xué)：12~24M

致癌試驗(yàn)：接近或等于動物的預(yù)期壽命

OECD要求:

慢性毒性試驗(yàn):大鼠染毒期限至少一年。慢性毒性與致癌試驗(yàn)結(jié)合:染毒期限接近/等于動物預(yù)期壽命。實(shí)驗(yàn)動物染毒期限原則：盡量模擬人類接觸受試物的方式(途徑)；并且亞慢

性與慢性毒性試驗(yàn)的染毒途徑應(yīng)當(dāng)一致。常用二、染毒途徑

經(jīng)胃腸道：最好采用經(jīng)飼料或飲水喂飼法，也可以用灌胃方式染毒。

經(jīng)皮膚染毒：去毛部位面積≯動物體表總面積的10%～15%，每次染

毒4～6小時。

注射途徑：常模擬人使用途徑，一般有靜脈、肌肉、皮下注射，對于

嚙齒類，常以腹腔注射作為靜脈的替代途徑

經(jīng)呼吸道：亞慢性：每天吸入4-6小時高劑量組：能引起較為明顯的毒性作用

3個劑量組中劑量組：應(yīng)為LOAEL

低劑量組：應(yīng)相當(dāng)于NOAEL

陰性(溶劑)對照組。

長期毒性試驗(yàn)，為了要得出明確的劑量-反應(yīng)關(guān)系，和確定未觀察到有害作用劑量(NOAEL)，因此至少應(yīng)設(shè)：三、試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)?1-3個月長期毒性的劑量選擇高劑量組急性毒性的閾劑量

1/20～1/5LD50

中劑量組低劑量組陰性對照組組距：3-10倍，最低不小于2倍

>6個月長期毒性的劑量選擇

高劑量組亞慢性毒性的MTD或其1/5~1/2

中劑量組低劑量組陰性對照組組距：2~5倍，最低不小于2倍1．以相同物種的毒性資料作基礎(chǔ)

試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)

劑量選擇的一般步驟★如對劑量選擇沒有把握，則可在該次實(shí)驗(yàn)中多設(shè)幾個劑量組，這比重復(fù)整個試驗(yàn)費(fèi)用低得多。

急性/單劑量毒性試驗(yàn)→劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究→90天毒性試驗(yàn)。急性/單劑量毒性試驗(yàn)→14/28天毒性試驗(yàn)→90天毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)★直接從急性毒性資料來確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量經(jīng)常有困難，可能高估或低估受試物的長期毒性。

劑量范圍研究（Range-findingstudy）劑量范圍研究設(shè)計(jì)——嚙齒類

組別劑量(mg/kg/天，或ppm)動物數(shù)實(shí)驗(yàn)開始結(jié)束時實(shí)驗(yàn)室檢查大體尸解組織病理學(xué)檢查I*最高劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動物雌5/雄5II*高劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動物必要時III*中劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動物必要時IV*低劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動物必要時V0溶劑對照雌5/雄5雌5/雄5全部存活動物雌5/雄5

實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)劑量范圍研究設(shè)計(jì)——非嚙齒類

組別劑量(mg/kg/天，或ppm)動物數(shù)實(shí)驗(yàn)開始

試驗(yàn)前和結(jié)束時實(shí)驗(yàn)室檢查大體尸解組織病理學(xué)檢查I*最高劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動物雌1/雄1II*高劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動物雌1/雄1III*中劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動物雌1/雄1IV*低劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動物雌1/雄1V0溶劑對照雌1/雄1雌1/雄1全部存活動物雌1/雄1給以受試物2周，此為常見的和推薦最低的實(shí)驗(yàn)周期。如要得到更多的信息，實(shí)驗(yàn)周期可為4周。

實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)

如資料來自相同物種，低劑量原則上應(yīng)高于同種動物藥效學(xué)試驗(yàn)或功能學(xué)試驗(yàn)的有效劑量，并不使動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)。如資料來自另一物種,應(yīng)根據(jù)體表面積換算受試物種的藥效學(xué)或功能學(xué)等效劑量，并據(jù)此設(shè)計(jì)低劑量組的劑量水平。2、藥物或保健食品：以動物試驗(yàn)藥效學(xué)或功能學(xué)資料作基礎(chǔ)確定低劑量組水平開始設(shè)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)當(dāng)預(yù)期受試物無明顯毒性時，亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量(不進(jìn)行體重和體表面積換算)設(shè)計(jì)為至少等于人擬用最大劑量的倍數(shù).保健食品:100倍，化學(xué)藥品:30倍，中藥:50倍。

實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)3、對于藥物或保健食品，以預(yù)期臨床治療或人擬用最大劑量的等效劑量作為基礎(chǔ)，低劑量應(yīng)高于此劑量。4、用以上幾種方法進(jìn)行亞慢性和長期毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)，結(jié)果也許會不一致，甚至?xí)嗖钜粋€數(shù)量級，這時就需要根據(jù)以往試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)判斷，或增加劑量組以保證得到良好的劑量反應(yīng)關(guān)系。四、觀察指標(biāo)

1、一般性指標(biāo)動物的外觀(體表通道和毛色等)、社會行為(躁動、冷漠、探究活動；刺激性(好斗)等

體重、飼料消耗及食物利用率.

2、實(shí)驗(yàn)室檢查：

血液學(xué)尿液臨床生化

3、眼科學(xué)檢查

4、血壓和心電圖的測量：通常限于非嚙齒類。

觀察指標(biāo)活體評價（In-lifeevaluation）2．處死后評價（Post-Mortemevaluation）

1、尸體解剖試驗(yàn)結(jié)束，活殺實(shí)驗(yàn)動物。采血進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)室檢查，并系統(tǒng)解剖，測定臟器重量。

臟器系數(shù)(relativeorganweight):某個臟器濕重/體重的比值,*100%

觀察指標(biāo)肉眼可見的損傷或可疑損傷部位都應(yīng)作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。對照組和高劑量組動物以及系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳細(xì)的組織學(xué)檢查，嚙齒類動物36種，非嚙齒類動物39種。在吸入毒性研究中，需檢查整個呼吸道。經(jīng)皮毒性試驗(yàn)應(yīng)選取涂敷受試物部位的皮膚和相鄰部位的皮膚。應(yīng)評價器官組織病理改變的性質(zhì)和發(fā)生率。如果病理組織學(xué)損害程度進(jìn)行半定量評價，將易于判斷損害是否由于受試物誘發(fā)的損害是否隨染毒劑量和時間增加而嚴(yán)重。2、病理學(xué)檢查3.特異性指標(biāo)

觀察指標(biāo)效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志是反映受試物對機(jī)體毒作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)，并常與其毒作用機(jī)制有關(guān)。4.指標(biāo)觀察時間一般指標(biāo)：每天觀察一次

體重、飼料消耗量：每周一次

試驗(yàn)室檢查：

亞慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)結(jié)束時，必要時可在

試驗(yàn)中間進(jìn)行一次

慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)中期活殺少量動物及試

驗(yàn)結(jié)束時，全面檢測各項(xiàng)指標(biāo)

數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析：

DataProcessing

andResultsAssessment

研究資料的匯總計(jì)量資料：按組別（必要時按性別）進(jìn)行匯總并求出每組的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)數(shù)資料：用相對數(shù)（率、比）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，求出每組的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

根據(jù)數(shù)據(jù)類型選用合適的統(tǒng)計(jì)方法，進(jìn)行各劑量組與陰性對照組的比較。是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是否具有生物學(xué)意義是否具有毒理學(xué)意義與對照組比較差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是否的顯著性。該差別是否與受試物相關(guān)，是否是受試物引起的生物學(xué)效應(yīng)該效應(yīng)是否是有害效應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義→生物學(xué)意義→毒理學(xué)意義

判別處理組與對照組間差別有生物學(xué)意義應(yīng)考慮的因素

劑量依賴性趨勢劑量-反應(yīng)關(guān)系是反映效應(yīng)與處理因素相關(guān)最重要的指標(biāo)之一，如果劑量組與對照組結(jié)果之